引用本文： 張杰, 黃湘寧, 劉鑫, 喻華. 不同來源肺炎克雷伯菌株鐵攝取相關基因攜帶情況分析. 中國循證醫學雜志, 2018, 18(3): 276-279. doi: 10.7507/1672-2531.201801039 復制
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一種有莢膜的革蘭陰性菌，該菌是臨床院內感染的重要致病菌，也是引起呼吸道感染、敗血癥和細菌性肝膿腫等感染的常見致病菌。隨著三代頭孢菌素等超廣譜 β-內酰胺類抗生素的廣泛使用，使得耐藥肺炎克雷伯菌不斷出現，給臨床抗感染治療帶來新的困難和挑戰。肺炎克雷伯菌攜帶有多種特異性其致病相關的毒力因子，包括莢膜多糖和粘液等[1, 2]。而鐵作為細胞必須的營養元素，無論對于細菌的生存和感染宿主，或是宿主抗感染都是必不可少的條件[3, 4]。我們前期研究發現，細菌鐵系統 iroB/C/D 可能與肺炎克雷伯菌引起的肝膿腫發生有關[5]。國外研究也發現高毒力肺炎克雷伯菌株較普通肺炎克雷伯菌株能表達更多且更高活性的鐵載體[6]，而鐵載體合成基因亦與該菌的遷徙性感染相關[7]。
本研究采用二代測序技術對兩株不同來源的肺炎克雷伯菌進行全基因組測序及生物信息學分析，深入了解不同來源肺炎克雷伯菌株間鐵攝取和轉運系統基因的差異，并結合 NCBI 基因組信息數據庫對肺炎克雷菌攜帶 iroB/C/D 基因簇情況進行了進一步分析，為了解鐵攝取和轉運系統與肺炎克雷伯菌感染致病的關系提供科學依據。
1 材料和方法
1.1 菌株來源
收集 2 株從四川省人民醫院入院患者外周血分離到的肺炎克雷伯菌株，其中 1 株來自肝膿腫患者血液，另 1 株來自肝衰合并肝硬化患者血液。
1.2 儀器與試劑
儀器包括：Roche 454 基因測序系統、Thermo 1300 系列 A2 型生物安全柜、Eppendorf 5418R 低溫高速離心機；試劑包括：GENEray 細菌基因組 DNA 快速提取試劑盒、OXOID 酵母提取物、OXOID 蛋白胨。
1.3 研究方法
1.3.1 肺炎克雷伯菌基因組 DNA 提取、測序和比對
將 2 株肺炎克雷伯菌振蕩、培養、增菌，并提取細菌全基因組 DNA，具體增菌和基因組 DNA 方法參照已發表的文獻進行[5]。提取后的細菌 DNA，參照 Roche 454 測序系統配套的試劑進行建庫測序，即對基因組 DNA 進行片段化處理，將給 DNA 打斷成 300–800 bp 的片段，再通過一系列分子生物學技術將帶有標簽的接頭序列連接到上述 DNA 片段末端并進行純化。將純化后的 DNA 片段經變性處理形成單鏈 DNA 片段完成樣品的文庫構建。單鏈 DNA 文庫經獨特型磁珠捕獲，形成 PCR 模板，經乳液 PCR 擴增后富集 DNA 擴增產物，最終將攜帶有磁珠的 DNA 擴增產物轉入 PTP 板中進行測序。采用 Newbler2.5 軟件拼接測序后的結果，并通過 NR（non-redundant protein database）數據庫，對基因功能進行注釋。采用 Blast 法對比株肺炎克雷伯菌的測序結果，分析基因差異，重點關注鐵攝取和轉運系統相關基因。
1.3.2 NCBI 數據庫中肺炎克雷伯菌 iroB/C/D 基因攜帶情況比對分析
根據上述測序結果，我們基于基因組學序列分析的方法，首先將目前 NCBI 數據庫中收錄的肺炎克雷伯菌質粒完整測序序列（426 條）下載，并進行本地數據庫構建。再將 iroB/C/D 基因序列作為咨詢序列，與上述構建好的本地數據庫進行比對分析。
2 結果
2.1 2 株不同來源肺炎克雷伯菌株基因組測序結果比對及鐵攝取和轉運系統情況
將 2 個不同來源的肺炎克雷伯菌株的全基因組測序結果進行序列比對，重點分析與細菌鐵攝取和鐵轉運相關基因，結果發現：致肝膿腫肺炎克雷伯菌較肝衰/肝硬化患者血液分離的肺炎克雷伯菌株在基因組中多了 11 組與鐵轉運和攝取相關的基因（簇）（表 1），提示鐵攝取和轉運相關基因可能與肺炎克雷伯菌致肝膿腫有關。
表1
不同來源的肺炎克雷伯菌株的全基因組的序列比對結果
2.2 NCBI 基因組序列數據中 iroB/C/D 基因在肺炎克雷伯菌中的攜帶情況分析
我們前期已經報道 iroB/C/D 基因在我院肝膿腫患者血液分離到肺炎克雷伯菌中攜帶率非常高。我們結合本次測序結果分析 iroB/C/D 在 NCBI 基因組序列數據庫中所記錄的 456 條肺炎克雷伯菌基因組中的攜帶情況。結果發現：分別有 iroB 比對陽性的肺炎克雷伯菌有 7 株 ，iroC 比對陽性的肺炎克雷伯菌有 7 株，iroD 比對陽性的肺炎克雷伯菌有 7 株（圖 1），提示部分肺炎克雷伯菌的質粒中攜帶有 iroB/C/D 基因。在上述比對陽性的菌株記錄中，我們進一步篩選 iroB/C/D 均陽性的肺炎克雷伯菌，發現Kp CG43、Kp K2044、Kp Ecl8、Kp pKCTC2242、Kp RJF293 和 Kp RJF 999 這 6 株菌為肺炎克雷伯菌質粒同時攜帶iroB/C/D 的陽性菌（表 2）。
圖1
基于 NCBI 數據庫中肺炎克雷伯菌質粒上攜帶 iroB/C/D 基因的分析
表2
NCBI 數據庫中肺炎克雷伯菌質粒同時攜帶 iroB/C/D 基因的菌株信息
3 討論
細菌性肝膿腫是一種較常見的感染性疾病，病死率高達 31%，其感染主要自門靜脈系統、膽道疾病、闌尾炎或周圍感染病灶直接蔓延，如腹腔感染時細菌易入侵肝臟[8, 9]。從病原學角度分析，部分細菌性肝膿腫病人的膿液、血培養等標本中，細菌學鑒定結果多為革蘭陰性菌感染，且以高毒力肺炎克雷伯菌感染為主[10, 11]。雖然以往研究已發現莢膜多糖和粘液等多種毒力因子與細菌感染力有關[1, 2, 12, 13]，但其導致細菌性肝膿腫的具體機制仍然尚未被闡明。
鐵的攝取和轉運是維持病原微生物功能和發揮感染能力的重要途徑之一，正如我們課題組和國內外同行所報道的，對于鐵的利用可能是肺炎克雷伯菌致病的關鍵因素[14]，尤其在其導致的細菌性肝膿腫中[15]。本研究通過二代測序技術發現肝膿腫患者血液分離的肺炎克雷伯菌較肝硬化/肝衰患者血液分離的肺炎克雷伯菌在基因組上多了近 11 組與鐵載體和鐵攝取基因（簇），其中如二價鐵轉運體 B 基因和三價鐵轉運基因 ABC 及且底物結合蛋白僅在肝膿腫肺炎克雷伯菌分離株中存在。而生物體生理功能中最終應用的鐵形式主要為三價鐵。我們選取 NCBI 數據庫中已經收錄的肺炎克雷伯菌染色體和質粒序列進行比對后發現，iroB/C/D 存在于肺炎克雷伯菌質粒和染色體中，且與肝臟炎癥損害相關的 Kp 如 NTUH-K2044 株等均存在鐵轉運體調節系統，這也和我們以往發現的結果所一致。因此，我們推測鐵攝取和鐵轉運系統，尤其是 iroB/C/D 可能是肺炎克雷伯菌導致肝膿腫發生的重要致病因子，其作用和機制值得我們進一步去研究和證實。
此外，隨著測序技術的快速發展，新型測序技術不斷涌現，如三代測序、轉錄組測序和單細胞測序等。相比本研究中所采用的二代測序技術，新一代測序技術無論在測序深度和應用范圍都有了長足的進步。通過結合這些新一代測序技術，將有助于獲得肺炎克雷伯菌全基因組精細圖譜及了解不同感染部位和感染階段肺炎克雷伯菌中各種基因的轉錄水平，為深入闡明肺炎克雷伯菌致病機制提供科學依據。
總之，本研究結果顯示鐵攝取和轉運相關基因可能是肺炎克雷伯菌重要的致病因子，與肝膿腫的發生有密切關系。
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一種有莢膜的革蘭陰性菌，該菌是臨床院內感染的重要致病菌，也是引起呼吸道感染、敗血癥和細菌性肝膿腫等感染的常見致病菌。隨著三代頭孢菌素等超廣譜 β-內酰胺類抗生素的廣泛使用，使得耐藥肺炎克雷伯菌不斷出現，給臨床抗感染治療帶來新的困難和挑戰。肺炎克雷伯菌攜帶有多種特異性其致病相關的毒力因子，包括莢膜多糖和粘液等[1, 2]。而鐵作為細胞必須的營養元素，無論對于細菌的生存和感染宿主，或是宿主抗感染都是必不可少的條件[3, 4]。我們前期研究發現，細菌鐵系統 iroB/C/D 可能與肺炎克雷伯菌引起的肝膿腫發生有關[5]。國外研究也發現高毒力肺炎克雷伯菌株較普通肺炎克雷伯菌株能表達更多且更高活性的鐵載體[6]，而鐵載體合成基因亦與該菌的遷徙性感染相關[7]。
本研究采用二代測序技術對兩株不同來源的肺炎克雷伯菌進行全基因組測序及生物信息學分析，深入了解不同來源肺炎克雷伯菌株間鐵攝取和轉運系統基因的差異，并結合 NCBI 基因組信息數據庫對肺炎克雷菌攜帶 iroB/C/D 基因簇情況進行了進一步分析，為了解鐵攝取和轉運系統與肺炎克雷伯菌感染致病的關系提供科學依據。
1 材料和方法
1.1 菌株來源
收集 2 株從四川省人民醫院入院患者外周血分離到的肺炎克雷伯菌株，其中 1 株來自肝膿腫患者血液，另 1 株來自肝衰合并肝硬化患者血液。
1.2 儀器與試劑
儀器包括：Roche 454 基因測序系統、Thermo 1300 系列 A2 型生物安全柜、Eppendorf 5418R 低溫高速離心機；試劑包括：GENEray 細菌基因組 DNA 快速提取試劑盒、OXOID 酵母提取物、OXOID 蛋白胨。
1.3 研究方法
1.3.1 肺炎克雷伯菌基因組 DNA 提取、測序和比對
將 2 株肺炎克雷伯菌振蕩、培養、增菌，并提取細菌全基因組 DNA，具體增菌和基因組 DNA 方法參照已發表的文獻進行[5]。提取后的細菌 DNA，參照 Roche 454 測序系統配套的試劑進行建庫測序，即對基因組 DNA 進行片段化處理，將給 DNA 打斷成 300–800 bp 的片段，再通過一系列分子生物學技術將帶有標簽的接頭序列連接到上述 DNA 片段末端并進行純化。將純化后的 DNA 片段經變性處理形成單鏈 DNA 片段完成樣品的文庫構建。單鏈 DNA 文庫經獨特型磁珠捕獲，形成 PCR 模板，經乳液 PCR 擴增后富集 DNA 擴增產物，最終將攜帶有磁珠的 DNA 擴增產物轉入 PTP 板中進行測序。采用 Newbler2.5 軟件拼接測序后的結果，并通過 NR（non-redundant protein database）數據庫，對基因功能進行注釋。采用 Blast 法對比株肺炎克雷伯菌的測序結果，分析基因差異，重點關注鐵攝取和轉運系統相關基因。
1.3.2 NCBI 數據庫中肺炎克雷伯菌 iroB/C/D 基因攜帶情況比對分析
根據上述測序結果，我們基于基因組學序列分析的方法，首先將目前 NCBI 數據庫中收錄的肺炎克雷伯菌質粒完整測序序列（426 條）下載，并進行本地數據庫構建。再將 iroB/C/D 基因序列作為咨詢序列，與上述構建好的本地數據庫進行比對分析。
2 結果
2.1 2 株不同來源肺炎克雷伯菌株基因組測序結果比對及鐵攝取和轉運系統情況
將 2 個不同來源的肺炎克雷伯菌株的全基因組測序結果進行序列比對，重點分析與細菌鐵攝取和鐵轉運相關基因，結果發現：致肝膿腫肺炎克雷伯菌較肝衰/肝硬化患者血液分離的肺炎克雷伯菌株在基因組中多了 11 組與鐵轉運和攝取相關的基因（簇）（表 1），提示鐵攝取和轉運相關基因可能與肺炎克雷伯菌致肝膿腫有關。
表1
不同來源的肺炎克雷伯菌株的全基因組的序列比對結果
2.2 NCBI 基因組序列數據中 iroB/C/D 基因在肺炎克雷伯菌中的攜帶情況分析
我們前期已經報道 iroB/C/D 基因在我院肝膿腫患者血液分離到肺炎克雷伯菌中攜帶率非常高。我們結合本次測序結果分析 iroB/C/D 在 NCBI 基因組序列數據庫中所記錄的 456 條肺炎克雷伯菌基因組中的攜帶情況。結果發現：分別有 iroB 比對陽性的肺炎克雷伯菌有 7 株 ，iroC 比對陽性的肺炎克雷伯菌有 7 株，iroD 比對陽性的肺炎克雷伯菌有 7 株（圖 1），提示部分肺炎克雷伯菌的質粒中攜帶有 iroB/C/D 基因。在上述比對陽性的菌株記錄中，我們進一步篩選 iroB/C/D 均陽性的肺炎克雷伯菌，發現Kp CG43、Kp K2044、Kp Ecl8、Kp pKCTC2242、Kp RJF293 和 Kp RJF 999 這 6 株菌為肺炎克雷伯菌質粒同時攜帶iroB/C/D 的陽性菌（表 2）。
圖1
基于 NCBI 數據庫中肺炎克雷伯菌質粒上攜帶 iroB/C/D 基因的分析
表2
NCBI 數據庫中肺炎克雷伯菌質粒同時攜帶 iroB/C/D 基因的菌株信息
3 討論
細菌性肝膿腫是一種較常見的感染性疾病，病死率高達 31%，其感染主要自門靜脈系統、膽道疾病、闌尾炎或周圍感染病灶直接蔓延，如腹腔感染時細菌易入侵肝臟[8, 9]。從病原學角度分析，部分細菌性肝膿腫病人的膿液、血培養等標本中，細菌學鑒定結果多為革蘭陰性菌感染，且以高毒力肺炎克雷伯菌感染為主[10, 11]。雖然以往研究已發現莢膜多糖和粘液等多種毒力因子與細菌感染力有關[1, 2, 12, 13]，但其導致細菌性肝膿腫的具體機制仍然尚未被闡明。
鐵的攝取和轉運是維持病原微生物功能和發揮感染能力的重要途徑之一，正如我們課題組和國內外同行所報道的，對于鐵的利用可能是肺炎克雷伯菌致病的關鍵因素[14]，尤其在其導致的細菌性肝膿腫中[15]。本研究通過二代測序技術發現肝膿腫患者血液分離的肺炎克雷伯菌較肝硬化/肝衰患者血液分離的肺炎克雷伯菌在基因組上多了近 11 組與鐵載體和鐵攝取基因（簇），其中如二價鐵轉運體 B 基因和三價鐵轉運基因 ABC 及且底物結合蛋白僅在肝膿腫肺炎克雷伯菌分離株中存在。而生物體生理功能中最終應用的鐵形式主要為三價鐵。我們選取 NCBI 數據庫中已經收錄的肺炎克雷伯菌染色體和質粒序列進行比對后發現，iroB/C/D 存在于肺炎克雷伯菌質粒和染色體中，且與肝臟炎癥損害相關的 Kp 如 NTUH-K2044 株等均存在鐵轉運體調節系統，這也和我們以往發現的結果所一致。因此，我們推測鐵攝取和鐵轉運系統，尤其是 iroB/C/D 可能是肺炎克雷伯菌導致肝膿腫發生的重要致病因子，其作用和機制值得我們進一步去研究和證實。
此外，隨著測序技術的快速發展，新型測序技術不斷涌現，如三代測序、轉錄組測序和單細胞測序等。相比本研究中所采用的二代測序技術，新一代測序技術無論在測序深度和應用范圍都有了長足的進步。通過結合這些新一代測序技術，將有助于獲得肺炎克雷伯菌全基因組精細圖譜及了解不同感染部位和感染階段肺炎克雷伯菌中各種基因的轉錄水平，為深入闡明肺炎克雷伯菌致病機制提供科學依據。
總之，本研究結果顯示鐵攝取和轉運相關基因可能是肺炎克雷伯菌重要的致病因子，與肝膿腫的發生有密切關系。
