引用本文： 張杰, 喻華. 四川省人民醫院肝膿腫患者血培養分離肺炎克雷伯桿菌鐵系統基因攜帶情況的分析. 中國循證醫學雜志, 2017, 17(8): 907-909. doi: 10.7507/1672-2531.201708029 復制
肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumonia，Kp）是臨床上較常見的有莢膜革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科克雷伯桿菌屬。該菌也是重癥監護病房（ICU）內醫院感染的重要致病菌，多寄生于皮膚、鼻咽部、膽道和腸道等處，可導致皮膚感染、呼吸道感染、腹腔感染、泌尿系統感染，乃至全身膿毒血癥等。從病原學角度來看，根據 Kp 莢膜抗原（K 抗原）與致病性，分為 77 多種莢膜血清型，其中 K1、K2、K3、K4 和 K5 型 Kp 的毒力最強[1]，而莢膜血清型 K1 或 K2 是導致肝膿腫的主要 Kp 類型。
鐵元素作為人體中必須的營養元素，參與了細胞內多種關鍵的生理生化過程。多數嗜鐵病原菌感染宿主過程中，在感染部位，宿主生理系統往往會通過增強宿主細胞對胞外鐵的吸收，限制細菌對外界鐵的攝取，從而抑制細菌在感染部位的繁殖[2, 3]。因此，病原菌中的鐵攝取和轉運系統是其與宿主競爭獲取外界鐵源，促進感染的重要途徑。iroB/C/D 基因簇是大腸桿菌和沙門菌中一類調控細菌鐵攝取的鐵載體基因[4-6]。本研究通過分析 10 株分離自四川省人民醫院肝膿腫患者血培養的肺炎克雷伯桿菌攜帶 iroB/C/D 基因的情況，了解 iroB/C/D 基因及其調控的細菌鐵攝取在肺炎克雷伯桿菌感染致病中的臨床意義。
1 材料與方法
1.1 菌株
自 2015 年 1 月到 12 月，四川省人民醫院檢驗科共收集了 10 株來源于肝膿腫患者血培養的肺炎克雷伯桿菌并進行實驗室保存。
1.2 儀器與試劑
本研究使用的儀器有 BioRad S1000 PCR 熱循環儀、BioRadChemi Doc MP 凝膠成像系統、Thermo 1300 系列 A2 型生物安全柜、Eppendorf 5418R 低溫高速離心機。使用的試劑有 GENEray 細菌基因組 DNA 快速提取試劑盒、OXOID 酵母提取物、OXOID 蛋白胨和 Vazyme 2×Phanta Max Master Mix。
1.3 實驗方法
1.3.1 肺炎克雷伯桿菌基因組 DNA 提取 將 10 株不同來源的肺炎克雷伯桿菌分別接種在 1 mL LB 液體培養基，37℃ 振蕩培養 6 h 后，8 000 rpm，離心 1 min 集菌。棄上清，沉淀中加入 150 μL TE（pH 8.0）懸浮細菌后，按照 GENEray 細菌基因組 DNA 快速提取試劑盒操作說明進行細菌基因組 DNA 提取。
1.3.2 iroB/C/D 基因的 PCR 擴增及產物鑒定 根據 GenBank 中公布的序列，分別設計針對 iroB、iroC 和 iroD 基因的 6 對特異性引物（表 1）。iroB、iroC 和 iroD 基因的 PCR 擴增產物片段大小分別為：534 bp、929 bp 和 817 bp。PCR 引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR 擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
表1
iroB、iroC 和 iroD 基因 PCR 特異性引物列表
1.4 統計分析
采用 Excel 2007 軟件對數據進行統計分析。
2 結果
2.1 肺炎克雷伯桿菌株來源情況
納入的 10 株肺炎克雷伯桿菌均來源于臨床確診的肝膿腫患者。其中，8 例患者同時合并了 2 型糖尿病。
2.2 iroB/C/D 基因的 PCR 檢測結果
10 株肺炎克雷伯桿菌株經 PCR 擴增后，產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果在 534bp、929bp 和 817bp 左右位置出現目的條帶，菌株 PCR 產物電泳結果見圖 1、圖 2 和圖 3。攜帶 iroB 的菌株共 9 株、iroC 的菌株共 10 株、iroD 的菌株共 10 株。其中 iroB/C/D 均為陽性的菌株共 9 株，占 90%。
圖1
肺炎克雷伯菌株中 iroB 基因的 PCR 產物電泳結果
圖2
肺炎克雷伯菌株中 iroC 基因的 PCR 產物電泳結果
圖3
肺炎克雷伯菌株中 iroD 基因的 PCR 產物電泳結果
3 討論
鐵載體與多種致病菌的致病力密切相關，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和耶爾森氏菌等[2, 3]。銅綠假單胞菌的血紅素轉運系統是由一類鐵誘導的啟動子的 phuR 基因編碼位于細菌膜表面的血紅素受體，phuT 編碼細胞周質間隙血紅素轉運蛋白，phuUVW 編碼細菌細胞膜相關 ABC 轉運體，phuS 編碼細菌胞質中的血紅素結合蛋白。而對大腸埃希菌，尤其是致病大腸埃希菌而言，其擁有多條鐵攝取系統，嗜鐵素介導的鐵轉運系統是目前大腸埃希菌和沙門菌中最主要且與致病相關的鐵轉運系統[7, 8]。
目前對于肺炎克雷伯桿菌的鐵攝取和轉運與其致病性關系還尚未完全被闡明[9-12]。一般而言，肺炎克雷伯桿菌有專門負責二價鐵轉運的基因，如 froB，sitA 等；有負責三價鐵相關轉運的基因 kfu；有細胞外膜亞鐵血紅素受體基因 hmuR；鐵色素相關基因 fhuA；鐵載體氣桿菌素基因 aerobactin；腸桿菌素基因 entB 等[3, 7, 8]。iroB/C/D 基因攜帶多見于大腸桿菌和腸炎沙門菌中，如腸炎沙門菌的 iroA 基因位置中存在 iroN 和 iroBCDE 2 個相向操縱子，iroBCDEN 基因簇會顯著加強菌株的鐵攝取能力[13]。我們發現，在分離到的 10 株來源于肝膿腫的肺炎克雷伯桿菌中，iroB/C/D 陽性菌株高達 90%，與課題組同期研究的來源于其他部分的肺炎克雷伯桿菌的比例明顯增高，這提示 iroB/C/D 陽性菌株可能與肝膿腫發生有關。
肝臟是人體內鐵貯存和代謝的重要器官之一，肝臟鐵含量與血漿鐵含量的平衡是正常肝臟功能的重要指標之一[14, 15]。在細菌與宿主相互作用的過程中，細菌通過提高自身對外界鐵源的獲取加速自身的生長，而鐵源不僅是細菌生長所需，宿主細胞的正常生理也離不開外界鐵的獲取。iroB/C/D 陽性肺炎克雷伯桿菌株是否利用肝臟中豐富的鐵源，增強細菌自身的致病力，從而與肝膿腫的發生有關，值得我們進一步去研究和證實。
總之，本研究發現肝膿腫患者中肺炎克雷伯桿菌株 iroB/C/D 陽性率更高，其具體致病機制值得進一步研究。
肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumonia，Kp）是臨床上較常見的有莢膜革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科克雷伯桿菌屬。該菌也是重癥監護病房（ICU）內醫院感染的重要致病菌，多寄生于皮膚、鼻咽部、膽道和腸道等處，可導致皮膚感染、呼吸道感染、腹腔感染、泌尿系統感染，乃至全身膿毒血癥等。從病原學角度來看，根據 Kp 莢膜抗原（K 抗原）與致病性，分為 77 多種莢膜血清型，其中 K1、K2、K3、K4 和 K5 型 Kp 的毒力最強[1]，而莢膜血清型 K1 或 K2 是導致肝膿腫的主要 Kp 類型。
鐵元素作為人體中必須的營養元素，參與了細胞內多種關鍵的生理生化過程。多數嗜鐵病原菌感染宿主過程中，在感染部位，宿主生理系統往往會通過增強宿主細胞對胞外鐵的吸收，限制細菌對外界鐵的攝取，從而抑制細菌在感染部位的繁殖[2, 3]。因此，病原菌中的鐵攝取和轉運系統是其與宿主競爭獲取外界鐵源，促進感染的重要途徑。iroB/C/D 基因簇是大腸桿菌和沙門菌中一類調控細菌鐵攝取的鐵載體基因[4-6]。本研究通過分析 10 株分離自四川省人民醫院肝膿腫患者血培養的肺炎克雷伯桿菌攜帶 iroB/C/D 基因的情況，了解 iroB/C/D 基因及其調控的細菌鐵攝取在肺炎克雷伯桿菌感染致病中的臨床意義。
1 材料與方法
1.1 菌株
自 2015 年 1 月到 12 月，四川省人民醫院檢驗科共收集了 10 株來源于肝膿腫患者血培養的肺炎克雷伯桿菌并進行實驗室保存。
1.2 儀器與試劑
本研究使用的儀器有 BioRad S1000 PCR 熱循環儀、BioRadChemi Doc MP 凝膠成像系統、Thermo 1300 系列 A2 型生物安全柜、Eppendorf 5418R 低溫高速離心機。使用的試劑有 GENEray 細菌基因組 DNA 快速提取試劑盒、OXOID 酵母提取物、OXOID 蛋白胨和 Vazyme 2×Phanta Max Master Mix。
1.3 實驗方法
1.3.1 肺炎克雷伯桿菌基因組 DNA 提取 將 10 株不同來源的肺炎克雷伯桿菌分別接種在 1 mL LB 液體培養基，37℃ 振蕩培養 6 h 后，8 000 rpm，離心 1 min 集菌。棄上清，沉淀中加入 150 μL TE（pH 8.0）懸浮細菌后，按照 GENEray 細菌基因組 DNA 快速提取試劑盒操作說明進行細菌基因組 DNA 提取。
1.3.2 iroB/C/D 基因的 PCR 擴增及產物鑒定 根據 GenBank 中公布的序列，分別設計針對 iroB、iroC 和 iroD 基因的 6 對特異性引物（表 1）。iroB、iroC 和 iroD 基因的 PCR 擴增產物片段大小分別為：534 bp、929 bp 和 817 bp。PCR 引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR 擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
表1
iroB、iroC 和 iroD 基因 PCR 特異性引物列表
1.4 統計分析
采用 Excel 2007 軟件對數據進行統計分析。
2 結果
2.1 肺炎克雷伯桿菌株來源情況
納入的 10 株肺炎克雷伯桿菌均來源于臨床確診的肝膿腫患者。其中，8 例患者同時合并了 2 型糖尿病。
2.2 iroB/C/D 基因的 PCR 檢測結果
10 株肺炎克雷伯桿菌株經 PCR 擴增后，產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果在 534bp、929bp 和 817bp 左右位置出現目的條帶，菌株 PCR 產物電泳結果見圖 1、圖 2 和圖 3。攜帶 iroB 的菌株共 9 株、iroC 的菌株共 10 株、iroD 的菌株共 10 株。其中 iroB/C/D 均為陽性的菌株共 9 株，占 90%。
圖1
肺炎克雷伯菌株中 iroB 基因的 PCR 產物電泳結果
圖2
肺炎克雷伯菌株中 iroC 基因的 PCR 產物電泳結果
圖3
肺炎克雷伯菌株中 iroD 基因的 PCR 產物電泳結果
3 討論
鐵載體與多種致病菌的致病力密切相關，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和耶爾森氏菌等[2, 3]。銅綠假單胞菌的血紅素轉運系統是由一類鐵誘導的啟動子的 phuR 基因編碼位于細菌膜表面的血紅素受體，phuT 編碼細胞周質間隙血紅素轉運蛋白，phuUVW 編碼細菌細胞膜相關 ABC 轉運體，phuS 編碼細菌胞質中的血紅素結合蛋白。而對大腸埃希菌，尤其是致病大腸埃希菌而言，其擁有多條鐵攝取系統，嗜鐵素介導的鐵轉運系統是目前大腸埃希菌和沙門菌中最主要且與致病相關的鐵轉運系統[7, 8]。
目前對于肺炎克雷伯桿菌的鐵攝取和轉運與其致病性關系還尚未完全被闡明[9-12]。一般而言，肺炎克雷伯桿菌有專門負責二價鐵轉運的基因，如 froB，sitA 等；有負責三價鐵相關轉運的基因 kfu；有細胞外膜亞鐵血紅素受體基因 hmuR；鐵色素相關基因 fhuA；鐵載體氣桿菌素基因 aerobactin；腸桿菌素基因 entB 等[3, 7, 8]。iroB/C/D 基因攜帶多見于大腸桿菌和腸炎沙門菌中，如腸炎沙門菌的 iroA 基因位置中存在 iroN 和 iroBCDE 2 個相向操縱子，iroBCDEN 基因簇會顯著加強菌株的鐵攝取能力[13]。我們發現，在分離到的 10 株來源于肝膿腫的肺炎克雷伯桿菌中，iroB/C/D 陽性菌株高達 90%，與課題組同期研究的來源于其他部分的肺炎克雷伯桿菌的比例明顯增高，這提示 iroB/C/D 陽性菌株可能與肝膿腫發生有關。
肝臟是人體內鐵貯存和代謝的重要器官之一，肝臟鐵含量與血漿鐵含量的平衡是正常肝臟功能的重要指標之一[14, 15]。在細菌與宿主相互作用的過程中，細菌通過提高自身對外界鐵源的獲取加速自身的生長，而鐵源不僅是細菌生長所需，宿主細胞的正常生理也離不開外界鐵的獲取。iroB/C/D 陽性肺炎克雷伯桿菌株是否利用肝臟中豐富的鐵源，增強細菌自身的致病力，從而與肝膿腫的發生有關，值得我們進一步去研究和證實。
總之，本研究發現肝膿腫患者中肺炎克雷伯桿菌株 iroB/C/D 陽性率更高，其具體致病機制值得進一步研究。
