引用本文： 楊煉, 陸小軍, 葉遠馨, 周易, 王雪梅, 應斌武. 四川大學華西醫院 8 944 例健康體檢女性 HPV 感染情況分析. 中國循證醫學雜志, 2017, 17(6): 634-639. doi: 10.7507/1672-2531.201611038 復制
人乳頭瘤病毒（HPV）是一組特異性感染人類黏膜及皮膚上皮的小型雙鏈環狀 DNA 病毒。目前已鑒定的 HPV 型別超過了 100 多種，其中>40 種可引起肛門生殖道區域及泌尿系統感染；大多數 HPV 感染是無癥狀或亞臨床感染，以無癥狀感染最為常見。HPV 根據感染后致癌性可分為低危型和高危型兩類。低危型 HPV（如 HPV6 和 11）感染為非致癌性，與增生性病變相關，是生殖器疣和復發性呼吸道乳頭瘤的病因。而大量流行病學及病原學研究發現，目前有 10 余種高危型 HPV（如 HPV16、18、52 和 58 等）在 96.6% 的侵襲性宮頸癌的發展中起到了關鍵的作用[1]。因此，HPV 基因檢測對于宮頸癌及癌前病變的篩查和診斷具有重要意義。
宮頸疾病對于中國女性來說是一個重要的公共衛生問題。本研究通過對健康體檢女性宮頸脫落細胞進行 HPV 基因分型檢測，探討 HPV 感染情況、基因型分布及其相關因素，以期為 HPV 疫苗篩選和宮頸癌防治提供理論依據。
1 對象與方法
1.1 研究對象
納入 2016 年 1 月 1 日至 2016 年 9 月 30 日在四川大學華西醫院健康檢查中心接受 HPV 檢測的 8 944 例體檢女性，且剔除二次復查數據。
1.2 儀器與試劑
采用儀器為 Eppendorf Mastercylcer Gradient 基因擴增儀和 Luminex 200 多功能流式點陣儀（配套使用透景 HPV 專用分析軟件）。試劑為上海透景人乳頭狀瘤病毒核酸分型檢測試劑盒（流式熒光雜交法，貨號：LG01002H1；讀數模板編碼：LG010021C；批號：16A001）。
1.3 實驗方法
1.3.1 樣本采集和處理 在非月經期取樣，取樣前 72 h 避免性生活，且未用藥物沖洗陰道或使用陰道內藥物。醫護人員以擴陰器暴露宮頸口，先用棉拭子擦去宮頸口的分泌物，將專用宮頸刷伸入宮頸口處，緊貼宮頸口黏膜順時針輕柔轉動 4～5 周，慢慢抽出宮頸刷，將其放入裝有細胞保存液的洗脫管，在管口除沿刷柄折痕將宮頸刷折斷，宮頸刷頭留在洗脫管中，旋緊管蓋，直立放置常溫或 4℃ 保存，72 h 以內完成檢測。
1.3.2 樣本 DNA 提取 輕微振蕩懸浮保存液中的脫落細胞，取 200 μL樣本保存液于 1.5 mL 離心管中，12 000 r/min 離心 5 min，棄上清。加入搖勻的核酸提取劑 200 μL，振蕩混勻，放入 100℃ 金屬浴 15 min 后，12 000 r/min 離心 5 min，保留上清以備檢測。
1.3.3 PCR 擴增 按比例（預混液 10 μL/人份+引物混合液 5 μL/人份+聚合酶 0.8 μL/人份）充分混勻制成 PCR 反應試劑，瞬時離心，按 15 μL/孔加入 PCR 反應板反應孔中，再取上清樣本 DNA 模板、30 和 70 號陽性質控、90 號陰性質控 5 μL 加入相應反應孔，混勻瞬離后放入 PCR 儀進行擴增。擴增條件：95℃ 5 min，1 個循環；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，5 個循環；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環；72℃ 3 min。
1.3.4 熒光素微球雜交 在反應板雜交孔中分別加入微球雜交液 22 μL 和樣本 PCR 擴增產物 3 μL 混勻，封板后放入 PCR 儀中運行雜交。95℃ 變性 5 min；48℃ 雜交 30 min；每孔快速加入熒光標記的鏈霉親和素-藻紅蛋白 75 μL，重新用封口膜封住反應板，繼續 48℃ 孵育 15 min。
1.3.5 上機檢測 將孵育好的雜交板快速轉移至預熱好的 Luminex 200 多功能流式點陣儀上進行檢測和結果分析，具體操作流程和結果判讀嚴格按試劑、儀器說明書進行。本研究檢測 27 種 HPV 基因型，包括 17 種高危型（HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV82）和 10 種低危型（HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV55、HPV61、HPV81、HPV83）。
1.4 統計分析
采用 Excel 2007 錄入數據，SPSS 17.0 進行統計分析，計算 HPV 的總體和特定類型的感染率。同時，統計單一和多重感染的所有基因型，并分別按年齡（20～25 歲、26～30 歲、31～35 歲、36～40 歲、41～45 歲、46～50 歲、51～55 歲、56～60 歲、61～65 歲及 66 歲及以上）統計分析。
2 結果
2.1 健康體檢女性 HPV 感染的一般情況
共納入 8 944 例健康體檢女性，年齡為 20 歲～85 歲，平均年齡 43.8±10.3 歲。其中共檢出 HPV 感染 1 291 例（平均年齡 44.5±10.4 歲），感染率為 14.4%（1 291/8 944）。高風險 HPV（hrHPV）感染率為 10.5%（939/8 944），低風險 HPV（lrHPV）感染率為 5.5%（490/8 944）。1 291 例 HPV 感染者中，單一感染為 1 025 例占 79.4%（1 025/1 291）；多重感染有 266 例占 HPV 感染者的 20.6%（266/1 291）（表 1）。
表1
8 944 例健康體檢女性 HPV 感染情況分布（例）
2.2 HPV 基因型分布
在 1 025 例單一感染者中，hrHPV 占 68.2%（699/1 025）。四種最常見的 hrHPV 是 HPV52、53、16 和 58，感染率分別為 1.69%（151/8 944）、1.13%（101/8 944）、0.83%（74/8944）和 0.81%（72/8 944）。此外，lrHPV 中 HPV61、81、55、43 和 44 的感染率也較高，分別為 0.7%（62/8 944）、0.6%（56/8 944）、0.6%（50/8 944）、0.6%（49/8 944）和 0.5%（46/8 944）（表 2）。
表2
單一感染的 HPV 基因型分布情況（例）
在 266 例 HPV 多重感染者中，雙重感染占 71.1%（205/266），三重感染占 15.0%（40/266），四重感染占 5.6%（15/266），五重感染占 2.3%（6/266）。四種最常見的 hrHPV 類型分別為 HPV52、53、58 和 16，感染率分別為 0.8%（67/8 944）、0.6%（49/8 944）、0.5%（40/8 944）和 0.4%（39/8 944）。此外，lrHPV 中 HPV81、43、61、44 和 55 的感染率較高，分別為 0.4%（38/8 944）、0.4%（37/8 944）、0.4%（36/8 944）、0.4%（35/8 944）和 0.3%（26/8 944）（表 3）。
表3
多重感染的 HPV 基因型分布情況（例）
2.3 HPV 感染在不同年齡段中的分布
20～25 歲和 66 歲及以上年齡段在單一及多重感染中的感染率均較其他年齡段高。單一感染在 41～45 歲和 51～55 歲組也較高（圖 1）。單一感染中感染率最高的 HPV52 在 31～35 歲和 61～65 歲年齡段較高（圖 2）。多重感染中，20～25 歲年齡段的 HPV52 和 HPV16 感染率較其他年齡段高（圖 3）。
圖1
HPV 單一和多重感染率在各年齡段的分布情況
圖2
單一感染中 4 種常見 HPV 感染率在各年齡段分布情況
圖3
多重感染中 4 種常見 HPV 感染率在各年齡段分布情況
3 討論
不同人群中 HPV 類型的分布具有差異較大。基于 WHO 數據，宮頸癌患者中 4 個最常見的 hrHPV 類型是 HPV16、18、33 和 45，而正常女性中最常見的類型是 HPV16、18、31 和 58[2]。在中國，宮頸癌患者中4個最常見的 hrHPV 類型分別是 HPV16、18、58 和 33；而在正常女性人群中最常見的類型為 HPV16、52、18 和 51[2]。本研究顯示我院健康體檢女性以 hrHPV 感染為主，最常見的基因型是 HPV52、53、16 和 58，這與趙麗等[6]的研究結果基本一致，但與馮余寬等[7]的研究結果不同，這可能與納入人群的差異有關。
當前美國已有 3 種 HPV 疫苗注冊，分別是二價疫苗（HPV16 和 18）、四價疫苗（HPV6、11、16 和 18）和九價疫苗（HPV6、11、16、18、31、33、45、52 和 58）。接種二價或四價疫苗能明顯有效降低宮頸癌的風險[8]。中國國家食品藥品監督管理局于 2016 年 7 月 12 日批準了 HPV16 和 18 型二價疫苗的進口注冊申請。但宮頸癌并不只 HPV16/18 有關，還有 10%～20% 與其他 HPV 類型有關，如 HPV31、45、52 和 58[1]。本研究結果顯示體檢者 HPV 感染最常見為 HPV52、53、16 和 58，這非現有的二價和四價疫苗所能涵蓋。雖然有研究提示 HPV 疫苗對 HPV 類型有交叉保護性[9, 10]，但由于 HPV 誘導產生的中和抗體具有型別特異性，交叉保護率可能較低[11]。此外，由于 HPV 的病毒自限性及宿主機體的免疫清除作用，HPV 篩查陽性并不能提示其一定患宮頸癌。即使篩查陰性，也有可能存在感染，發生不良結局。此外 2015 年，美國疾病控制中心性傳播疾病的診斷和治療指南也建議對已接種 HPV 疫苗的≥21 歲女性仍需繼續進行常規宮頸癌的篩查[12]。
疫苗接種前 HPV 分型檢測對評價疫苗具有重要價值，也可為研制新型疫苗提供依據[13]。對不同類型 HPV 疫苗進行成本效益分析，HPV 感染分布、疫苗對未覆蓋亞型的有效性、防治技術的有效性和特異性、篩查和疫苗接種的覆蓋率等因素均會影響其成本效益[14-17]。雖然國外已有不少研究評價了 HPV 疫苗的成本效益，但中國的研究較少，本研究的結果可在一定程度上為成本效益分析提供研究基礎。
本研究結果顯示，20～25 歲和 66 歲及以上體檢者在單一及多重感染中的感染率均較高，這與 Wang 等[18]研究結果類似。年輕女性生殖道相對免疫保護系統尚不夠成熟，抗感染能力弱，宮頸鱗狀上皮細胞較敏感，易受 HPV 感染[19]。而隨著年齡的增長，機體免疫能力逐漸降低，HPV 感染風險增高。41～45 歲和 51～55 歲年齡段在單一感染中也較高，這可能與圍絕經期激素波動引起生理及免疫失調有關。因此，建議不同年齡段的女性均有必要進行 HPV 分型檢測。
本研究中，HPV 感染陽性婦女中多重感染所占比例為 20.6%，低于上海（36.6%）、北京（27.7%）和山西（24.3%），但略高于河南（19.8%）、云南（18.0%）、湖南（17.7%）、新疆（15.5%）[3, 5, 21]。這體現了一定的地區特異性。
本研究的局限性：本研究僅納入四川大學華西醫院的健康體檢者，也未收集體檢者的細胞學數據，將來應開展基于總體人群的研究，探討 HPV 分型的關系。
總之，基于本院健康體檢者 HPV 感染情況，建議將 HPV52、53 和 58 納入到 HPV 疫苗篩選評估中，為 HPV 感染及宮頸癌預防提供理論依據。
人乳頭瘤病毒（HPV）是一組特異性感染人類黏膜及皮膚上皮的小型雙鏈環狀 DNA 病毒。目前已鑒定的 HPV 型別超過了 100 多種，其中>40 種可引起肛門生殖道區域及泌尿系統感染；大多數 HPV 感染是無癥狀或亞臨床感染，以無癥狀感染最為常見。HPV 根據感染后致癌性可分為低危型和高危型兩類。低危型 HPV（如 HPV6 和 11）感染為非致癌性，與增生性病變相關，是生殖器疣和復發性呼吸道乳頭瘤的病因。而大量流行病學及病原學研究發現，目前有 10 余種高危型 HPV（如 HPV16、18、52 和 58 等）在 96.6% 的侵襲性宮頸癌的發展中起到了關鍵的作用[1]。因此，HPV 基因檢測對于宮頸癌及癌前病變的篩查和診斷具有重要意義。
宮頸疾病對于中國女性來說是一個重要的公共衛生問題。本研究通過對健康體檢女性宮頸脫落細胞進行 HPV 基因分型檢測，探討 HPV 感染情況、基因型分布及其相關因素，以期為 HPV 疫苗篩選和宮頸癌防治提供理論依據。
1 對象與方法
1.1 研究對象
納入 2016 年 1 月 1 日至 2016 年 9 月 30 日在四川大學華西醫院健康檢查中心接受 HPV 檢測的 8 944 例體檢女性，且剔除二次復查數據。
1.2 儀器與試劑
采用儀器為 Eppendorf Mastercylcer Gradient 基因擴增儀和 Luminex 200 多功能流式點陣儀（配套使用透景 HPV 專用分析軟件）。試劑為上海透景人乳頭狀瘤病毒核酸分型檢測試劑盒（流式熒光雜交法，貨號：LG01002H1；讀數模板編碼：LG010021C；批號：16A001）。
1.3 實驗方法
1.3.1 樣本采集和處理 在非月經期取樣，取樣前 72 h 避免性生活，且未用藥物沖洗陰道或使用陰道內藥物。醫護人員以擴陰器暴露宮頸口，先用棉拭子擦去宮頸口的分泌物，將專用宮頸刷伸入宮頸口處，緊貼宮頸口黏膜順時針輕柔轉動 4～5 周，慢慢抽出宮頸刷，將其放入裝有細胞保存液的洗脫管，在管口除沿刷柄折痕將宮頸刷折斷，宮頸刷頭留在洗脫管中，旋緊管蓋，直立放置常溫或 4℃ 保存，72 h 以內完成檢測。
1.3.2 樣本 DNA 提取 輕微振蕩懸浮保存液中的脫落細胞，取 200 μL樣本保存液于 1.5 mL 離心管中，12 000 r/min 離心 5 min，棄上清。加入搖勻的核酸提取劑 200 μL，振蕩混勻，放入 100℃ 金屬浴 15 min 后，12 000 r/min 離心 5 min，保留上清以備檢測。
1.3.3 PCR 擴增 按比例（預混液 10 μL/人份+引物混合液 5 μL/人份+聚合酶 0.8 μL/人份）充分混勻制成 PCR 反應試劑，瞬時離心，按 15 μL/孔加入 PCR 反應板反應孔中，再取上清樣本 DNA 模板、30 和 70 號陽性質控、90 號陰性質控 5 μL 加入相應反應孔，混勻瞬離后放入 PCR 儀進行擴增。擴增條件：95℃ 5 min，1 個循環；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，5 個循環；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環；72℃ 3 min。
1.3.4 熒光素微球雜交 在反應板雜交孔中分別加入微球雜交液 22 μL 和樣本 PCR 擴增產物 3 μL 混勻，封板后放入 PCR 儀中運行雜交。95℃ 變性 5 min；48℃ 雜交 30 min；每孔快速加入熒光標記的鏈霉親和素-藻紅蛋白 75 μL，重新用封口膜封住反應板，繼續 48℃ 孵育 15 min。
1.3.5 上機檢測 將孵育好的雜交板快速轉移至預熱好的 Luminex 200 多功能流式點陣儀上進行檢測和結果分析，具體操作流程和結果判讀嚴格按試劑、儀器說明書進行。本研究檢測 27 種 HPV 基因型，包括 17 種高危型（HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV82）和 10 種低危型（HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV55、HPV61、HPV81、HPV83）。
1.4 統計分析
采用 Excel 2007 錄入數據，SPSS 17.0 進行統計分析，計算 HPV 的總體和特定類型的感染率。同時，統計單一和多重感染的所有基因型，并分別按年齡（20～25 歲、26～30 歲、31～35 歲、36～40 歲、41～45 歲、46～50 歲、51～55 歲、56～60 歲、61～65 歲及 66 歲及以上）統計分析。
2 結果
2.1 健康體檢女性 HPV 感染的一般情況
共納入 8 944 例健康體檢女性，年齡為 20 歲～85 歲，平均年齡 43.8±10.3 歲。其中共檢出 HPV 感染 1 291 例（平均年齡 44.5±10.4 歲），感染率為 14.4%（1 291/8 944）。高風險 HPV（hrHPV）感染率為 10.5%（939/8 944），低風險 HPV（lrHPV）感染率為 5.5%（490/8 944）。1 291 例 HPV 感染者中，單一感染為 1 025 例占 79.4%（1 025/1 291）；多重感染有 266 例占 HPV 感染者的 20.6%（266/1 291）（表 1）。
表1
8 944 例健康體檢女性 HPV 感染情況分布（例）
2.2 HPV 基因型分布
在 1 025 例單一感染者中，hrHPV 占 68.2%（699/1 025）。四種最常見的 hrHPV 是 HPV52、53、16 和 58，感染率分別為 1.69%（151/8 944）、1.13%（101/8 944）、0.83%（74/8944）和 0.81%（72/8 944）。此外，lrHPV 中 HPV61、81、55、43 和 44 的感染率也較高，分別為 0.7%（62/8 944）、0.6%（56/8 944）、0.6%（50/8 944）、0.6%（49/8 944）和 0.5%（46/8 944）（表 2）。
表2
單一感染的 HPV 基因型分布情況（例）
在 266 例 HPV 多重感染者中，雙重感染占 71.1%（205/266），三重感染占 15.0%（40/266），四重感染占 5.6%（15/266），五重感染占 2.3%（6/266）。四種最常見的 hrHPV 類型分別為 HPV52、53、58 和 16，感染率分別為 0.8%（67/8 944）、0.6%（49/8 944）、0.5%（40/8 944）和 0.4%（39/8 944）。此外，lrHPV 中 HPV81、43、61、44 和 55 的感染率較高，分別為 0.4%（38/8 944）、0.4%（37/8 944）、0.4%（36/8 944）、0.4%（35/8 944）和 0.3%（26/8 944）（表 3）。
表3
多重感染的 HPV 基因型分布情況（例）
2.3 HPV 感染在不同年齡段中的分布
20～25 歲和 66 歲及以上年齡段在單一及多重感染中的感染率均較其他年齡段高。單一感染在 41～45 歲和 51～55 歲組也較高（圖 1）。單一感染中感染率最高的 HPV52 在 31～35 歲和 61～65 歲年齡段較高（圖 2）。多重感染中，20～25 歲年齡段的 HPV52 和 HPV16 感染率較其他年齡段高（圖 3）。
圖1
HPV 單一和多重感染率在各年齡段的分布情況
圖2
單一感染中 4 種常見 HPV 感染率在各年齡段分布情況
圖3
多重感染中 4 種常見 HPV 感染率在各年齡段分布情況
3 討論
不同人群中 HPV 類型的分布具有差異較大。基于 WHO 數據，宮頸癌患者中 4 個最常見的 hrHPV 類型是 HPV16、18、33 和 45，而正常女性中最常見的類型是 HPV16、18、31 和 58[2]。在中國，宮頸癌患者中4個最常見的 hrHPV 類型分別是 HPV16、18、58 和 33；而在正常女性人群中最常見的類型為 HPV16、52、18 和 51[2]。本研究顯示我院健康體檢女性以 hrHPV 感染為主，最常見的基因型是 HPV52、53、16 和 58，這與趙麗等[6]的研究結果基本一致，但與馮余寬等[7]的研究結果不同，這可能與納入人群的差異有關。
當前美國已有 3 種 HPV 疫苗注冊，分別是二價疫苗（HPV16 和 18）、四價疫苗（HPV6、11、16 和 18）和九價疫苗（HPV6、11、16、18、31、33、45、52 和 58）。接種二價或四價疫苗能明顯有效降低宮頸癌的風險[8]。中國國家食品藥品監督管理局于 2016 年 7 月 12 日批準了 HPV16 和 18 型二價疫苗的進口注冊申請。但宮頸癌并不只 HPV16/18 有關，還有 10%～20% 與其他 HPV 類型有關，如 HPV31、45、52 和 58[1]。本研究結果顯示體檢者 HPV 感染最常見為 HPV52、53、16 和 58，這非現有的二價和四價疫苗所能涵蓋。雖然有研究提示 HPV 疫苗對 HPV 類型有交叉保護性[9, 10]，但由于 HPV 誘導產生的中和抗體具有型別特異性，交叉保護率可能較低[11]。此外，由于 HPV 的病毒自限性及宿主機體的免疫清除作用，HPV 篩查陽性并不能提示其一定患宮頸癌。即使篩查陰性，也有可能存在感染，發生不良結局。此外 2015 年，美國疾病控制中心性傳播疾病的診斷和治療指南也建議對已接種 HPV 疫苗的≥21 歲女性仍需繼續進行常規宮頸癌的篩查[12]。
疫苗接種前 HPV 分型檢測對評價疫苗具有重要價值，也可為研制新型疫苗提供依據[13]。對不同類型 HPV 疫苗進行成本效益分析，HPV 感染分布、疫苗對未覆蓋亞型的有效性、防治技術的有效性和特異性、篩查和疫苗接種的覆蓋率等因素均會影響其成本效益[14-17]。雖然國外已有不少研究評價了 HPV 疫苗的成本效益，但中國的研究較少，本研究的結果可在一定程度上為成本效益分析提供研究基礎。
本研究結果顯示，20～25 歲和 66 歲及以上體檢者在單一及多重感染中的感染率均較高，這與 Wang 等[18]研究結果類似。年輕女性生殖道相對免疫保護系統尚不夠成熟，抗感染能力弱，宮頸鱗狀上皮細胞較敏感，易受 HPV 感染[19]。而隨著年齡的增長，機體免疫能力逐漸降低，HPV 感染風險增高。41～45 歲和 51～55 歲年齡段在單一感染中也較高，這可能與圍絕經期激素波動引起生理及免疫失調有關。因此，建議不同年齡段的女性均有必要進行 HPV 分型檢測。
本研究中，HPV 感染陽性婦女中多重感染所占比例為 20.6%，低于上海（36.6%）、北京（27.7%）和山西（24.3%），但略高于河南（19.8%）、云南（18.0%）、湖南（17.7%）、新疆（15.5%）[3, 5, 21]。這體現了一定的地區特異性。
本研究的局限性：本研究僅納入四川大學華西醫院的健康體檢者，也未收集體檢者的細胞學數據，將來應開展基于總體人群的研究，探討 HPV 分型的關系。
總之，基于本院健康體檢者 HPV 感染情況，建議將 HPV52、53 和 58 納入到 HPV 疫苗篩選評估中，為 HPV 感染及宮頸癌預防提供理論依據。
