引用本文： 黃毅, 黃斌, 胡昕, 阿不都吉力力·居來提, 齊曼古力·吾守爾. T-SPOT.TB在診斷中國菌陰肺結核患者中應用價值的Meta分析. 中國循證醫學雜志, 2016, 16(12): 1381-1387. doi: 10.7507/1672-2531.20160209 復制
肺結核是一種由結核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染病，曾在世界范圍內廣泛傳播，被稱作“白色瘟疫”。2014年全球約有960萬人罹患結核病，其中約150萬人因結核病死亡，包括89萬男人、48萬婦女和14萬兒童 [1]。我國是結核病重災區，患者數居世界第二位。菌陰肺結核是指三次痰涂片及一次痰培養陰性的肺結核 [2]。痰培養是診斷肺結核的金標準，但此法費時太長，不利于肺結核的早期診斷及治療；痰涂片法敏感度較低；而結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST）易受接種卡介苗接種影響，假陽性率較高。菌陰肺結核仍有一定傳染性，延誤診治會造成結核病的傳播并使患者病情加重。因此尋找一種敏感、特異、快速的診斷結核感染的方法是防治肺結核的關鍵。
近10年來，在歐美國家廣泛開展的體外γ-干擾素釋放試驗（interferon-gamma release assays，IGRAs），是一種實驗室診斷肺結核病的新方法。該方法是將結核分枝桿菌特異性抗原即早期分泌靶抗原6（early secreted antigenic target 6，ESAT-6）和培養過濾蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）作為刺激源，以酶聯免疫吸附法（ELISA）或酶聯免疫斑點法（ELISPOT）檢測外周血特異性釋放干擾素γ的T細胞濃度或數量來診斷結核感染 [3-5]。該方法已被歐美多個國家列為結核病診療指南 [6, 7]。在我國開展較多的是結核T細胞酶聯免疫斑點法（T-SPOT.TB），國內外許多專家學者對其在肺結核患者中的診斷價值做了大量研究 [8-13]。多數研究表明，T-SPOT.TB在肺結核感染的診斷中有較高的敏感度和特異度。但單個研究存在樣本量小，病例來源、研究設計有差異等不足，結論可信性較低。本研究采用Meta分析評價T-SPOT.TB診斷菌陰肺結核的研究文獻 [14-24]，旨在評價T-SPOT.TB在我國菌陰肺結核患者中的診斷價值，為臨床診療提供指導。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
T-SPOT.TB診斷菌陰肺結核的診斷性試驗研究。
1.1.2 研究對象
病例組為確診的中國菌陰肺結核患者；對照組為健康人或其它肺部疾病患者；年齡＞18歲，無性別、民族等要求。
1.1.3 診斷方法
菌陰肺結核的診斷金標準為中華醫學會結核病分會制訂的診斷標準 [2]；待評價診斷方法為T-SPOT.TB。
1.1.4 結局指標
合并敏感度（sensitivity，Sen）、合并特異度（specificity，Spe）、合并陽性似然比（positive likelihood ratio，+LR）、合并陰性似然比（negative likelihood ratio，-LR）、診斷比值比（diagnosis odds ratio，DOR）和合并受試者工作特征曲線（summary receiver operator characteristic curve，SROC）下面積等。
1.1.5 排除標準
重復發表的文獻；研究對象合并人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、血液系統腫瘤、糖尿病、免疫缺陷病等疾病；樣本量＜20例；試劑盒來源非Oxford者；非中、英文文獻。
1.2 文獻檢索
計算機檢索PubMed、CBM、CNKI、WanFang Data和VIP數據庫中關于T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者的相關文獻，檢索時限均為建庫至2015年12月31日。檢索詞包括γ-干擾素釋放試驗、T-SPOT.TB、酶聯免疫斑點法、肺結核、診斷等，并根據具體數據庫調整，采取主題詞檢索和自由詞檢索結合的方式。以WanFang Data為例，其檢索策略見框1。
#1 γ- 干擾素釋放試驗 #2 T-SPOT #3 免疫斑點法 #4 #1 OR #2 OR #3 #5 肺結核 #6 診斷 #7 #4 AND #5 AND #6
1.3 文獻篩選、資料提取和納入研究的偏倚風險評價
由2名研究員獨立篩選文獻、提取資料，若有不一致通過討論解決。資料提取的內容包括：文獻來源（包括全部作者、文章題目、發表期刊名稱等）、研究的設計類型及方法學信息（如樣本量、盲法、研究場所、研究期限等）、試驗對象基本特征（人種、年齡、性別、診斷標準、病例來源等）、干預及對照措施、結局指標（Sen、Spe、+LR、-LR、DOR等）。按照Whiting等制定的QUADAS-2 [25]工具獨立評價納入研究的偏倚風險。對每個條目做出“是”（低度偏倚或適用性好）、“否”（高度偏倚或適用性差）或“不清楚”（缺乏相關信息或偏倚情況不確定）的判斷。
1.4 統計分析
用State 12.1和Meta-DiSc 1.4軟件進行數據分析，計算合并Sen、Spe、+LR、-LR、DOR等。在診斷試驗中，引起異質性的原因包括閾值效應和非閾值效應 [26]；當存在閾值效應時，敏感度和特異度呈負相關（或敏感度與1-特異度呈正相關），其結果在SROC曲線平面圖上呈“肩臂狀”點分布；而非閾值效應包括：人群（如疾病嚴重程度和伴發疾病）、試驗條件（如不同的技術、化驗、操作者）、標準試驗等。在Meta-DiSc 1.4軟件中用診斷比值比DOR的Cochran-Q檢驗探討非閾值效應引起的異質性，取α=0.10，當異質性檢驗結果P＞0.1時，表明各研究間有同質性，用固定效應模型進行Meta分析、當異質性檢驗結果P＜0.1時，表明各研究異質，用隨機效應模型進行Meta分析。采用Begg’s漏斗圖和Egger’s檢驗來評價發表偏倚。α=0.05確定為Meta分析的檢驗水準。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢共獲得相關文獻862篇，經過逐層篩選，最終納入11個研究 [14-24]。文獻篩選流程見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征
納入文獻的基本特征見表 1。納入文獻總病例數為1 413例，對照組1 256例。所有研究皆采用T-SPOT.TB試驗方法，試劑盒皆由英國Oxford Immunotec公司提供。
表1
納入文獻基本特征
2.3 納入研究的偏倚風險評價
結果見圖 2。
圖2
納入文獻的偏倚風險評價
2.4 異質性分析
使用Meta-DiSc 1.4軟件繪制SROC曲線平面圖，結果發現不呈“肩臂狀”點分布，提示不存在閾值效應（圖 3）；用DOR的Cochran-Q檢驗探討非閾值效應引起的異質性示：Cochran-Q=15.55，P=0.11，表明不存在非閾值效應引起的異質性（圖 4）；選取固定效應模型合并統計量。
圖3
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者的SROC曲線
圖4
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者診斷比值比
2.5 Meta分析結果
Meta分析結果顯示T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者的Sen合并、Spe合并、+LR合并、-LR合并、DOR合并、AUC分別為83%[95%CI（0.81，0.85）]（圖 5）、86%[95%CI（0.84，0.88）]（圖 6）、5.73[95%CI（4.99，6.59）]（圖 7）、0.20[95%CI（0.18，0.23）]（圖 8）、31.09[95%CI（25.11，38.49）]（圖 3），AUC=0.92（圖 4）。
圖5
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者敏感度的Meta分析
圖6
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者特異度的Meta分析
圖7
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者陽性似然比的Meta分析
圖8
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者陰性似然比的Meta分析
2.5 發表偏倚
Egger's 檢驗結果提示P=0.615，表明各研究間未見明顯的發表偏倚。
3 討論
目前常用的IGRAs方法有三種，即QuantiFERON-TB Gold（QFT-G）、QuantiFERON-TB Gold In-tube（QFT-GIT），以及以酶聯免疫斑點（ELISPOT）技術為基礎的T-SPOT.TB。其原理是人體初次感染結核分枝桿菌后使T淋巴細胞轉化為記憶T淋巴細胞，當人體再次接觸結核分枝桿菌后，會迅速產生效應T淋巴細胞，釋放多種細胞因子 [27]；其中干擾素-γ（IFN-γ）是最關鍵的細胞因子；在機體外用結核分枝桿菌特異抗原（ESAT-6、CFP-10），刺激受試者外周血單個核細胞（PBMC），若其中含有記憶T淋巴細胞，就會分泌大量IFN-γ，此時用ELISA或T-SPOT.TB法檢測IFN-γ濃度或計數分泌IFN-γ的T細胞數量來判斷有無結核桿菌感染。
本Meta分析共納入11個研究，Meta分析結果顯示，T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者的合并敏感度為83%[95%CI（0.81，0.85）]，合并特異度為86%[95%CI（0.84，0.88）]，合并DOR為31.09[95%CI（25.11，38.49）]，說明該診斷試驗的診斷效能較好；合并+LR為5.73[95%CI（4.99，6.59）]，表明菌陰肺結核患者檢出陽性結果的概率是非患者的5.54倍；合并-LR是0.20[95%CI（0.18，0.23）]，說明菌陰肺結核患者檢出陰性結果的概率是非患者的0.20倍，即試驗結果陰性的患者在缺乏其他影像學、病原學等證據支持的情況下，可基本排除結核菌感染的可能；AUC為0.92，表明該診斷試驗的診斷價值較高。國外許多研究報道，T-SPOT.TB在低、中收入國家診斷肺結核的合并敏感度為83%[95%CI（63%，94%）]，合并特異度為61%[95%CI（40%，79%）] [28]；國內大量文獻顯示，T-SPOT.TB檢測對疑似肺結核的診斷敏感度為77%～95%，特異度為71.7%～93% [29-32]。本研究中敏感度與國內外研究報道結果相似，而特異度較國外研究結果為高，考慮可能與人種、對照組研究對象的入選標準、實驗室條件及實驗人員操作水平差異等因素有關。納入文獻所選對照組研究對象的既往結核病病史、接觸史，胃分枝桿菌、蘇爾加分支桿菌、轉黃分枝桿菌、海分枝桿菌等其他分枝桿菌感染，以及實驗操作過程中內毒素污染等情況都可能導致假陽性結果的出現；而實驗組研究對象的年齡、低免疫狀態、過敏狀態、抗結核藥物的應用等是導致出現假陰性結果的可能原因。
本研究的局限性：① 納入文獻所含病例數較少，且受研究者水平及實驗室條件等限制使各納入文獻研究質量普遍不高，尚需選擇更多大樣本量、更高研究質量的文獻進行Meta分析來驗證、補充、完善本研究的結果；② 本研究未納入未公開發表的文獻且僅納入中英文文獻，可能存在發表偏倚和語種偏倚；③ 某些研究在結果讀取時未遵循盲法原則，也可能會造成偏倚。
綜上所述，T-SPOT.TB是一種新的、較快速、準確的診斷肺結核的方法，對我國菌陰肺結核患者的早期診斷有較高的應用價值。但T-SPOT.TB不能區分活動性結核病或是潛伏感染，只能作為臨床診斷、鑒別診斷結核病的輔助手段，不能作為“金標準”。作為臨床大夫，還需根據患者臨床表現、影像學檢查、年齡、結核接觸史、免疫狀況等綜合判斷，做出診斷。
肺結核是一種由結核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染病，曾在世界范圍內廣泛傳播，被稱作“白色瘟疫”。2014年全球約有960萬人罹患結核病，其中約150萬人因結核病死亡，包括89萬男人、48萬婦女和14萬兒童 [1]。我國是結核病重災區，患者數居世界第二位。菌陰肺結核是指三次痰涂片及一次痰培養陰性的肺結核 [2]。痰培養是診斷肺結核的金標準，但此法費時太長，不利于肺結核的早期診斷及治療；痰涂片法敏感度較低；而結核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST）易受接種卡介苗接種影響，假陽性率較高。菌陰肺結核仍有一定傳染性，延誤診治會造成結核病的傳播并使患者病情加重。因此尋找一種敏感、特異、快速的診斷結核感染的方法是防治肺結核的關鍵。
近10年來，在歐美國家廣泛開展的體外γ-干擾素釋放試驗（interferon-gamma release assays，IGRAs），是一種實驗室診斷肺結核病的新方法。該方法是將結核分枝桿菌特異性抗原即早期分泌靶抗原6（early secreted antigenic target 6，ESAT-6）和培養過濾蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）作為刺激源，以酶聯免疫吸附法（ELISA）或酶聯免疫斑點法（ELISPOT）檢測外周血特異性釋放干擾素γ的T細胞濃度或數量來診斷結核感染 [3-5]。該方法已被歐美多個國家列為結核病診療指南 [6, 7]。在我國開展較多的是結核T細胞酶聯免疫斑點法（T-SPOT.TB），國內外許多專家學者對其在肺結核患者中的診斷價值做了大量研究 [8-13]。多數研究表明，T-SPOT.TB在肺結核感染的診斷中有較高的敏感度和特異度。但單個研究存在樣本量小，病例來源、研究設計有差異等不足，結論可信性較低。本研究采用Meta分析評價T-SPOT.TB診斷菌陰肺結核的研究文獻 [14-24]，旨在評價T-SPOT.TB在我國菌陰肺結核患者中的診斷價值，為臨床診療提供指導。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
T-SPOT.TB診斷菌陰肺結核的診斷性試驗研究。
1.1.2 研究對象
病例組為確診的中國菌陰肺結核患者；對照組為健康人或其它肺部疾病患者；年齡＞18歲，無性別、民族等要求。
1.1.3 診斷方法
菌陰肺結核的診斷金標準為中華醫學會結核病分會制訂的診斷標準 [2]；待評價診斷方法為T-SPOT.TB。
1.1.4 結局指標
合并敏感度（sensitivity，Sen）、合并特異度（specificity，Spe）、合并陽性似然比（positive likelihood ratio，+LR）、合并陰性似然比（negative likelihood ratio，-LR）、診斷比值比（diagnosis odds ratio，DOR）和合并受試者工作特征曲線（summary receiver operator characteristic curve，SROC）下面積等。
1.1.5 排除標準
重復發表的文獻；研究對象合并人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、血液系統腫瘤、糖尿病、免疫缺陷病等疾病；樣本量＜20例；試劑盒來源非Oxford者；非中、英文文獻。
1.2 文獻檢索
計算機檢索PubMed、CBM、CNKI、WanFang Data和VIP數據庫中關于T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者的相關文獻，檢索時限均為建庫至2015年12月31日。檢索詞包括γ-干擾素釋放試驗、T-SPOT.TB、酶聯免疫斑點法、肺結核、診斷等，并根據具體數據庫調整，采取主題詞檢索和自由詞檢索結合的方式。以WanFang Data為例，其檢索策略見框1。
#1 γ- 干擾素釋放試驗 #2 T-SPOT #3 免疫斑點法 #4 #1 OR #2 OR #3 #5 肺結核 #6 診斷 #7 #4 AND #5 AND #6
1.3 文獻篩選、資料提取和納入研究的偏倚風險評價
由2名研究員獨立篩選文獻、提取資料，若有不一致通過討論解決。資料提取的內容包括：文獻來源（包括全部作者、文章題目、發表期刊名稱等）、研究的設計類型及方法學信息（如樣本量、盲法、研究場所、研究期限等）、試驗對象基本特征（人種、年齡、性別、診斷標準、病例來源等）、干預及對照措施、結局指標（Sen、Spe、+LR、-LR、DOR等）。按照Whiting等制定的QUADAS-2 [25]工具獨立評價納入研究的偏倚風險。對每個條目做出“是”（低度偏倚或適用性好）、“否”（高度偏倚或適用性差）或“不清楚”（缺乏相關信息或偏倚情況不確定）的判斷。
1.4 統計分析
用State 12.1和Meta-DiSc 1.4軟件進行數據分析，計算合并Sen、Spe、+LR、-LR、DOR等。在診斷試驗中，引起異質性的原因包括閾值效應和非閾值效應 [26]；當存在閾值效應時，敏感度和特異度呈負相關（或敏感度與1-特異度呈正相關），其結果在SROC曲線平面圖上呈“肩臂狀”點分布；而非閾值效應包括：人群（如疾病嚴重程度和伴發疾病）、試驗條件（如不同的技術、化驗、操作者）、標準試驗等。在Meta-DiSc 1.4軟件中用診斷比值比DOR的Cochran-Q檢驗探討非閾值效應引起的異質性，取α=0.10，當異質性檢驗結果P＞0.1時，表明各研究間有同質性，用固定效應模型進行Meta分析、當異質性檢驗結果P＜0.1時，表明各研究異質，用隨機效應模型進行Meta分析。采用Begg’s漏斗圖和Egger’s檢驗來評價發表偏倚。α=0.05確定為Meta分析的檢驗水準。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢共獲得相關文獻862篇，經過逐層篩選，最終納入11個研究 [14-24]。文獻篩選流程見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征
納入文獻的基本特征見表 1。納入文獻總病例數為1 413例，對照組1 256例。所有研究皆采用T-SPOT.TB試驗方法，試劑盒皆由英國Oxford Immunotec公司提供。
表1
納入文獻基本特征
2.3 納入研究的偏倚風險評價
結果見圖 2。
圖2
納入文獻的偏倚風險評價
2.4 異質性分析
使用Meta-DiSc 1.4軟件繪制SROC曲線平面圖，結果發現不呈“肩臂狀”點分布，提示不存在閾值效應（圖 3）；用DOR的Cochran-Q檢驗探討非閾值效應引起的異質性示：Cochran-Q=15.55，P=0.11，表明不存在非閾值效應引起的異質性（圖 4）；選取固定效應模型合并統計量。
圖3
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者的SROC曲線
圖4
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者診斷比值比
2.5 Meta分析結果
Meta分析結果顯示T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者的Sen合并、Spe合并、+LR合并、-LR合并、DOR合并、AUC分別為83%[95%CI（0.81，0.85）]（圖 5）、86%[95%CI（0.84，0.88）]（圖 6）、5.73[95%CI（4.99，6.59）]（圖 7）、0.20[95%CI（0.18，0.23）]（圖 8）、31.09[95%CI（25.11，38.49）]（圖 3），AUC=0.92（圖 4）。
圖5
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者敏感度的Meta分析
圖6
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者特異度的Meta分析
圖7
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者陽性似然比的Meta分析
圖8
T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者陰性似然比的Meta分析
2.5 發表偏倚
Egger's 檢驗結果提示P=0.615，表明各研究間未見明顯的發表偏倚。
3 討論
目前常用的IGRAs方法有三種，即QuantiFERON-TB Gold（QFT-G）、QuantiFERON-TB Gold In-tube（QFT-GIT），以及以酶聯免疫斑點（ELISPOT）技術為基礎的T-SPOT.TB。其原理是人體初次感染結核分枝桿菌后使T淋巴細胞轉化為記憶T淋巴細胞，當人體再次接觸結核分枝桿菌后，會迅速產生效應T淋巴細胞，釋放多種細胞因子 [27]；其中干擾素-γ（IFN-γ）是最關鍵的細胞因子；在機體外用結核分枝桿菌特異抗原（ESAT-6、CFP-10），刺激受試者外周血單個核細胞（PBMC），若其中含有記憶T淋巴細胞，就會分泌大量IFN-γ，此時用ELISA或T-SPOT.TB法檢測IFN-γ濃度或計數分泌IFN-γ的T細胞數量來判斷有無結核桿菌感染。
本Meta分析共納入11個研究，Meta分析結果顯示，T-SPOT.TB診斷中國菌陰肺結核患者的合并敏感度為83%[95%CI（0.81，0.85）]，合并特異度為86%[95%CI（0.84，0.88）]，合并DOR為31.09[95%CI（25.11，38.49）]，說明該診斷試驗的診斷效能較好；合并+LR為5.73[95%CI（4.99，6.59）]，表明菌陰肺結核患者檢出陽性結果的概率是非患者的5.54倍；合并-LR是0.20[95%CI（0.18，0.23）]，說明菌陰肺結核患者檢出陰性結果的概率是非患者的0.20倍，即試驗結果陰性的患者在缺乏其他影像學、病原學等證據支持的情況下，可基本排除結核菌感染的可能；AUC為0.92，表明該診斷試驗的診斷價值較高。國外許多研究報道，T-SPOT.TB在低、中收入國家診斷肺結核的合并敏感度為83%[95%CI（63%，94%）]，合并特異度為61%[95%CI（40%，79%）] [28]；國內大量文獻顯示，T-SPOT.TB檢測對疑似肺結核的診斷敏感度為77%～95%，特異度為71.7%～93% [29-32]。本研究中敏感度與國內外研究報道結果相似，而特異度較國外研究結果為高，考慮可能與人種、對照組研究對象的入選標準、實驗室條件及實驗人員操作水平差異等因素有關。納入文獻所選對照組研究對象的既往結核病病史、接觸史，胃分枝桿菌、蘇爾加分支桿菌、轉黃分枝桿菌、海分枝桿菌等其他分枝桿菌感染，以及實驗操作過程中內毒素污染等情況都可能導致假陽性結果的出現；而實驗組研究對象的年齡、低免疫狀態、過敏狀態、抗結核藥物的應用等是導致出現假陰性結果的可能原因。
本研究的局限性：① 納入文獻所含病例數較少，且受研究者水平及實驗室條件等限制使各納入文獻研究質量普遍不高，尚需選擇更多大樣本量、更高研究質量的文獻進行Meta分析來驗證、補充、完善本研究的結果；② 本研究未納入未公開發表的文獻且僅納入中英文文獻，可能存在發表偏倚和語種偏倚；③ 某些研究在結果讀取時未遵循盲法原則，也可能會造成偏倚。
綜上所述，T-SPOT.TB是一種新的、較快速、準確的診斷肺結核的方法，對我國菌陰肺結核患者的早期診斷有較高的應用價值。但T-SPOT.TB不能區分活動性結核病或是潛伏感染，只能作為臨床診斷、鑒別診斷結核病的輔助手段，不能作為“金標準”。作為臨床大夫，還需根據患者臨床表現、影像學檢查、年齡、結核接觸史、免疫狀況等綜合判斷，做出診斷。
