引用本文： 劉魯亮, 郭福林, 顧博宇. BMP-4基因T538C多態性與非綜合征性唇腭裂相關性的Meta分析. 中國循證醫學雜志, 2015, 15(6): 633-638. doi: 10.7507/1672-2531.20150106 復制
先天性唇腭裂可分為綜合征性唇腭裂（syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P）和非綜合征性唇腭裂（non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）。非綜合征性唇腭裂又分為唇裂伴或不伴腭裂及單純性腭裂。NSCL/P是人類最常見的先天性畸形之一，全世界發病率為1‰～2‰，在我國發病率約為1.42‰[1]，且不同種族中發病率也不盡相同。目前認為，NSCL/P是一種多基因、多因素的疾病，是基因與環境相互作用的結果[2]。已有研究表明，NSCL/P與妊娠期吸煙[3]、飲酒[4]、病毒感染[5]等因素密切相關，同時，遺傳因素[6-9]也至關重要。越來越多的流行病學研究顯示，NSCL/P的發病與許多基因有關，如TGF-α、TGF-β、TGF-2、MSX1、MTHFR、IRF-6、BCL-3、SUMO-1、TBX22等。
骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP-4）基因，位于14號染色體 （14q22-q23）上，是近年來新發現的NSCL/P的候選基因之一。而538T/C是BMP-4基因中研究最多的單核苷酸多態性位點。有研究結果顯示，BMP-4 T538C多態性與NSCL/P的發病存在關聯，但現有研究結果不盡相同，且單個研究樣本量較小，缺乏說服力。因此，本研究采用Meta分析方法對BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P的相關性進行評價。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
病例-對照研究。文種限中、英文。
1.1.2 研究對象
經臨床明確診斷為NSCL/P。
1.1.3 暴露因素
BMP-4基因T538C多態性。
1.1.4 結局指標
NSCL/P的發病風險。
1.1.5 排除標準
① 原始數據無法提取；② 重復發表的文獻；③ 僅有摘要而未找到全文的文獻；④ 對照組基因型頻率分布不符合哈迪溫伯格平衡（H-W平衡）。
1.2 檢索策略
計算機檢索The Cochrane Library、PubMed、EMbase、CBM、CNKI、VIP以及WanFang Data數據庫，搜集已發表的BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P易感性關系的病例-對照研究，檢索時限均為從建庫到2014年11月。此外，追溯納入文獻的參考文獻，以補充獲取相關文獻。英文檢索詞包括BMP-4、polymorphism、variant、non-syndromic cleft lip with or without cleft palate （NSCL/P）；中文檢索詞包括BMP-4基因、多態性、非綜合征性唇腭裂（NSCL/P）。以PubMed為例，其具體檢索策略見框1。
框 1 PubMed檢索策略
#1 polymorphism #2 variant #3 #1 OR #2 #4 BMP4 OR bone morphogenetic protein 4 #5 NSCL/P OR nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate #6 #3 AND #4 AND #5
1.3 文獻篩選與資料提取
由2位研究者獨立按照納入與排除標準篩選文獻，并交叉核對，如遇分歧，則咨詢第三方協助判斷，缺乏的資料盡量與作者聯系予以補充。文獻篩選時，首先閱讀文題，如符合納入標準，則進一步閱讀摘要、全文，符合納入標準后納入。
采用自制的資料提取表提取資料，提取內容主要包括：研究題目、作者和發表時間，研究對象所屬國家及其種族，總樣本量，病例組和對照組不同基因型分布頻數，基因分型方法及對照組H-W平衡檢驗結果等。
1.4 納入研究的偏倚風險評價
由2名評價者獨立按照NOS量表（Newcastle-Ottawa Scale）評價納入研究的偏倚風險，并交叉核對，如遇分歧，討論解決。評價內容包括研究對象的選擇、組間可比性及暴露因素的測量3個部分，共8個條目，滿分為9分。其中0～4分為低質量研究，5～9分為高質量研究。
1.5 統計分析
采用RevMan 5.1軟件進行Meta分析。首先對納入研究的對照組基因型進行H-W平衡檢驗，若P＜0.05，則對照組基因型不符合H-W平衡。然后分別計算5種遺傳模型（C vs. T、CT vs. TT、CC vs. TT、CC vs. CT+TT、CC+CT vs. TT）下的基因型分布。采用OR值及其95%CI為合并分析效應量，以α=0.05為Meta分析的檢驗水準。納入研究結果間的異質性采用χ2檢驗進行分析（檢驗水準設為α=0.1），并結合I2定量判斷異質性的大小。若各研究結果間無統計學異質性，采用固定效應模型進行Meta分析；若各研究結果間存在統計學異質性，在排除明顯臨床異質性的影響后，采用隨機效應模型進行Meta分析。明顯的臨床異質性采用亞組分析（如按人種的不同進行亞組分析）進行處理，或只行描述性分析。發表偏倚檢測采用STATA10.0軟件。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢索出相關文獻126篇，經逐層篩選，最終納入6篇文獻[10-15]，包括926例NSCL/P患者和1 110例對照。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征與偏倚風險評價結果
納入研究的基本特征見表 1，偏倚風險評價結果見表 2。由表 2可見，納入研究的NOS得分均＞5分，提示納入研究質量均較高。
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的偏倚風險評價
2.3 Meta分析結果
2.3.1 C vs. T
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=1.14，95%CI=（0.78，1.66），P=0.51]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性在亞洲人群可能增加NSCL/P的發病風險[OR=1.54，95%CI（1.26，1.87），P＜0.001]，但在拉美人群可能降低NSCL/P的發病風險[OR=0.69，95%CI（0.50，0.96），P=0.03]（圖 2）。
圖2
BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險相關性的Meta分析（C vs. T）
2.3.2 CT vs. TT
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=0.75，95%CI（0.50，1.11），P=0.15]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與亞洲人群NSCL/P發病風險無關[OR=0.99，95%CI（0.65，1.52），P=0.97]，但可能降低拉美人群NSCL/P的發病風險[OR=0.52，95%CI（0.40，0.68），P＜0.001]（表 3）。
表3
BMP-4基因T538C因多態性與NSCL/P發病風險相關性的Meta分析
2.3.3 CC vs. TT
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=1.53，95%CI（0.69，3.37），P=0.29]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性在亞洲人群可能增加NSCL/P的發病風險[OR=2.91，95%CI（1.88，4.52），P＜0.001]，但與拉美人群NSCL/P的發病風險無關[OR=0.55，95%CI（0.24，1.26），P=0.16]（表 3）。
2.3.4 CC vs. CT+TT
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=1.80，95%CI（0.96，3.38），P=0.07]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性在亞洲人群可能增加NSCL/P的發病風險[OR=2.99，95%CI（1.99，4.49），P＜0.001]，但與拉美人群NSCL/P的發病風險無關[OR=0.83，95%CI（0.45，1.54），P=0.55]（表 3）。
2.3.5 CC+CT vs. TT
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=0.90，95%CI（0.57，1.43），P=0.65]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與亞洲人群NSCL/P發病風險無關[OR=1.32，95%CI（1.00，1.74），P＞0.05]，但在拉美人群可能降低NSCL/P的發病風險[OR=0.52，95%CI（0.35，0.78），P=0.001]（表 3）。
2.4 發表偏倚
采用Begg's漏斗圖和Egger's線性回歸模型進行發表偏倚分析。以CC+CT vs. TT為例，漏斗圖結果顯示圖形對稱性較好（圖 3），Egger線性回歸分析結果（Egger’s test=0.458）進一步證實無明顯發表偏倚。
圖3
BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險相關性的漏斗圖（CC+CT vs. TT）
3 討論
BMP-4是骨形態生產蛋白家族成員，也是分泌信號分子的轉化生長因子β（TGF-β）的成員[16]，在胚胎發育中起著重要作用。在顱面部（尤其是上、下頜骨和軟骨）及四肢的發育中，BMP-4都有顯著表達。Foppiano等[17]在雞胚中進行了BMP-4功能分析，研究發現，BMP-4基因對于胚胎的發育至關重要，缺乏BMP-4的雞胚影響了面部的正常發育。Juriloff等[18]的研究發現，BMP-4缺乏的轉基因小鼠模型中，轉基因小鼠出現了單純性唇裂。此外，Line等[19]首次發現BMP-4和人類唇腭裂存在一定的相關性。許多的流行病學研究表明，BMP-4對于上唇及腭部的發育尤其重要，被認為是NSCL/P發病的重要候選基因。
BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險的相關性是目前NSCL/P病因學研究的熱點。T538C單核苷酸可影響BMP-4基因的轉錄、相關蛋白的合成，從而影響BMP-4基因的表達。目前，多項研究結果表明，BMP-4基因T538C位點是導致NSCL/P發生的危險因素，然而有學者發現NSCL/P與BMP-4基因T538C多態性并無顯著相關性。因而，我們對BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險的相關性進行了Meta分析。
本次Meta分析對等位基因模型、雜合子模型、純合子模型、隱形模型以及顯性模型共5種基因模型進行了分析，結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P的發病風險無顯著相關性。由于研究間異質性較大，我們按種族的不同進行了亞組分析，結果顯示：對亞洲人群，在等位基因模型、純合子模型及隱形模型下，BMP-4基因T538C多態性可能增加NSCL/P的發病風險；然而，對于拉美人群，在等位基因模型、雜合子模型及顯性基因模型下，BMP-4基因T538C多態性可能降低NSCL/P的發病風險。由此可見，種族是研究BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P易感性相關性必須考慮的重要因素。
本研究也存在一定的局限性。首先，納入研究數和樣本量均較少，可能無法提供足夠的檢驗效能（尤其是亞組分析）而影響Meta分析結果的可靠性。其次，各納入研究基因分型方法不盡相同，有一項研究采用的是Taqman法，其余均為PCR-RFLP法，這可能是Meta分析結果異質性的來源之一。再次，納入研究均為已發表文獻，不排除陰性結果的研究研究未發表而未納入本Meta分析，因此可能對Meta分析結果產生影響。另外，NSCL/P的發生是基因與環境相互作用的結果，我們的分析僅考慮了單基因，無法排除其他基因及環境因素對結果產生的影響。
綜上所述，現有證據表明，BMP-4基因T538C多態性可能增加亞洲人群NSCL/P發病風險，但可能降低拉美人群NSCL/P發病風險。受納入研究數量和質量所限，上述結論尚需開展更多研究予以驗證。
先天性唇腭裂可分為綜合征性唇腭裂（syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P）和非綜合征性唇腭裂（non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）。非綜合征性唇腭裂又分為唇裂伴或不伴腭裂及單純性腭裂。NSCL/P是人類最常見的先天性畸形之一，全世界發病率為1‰～2‰，在我國發病率約為1.42‰[1]，且不同種族中發病率也不盡相同。目前認為，NSCL/P是一種多基因、多因素的疾病，是基因與環境相互作用的結果[2]。已有研究表明，NSCL/P與妊娠期吸煙[3]、飲酒[4]、病毒感染[5]等因素密切相關，同時，遺傳因素[6-9]也至關重要。越來越多的流行病學研究顯示，NSCL/P的發病與許多基因有關，如TGF-α、TGF-β、TGF-2、MSX1、MTHFR、IRF-6、BCL-3、SUMO-1、TBX22等。
骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP-4）基因，位于14號染色體 （14q22-q23）上，是近年來新發現的NSCL/P的候選基因之一。而538T/C是BMP-4基因中研究最多的單核苷酸多態性位點。有研究結果顯示，BMP-4 T538C多態性與NSCL/P的發病存在關聯，但現有研究結果不盡相同，且單個研究樣本量較小，缺乏說服力。因此，本研究采用Meta分析方法對BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P的相關性進行評價。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
病例-對照研究。文種限中、英文。
1.1.2 研究對象
經臨床明確診斷為NSCL/P。
1.1.3 暴露因素
BMP-4基因T538C多態性。
1.1.4 結局指標
NSCL/P的發病風險。
1.1.5 排除標準
① 原始數據無法提取；② 重復發表的文獻；③ 僅有摘要而未找到全文的文獻；④ 對照組基因型頻率分布不符合哈迪溫伯格平衡（H-W平衡）。
1.2 檢索策略
計算機檢索The Cochrane Library、PubMed、EMbase、CBM、CNKI、VIP以及WanFang Data數據庫，搜集已發表的BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P易感性關系的病例-對照研究，檢索時限均為從建庫到2014年11月。此外，追溯納入文獻的參考文獻，以補充獲取相關文獻。英文檢索詞包括BMP-4、polymorphism、variant、non-syndromic cleft lip with or without cleft palate （NSCL/P）；中文檢索詞包括BMP-4基因、多態性、非綜合征性唇腭裂（NSCL/P）。以PubMed為例，其具體檢索策略見框1。
框 1 PubMed檢索策略
#1 polymorphism #2 variant #3 #1 OR #2 #4 BMP4 OR bone morphogenetic protein 4 #5 NSCL/P OR nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate #6 #3 AND #4 AND #5
1.3 文獻篩選與資料提取
由2位研究者獨立按照納入與排除標準篩選文獻，并交叉核對，如遇分歧，則咨詢第三方協助判斷，缺乏的資料盡量與作者聯系予以補充。文獻篩選時，首先閱讀文題，如符合納入標準，則進一步閱讀摘要、全文，符合納入標準后納入。
采用自制的資料提取表提取資料，提取內容主要包括：研究題目、作者和發表時間，研究對象所屬國家及其種族，總樣本量，病例組和對照組不同基因型分布頻數，基因分型方法及對照組H-W平衡檢驗結果等。
1.4 納入研究的偏倚風險評價
由2名評價者獨立按照NOS量表（Newcastle-Ottawa Scale）評價納入研究的偏倚風險，并交叉核對，如遇分歧，討論解決。評價內容包括研究對象的選擇、組間可比性及暴露因素的測量3個部分，共8個條目，滿分為9分。其中0～4分為低質量研究，5～9分為高質量研究。
1.5 統計分析
采用RevMan 5.1軟件進行Meta分析。首先對納入研究的對照組基因型進行H-W平衡檢驗，若P＜0.05，則對照組基因型不符合H-W平衡。然后分別計算5種遺傳模型（C vs. T、CT vs. TT、CC vs. TT、CC vs. CT+TT、CC+CT vs. TT）下的基因型分布。采用OR值及其95%CI為合并分析效應量，以α=0.05為Meta分析的檢驗水準。納入研究結果間的異質性采用χ2檢驗進行分析（檢驗水準設為α=0.1），并結合I2定量判斷異質性的大小。若各研究結果間無統計學異質性，采用固定效應模型進行Meta分析；若各研究結果間存在統計學異質性，在排除明顯臨床異質性的影響后，采用隨機效應模型進行Meta分析。明顯的臨床異質性采用亞組分析（如按人種的不同進行亞組分析）進行處理，或只行描述性分析。發表偏倚檢測采用STATA10.0軟件。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢索出相關文獻126篇，經逐層篩選，最終納入6篇文獻[10-15]，包括926例NSCL/P患者和1 110例對照。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征與偏倚風險評價結果
納入研究的基本特征見表 1，偏倚風險評價結果見表 2。由表 2可見，納入研究的NOS得分均＞5分，提示納入研究質量均較高。
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的偏倚風險評價
2.3 Meta分析結果
2.3.1 C vs. T
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=1.14，95%CI=（0.78，1.66），P=0.51]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性在亞洲人群可能增加NSCL/P的發病風險[OR=1.54，95%CI（1.26，1.87），P＜0.001]，但在拉美人群可能降低NSCL/P的發病風險[OR=0.69，95%CI（0.50，0.96），P=0.03]（圖 2）。
圖2
BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險相關性的Meta分析（C vs. T）
2.3.2 CT vs. TT
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=0.75，95%CI（0.50，1.11），P=0.15]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與亞洲人群NSCL/P發病風險無關[OR=0.99，95%CI（0.65，1.52），P=0.97]，但可能降低拉美人群NSCL/P的發病風險[OR=0.52，95%CI（0.40，0.68），P＜0.001]（表 3）。
表3
BMP-4基因T538C因多態性與NSCL/P發病風險相關性的Meta分析
2.3.3 CC vs. TT
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=1.53，95%CI（0.69，3.37），P=0.29]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性在亞洲人群可能增加NSCL/P的發病風險[OR=2.91，95%CI（1.88，4.52），P＜0.001]，但與拉美人群NSCL/P的發病風險無關[OR=0.55，95%CI（0.24，1.26），P=0.16]（表 3）。
2.3.4 CC vs. CT+TT
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=1.80，95%CI（0.96，3.38），P=0.07]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性在亞洲人群可能增加NSCL/P的發病風險[OR=2.99，95%CI（1.99，4.49），P＜0.001]，但與拉美人群NSCL/P的發病風險無關[OR=0.83，95%CI（0.45，1.54），P=0.55]（表 3）。
2.3.5 CC+CT vs. TT
共納入6個研究（926例NSCL/P患者，1 110例對照）。隨機效應模型Meta分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險無相關性[OR=0.90，95%CI（0.57，1.43），P=0.65]。根據種族進行的亞組分析結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與亞洲人群NSCL/P發病風險無關[OR=1.32，95%CI（1.00，1.74），P＞0.05]，但在拉美人群可能降低NSCL/P的發病風險[OR=0.52，95%CI（0.35，0.78），P=0.001]（表 3）。
2.4 發表偏倚
采用Begg's漏斗圖和Egger's線性回歸模型進行發表偏倚分析。以CC+CT vs. TT為例，漏斗圖結果顯示圖形對稱性較好（圖 3），Egger線性回歸分析結果（Egger’s test=0.458）進一步證實無明顯發表偏倚。
圖3
BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險相關性的漏斗圖（CC+CT vs. TT）
3 討論
BMP-4是骨形態生產蛋白家族成員，也是分泌信號分子的轉化生長因子β（TGF-β）的成員[16]，在胚胎發育中起著重要作用。在顱面部（尤其是上、下頜骨和軟骨）及四肢的發育中，BMP-4都有顯著表達。Foppiano等[17]在雞胚中進行了BMP-4功能分析，研究發現，BMP-4基因對于胚胎的發育至關重要，缺乏BMP-4的雞胚影響了面部的正常發育。Juriloff等[18]的研究發現，BMP-4缺乏的轉基因小鼠模型中，轉基因小鼠出現了單純性唇裂。此外，Line等[19]首次發現BMP-4和人類唇腭裂存在一定的相關性。許多的流行病學研究表明，BMP-4對于上唇及腭部的發育尤其重要，被認為是NSCL/P發病的重要候選基因。
BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險的相關性是目前NSCL/P病因學研究的熱點。T538C單核苷酸可影響BMP-4基因的轉錄、相關蛋白的合成，從而影響BMP-4基因的表達。目前，多項研究結果表明，BMP-4基因T538C位點是導致NSCL/P發生的危險因素，然而有學者發現NSCL/P與BMP-4基因T538C多態性并無顯著相關性。因而，我們對BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P發病風險的相關性進行了Meta分析。
本次Meta分析對等位基因模型、雜合子模型、純合子模型、隱形模型以及顯性模型共5種基因模型進行了分析，結果顯示，BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P的發病風險無顯著相關性。由于研究間異質性較大，我們按種族的不同進行了亞組分析，結果顯示：對亞洲人群，在等位基因模型、純合子模型及隱形模型下，BMP-4基因T538C多態性可能增加NSCL/P的發病風險；然而，對于拉美人群，在等位基因模型、雜合子模型及顯性基因模型下，BMP-4基因T538C多態性可能降低NSCL/P的發病風險。由此可見，種族是研究BMP-4基因T538C多態性與NSCL/P易感性相關性必須考慮的重要因素。
本研究也存在一定的局限性。首先，納入研究數和樣本量均較少，可能無法提供足夠的檢驗效能（尤其是亞組分析）而影響Meta分析結果的可靠性。其次，各納入研究基因分型方法不盡相同，有一項研究采用的是Taqman法，其余均為PCR-RFLP法，這可能是Meta分析結果異質性的來源之一。再次，納入研究均為已發表文獻，不排除陰性結果的研究研究未發表而未納入本Meta分析，因此可能對Meta分析結果產生影響。另外，NSCL/P的發生是基因與環境相互作用的結果，我們的分析僅考慮了單基因，無法排除其他基因及環境因素對結果產生的影響。
綜上所述，現有證據表明，BMP-4基因T538C多態性可能增加亞洲人群NSCL/P發病風險，但可能降低拉美人群NSCL/P發病風險。受納入研究數量和質量所限，上述結論尚需開展更多研究予以驗證。
