引用本文： 王曉存, 唐婧, 吳軍. ELISA試劑檢測前S1抗原診斷乙型肝炎病毒復制價值的Meta分析. 中國循證醫學雜志, 2014, 14(11): 1318-1325. doi: 10.7507/1672-2531.20140214 復制
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個全球公共衛生問題。約有4億慢性感染者，近1/3的人曾感染過HBV，在發展中國家尤為突出[1]。我國是病毒性肝炎的高發區，特別是乙型病毒性肝炎，不僅人群感染率高，且易轉為慢性肝炎，部分病例可演變為肝硬化甚至是原發性肝癌[2, 3]。因此，對乙型肝炎患者進行早期診斷和早期治療尤為重要。
前S1抗原（Pre-S1Ag）的測定可作為一個反映HBV復制和傳染性的指標，其持續存在反映了體內存有處于復制狀態的HBV顆粒，對乙型肝炎的臨床診斷和治療有一定的指導意義[4]。如果乙肝感染者的Pre-S1Ag呈陰性，提示病毒復制不活躍，傳染性小；Pre-S1Ag呈陽性，提示病毒復制活躍，傳染性強。在體檢和獻血項目中加查Pre-S1Ag，可起到對疾病的早期診斷和盡早切斷傳染原的重要作用[5]。
目前實驗室檢測Pre-S1Ag的常用方法是酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。其方法操作簡單，結果容易判斷，價格低廉，無須特殊儀器和高標準的實驗條件，易于推廣應用。為評價ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制的價值，本研究全面收集相關文獻進行Meta分析，以期為臨床提供更可靠的證據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
國內外已發表的ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制的診斷性試驗。文種僅限中、英文。
1.1.2 研究對象
①乙型肝炎患者，非乙型肝炎對照者（健康志愿者、血液透析患者、HDV感染者、獻血者等）；②研究結果中含有或通過計算可獲得四格表數據。
1.1.3 診斷方法
待評價試驗為酶聯免疫吸附試驗（ELISA），而HBV-DNA是反映體內HBV感染、復制和傳染性強弱的金標準[6]。
1.1.4 結局指標
靈敏度（sensitivity，Sen）、特異度（specificity，Spe）、陽性似然比（positive likelihood ratio，+LR）、陰性似然比（negative likelihood ratio，-LR）和診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR）。
1.1.5 排除標準
①未描述具體診斷標準、未經金標準確認的文獻；②重復發表文獻。
1.2 檢索策略
計算機檢索PubMed、EMbase、The Cochrane Library（2014年第3期）、CBM、CNKI、VIP和WanFang Data，全面收集ELISA試劑檢測血清中HBV Pre-S1Ag診斷HBV復制的診斷性試驗，檢索時限均為從建庫至2014年5月1日。手工檢索2009年1月至2014年3月期間的《中華肝臟病雜志》、《中華檢驗醫學雜志》和《中華醫院感染雜志》等。同時追溯納入文獻的參考文獻。中文檢索詞包括乙型肝炎、前S1抗原、酶聯免疫吸附試驗、聚合酶鏈反應、HBV-DNA、靈敏度、特異度；英文檢索詞包括hepatitis B、Pre-S1Ag、ELISA、PCR、HBV-DNA、sensitivity、specificity。以PubMed為例，其檢索策略見框1。
框1 PubMed檢索策略
hepatitis B Pre-S1Ag ELISA PCR HBV-DNA sensitivity specificity #3 OR #4 OR #5 OR #6 OR #7 #1 AND #2 AND #8
1.3 文獻篩選、資料提取與質量評價
由2位評價者按照納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料和評價納入研究的方法學質量，如遇分歧討論解決。資料提取內容包括：作者姓名、發表年代、研究國家（省份）、樣本量、檢測試劑、金標準、真陽性例數、假陽性例數、真陰性例數、假陰性例數、Sen和Spe。然后，根據QUADAS [7, 8]條目對納入的每個研究逐條按“是”、“否”和“不清楚”進行評價，“是”為滿足此條標準，“否”為不滿足或未提及，部分滿足或從文獻中無法得到足夠信息的計為“不清楚”。
1.4 統計分析
采用Meta-Disc 1.4軟件進行Meta分析，首先分析異質性，包括閾值效應和非閾值效應引起的異質性。若存在閾值效應，則數據最好的合并方法是擬合SROC曲線并計算曲線下面積（AUC），或應用其他統計量如Q指數；若異質性是由非閾值效應所致，則使用隨機效應模型進行Meta分析，計算合并的Sen、Spe、+LR、-LR和DOR，繪制SROC曲線，并計算AUC。若無異質性，則采用固定效應模型進行Meta分析。合并效應量時，可嘗試在同質的亞組內合并分析[9]。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出452篇文獻，通逐層篩選，最終納入14個研究[10-23]，其中13個研究來自中國（含11個省）[10, 12-23]，1個研究來自比利時[11]。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征與方法學質量評價
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的方法學質量評價
2.3 異質性檢驗
2.3.1 閾值效應
本系統評價通過ROC曲線平面圖檢驗閾值效應，結果顯示不呈“肩臂狀”分布（圖 2），提示不存在閾值效應。進一步計算靈敏度對數與（1-特異度）對數的Spearman相關系數=-0.013，P=0.965，也表明不存在閾值效應。
圖2
納入研究精確估計量在ROC曲線平面分布
2.3.2 非閾值效應
系統評價通過DOR探討非閾值效應引起的異質性，DOR的Cochran-Q檢驗（I2=90.0%，Cochran-Q=139.84，P=0.000 0）分析結果表明，存在非閾值效應引起的異質性，故Meta分析模型選用隨機效應模型。
2.4 Meta分析結果
2.4.1 合并統計量
隨機效應模型Meta分析結果顯示：Sen合并=0.76[95%CI（0.74，0.78）]，Spe合并=0.90[95%CI（0.88，0.91）]，+LR合并=8.54[95%CI（4.25，17.15）]，-LR合并=0.17[95%CI（0.10，0.27）]，DOR合并=65.12[95%CI（24.91，170.28）]（圖 3～7）。SROC曲線下面積AUC=0.943 0（SE=0.018 1），Q*=0.881 3（SE=0.023 4）（圖 8）。
圖3
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制Sen的Meta分析
圖4
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制Spe的Meta分析
圖5
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制+LR的Meta分析
圖6
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制–LR的Meta分析
圖7
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制DOR的Meta分析
圖8
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制的SROC曲線
2.4.2 亞組分析
由于各納入研究間存在非閾值效應引起的異質性，我們按ELISA試劑生產廠家的不同進行亞組分析。生產廠家為上海阿爾法生物技術有限公司的研究有7個，采用隨機效應模型對該7個研究進行Meta分析，結果見表 3。其余生產廠家納入研究均不超過2個，無法進行合并分析。
表3
采用上海阿爾法生物技術有限公司生產的ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制各診斷指標的合并分析結果
2.4.3 不同生產廠家的ELISA試劑檢測HBV Pre-S1Ag的靈敏度和特異度
結果見表 4。
表4
同生產廠家的ELISA試劑檢測HBV Pre-S1Ag的靈敏度和特異度
3 討論
HBV感染是全世界范圍內的重大公共衛生問題，但不同地區HBV的流行趨勢差異很大，我國是全球HBV感染最為嚴重的地區之一[24]。因此，判斷HBV的復制和活動情況對于乙肝的早期診斷及早期切斷傳染源具有重要意義。
人體感染HBV后，其最早的免疫應答方式針對的是Pre-S1抗原，檢測Pre-S1抗原可反映患者機體的免疫狀況及病情的轉歸情況，在一定程度上提示了HBV的復制情況[25]。
早在1992年就已有研究資料表明，HBV Pre-S1抗原具有非常高的免疫原性，是人體感染HBV后最先出現、也是最先消失的血清標志物[26]。對于HBV感染者而言，如果Pre-S1抗原表現為陰性，說明HBV表現不活躍，而且傳染性較小；反之HBV Pre-S1抗原陽性時，預示著病毒復制處于比較活躍的狀態，傳染性較強。因此HBV Pre-S1抗原的意義優于HBeAg，應引起臨床重視[25]。
本系統評價納入的均為與金標準比較的研究，納入人群全部使用同一參考標準，說明在一定程度上控制了偏倚的發生，納入研究均報告了待評價試驗和金標準試驗的檢測方法和使用試劑的生產商，試驗操作的重復性較好。疾病譜和納入標準的描述較為清晰。納入研究均未提及觀察試驗結果時是否采用盲法，是否存在退出病例和難以解釋的試驗結果，說明存在偏倚的可能。
本系統評價的SROC曲線平面圖不呈“肩臂狀”分布，且Spearman相關系數=-0.013（P=0.965），均表明各納入研究間不存在閾值效應引起的異質性。
本系統評價診斷比值比的Cochran-Q檢驗分析表明存在非閾值效應引起的異質性，其原因可能在于研究對象、試驗條件、標準試驗等。15個納入研究雖均采用ELISA試劑檢測Pre-S1Ag，但由于使用了不同公司生產的試劑，提示由于采用不同的試劑或各個實驗室存在方法學異質性，原因可能在于包被抗原的表達系統、包被工藝、質量等不同。
本系統評價結果表明ELISA試劑檢測血清Pre-S1Ag漏診率較高，但其誤診率較低，Pre-S1Ag陽性時，HBV復制的可能性大，Pre-S1Ag陰性時不能排除HBV復制的可能性，AUC接近1.0，診斷的真實性好。
不同研究者使用同一公司（上海阿爾法生物技術有限公司）ELISA試劑檢測Pre-S1Ag，合并的SEN、SPE、DOR值均較高，AUC接近1.0，提示采用阿爾法公司生產的ELISA試劑檢測血清Pre-S1Ag對診斷HBV復制有較大的價值。而Sen和Spe存在較大差異，說明各實驗室檢測準確性差異較大，異質性的產生與實驗操作、研究對象的選擇、實驗標準的選擇等有較大關系。
本研究尚存在以下局限性：①檢索文種僅限于中、英文，可能存在語種偏倚；②只納入公開發表的文獻，未獲取灰色文獻，可能存在發表偏倚；③部分納入研究的方法學質量不高，會影響Meta分析結果的可靠性，如部分納入研究未明確說明病例譜是否包含各種病例及易混淆的疾病病例，未對納入研究對象的特征、試驗方法、測量指標、質量控制等進行詳細描述和說明，所有研究均未對樣本量進行估計，且均未提及盲法方案。
綜上所述，ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制特異度高，誤診率低，且與HBV-DNA有高度的一致性，因此適用于HBV的確診，不適用于篩查。而在目前ELISA法檢測水平下平均SROC曲線下面積為0.943 0，顯示Pre-S1Ag用于HBV復制的診斷有較高的診斷價值。但由于納入研究存在的方法學缺陷，本研究結論尚需進一步開展高質量的診斷性試驗進行驗證。
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個全球公共衛生問題。約有4億慢性感染者，近1/3的人曾感染過HBV，在發展中國家尤為突出[1]。我國是病毒性肝炎的高發區，特別是乙型病毒性肝炎，不僅人群感染率高，且易轉為慢性肝炎，部分病例可演變為肝硬化甚至是原發性肝癌[2, 3]。因此，對乙型肝炎患者進行早期診斷和早期治療尤為重要。
前S1抗原（Pre-S1Ag）的測定可作為一個反映HBV復制和傳染性的指標，其持續存在反映了體內存有處于復制狀態的HBV顆粒，對乙型肝炎的臨床診斷和治療有一定的指導意義[4]。如果乙肝感染者的Pre-S1Ag呈陰性，提示病毒復制不活躍，傳染性小；Pre-S1Ag呈陽性，提示病毒復制活躍，傳染性強。在體檢和獻血項目中加查Pre-S1Ag，可起到對疾病的早期診斷和盡早切斷傳染原的重要作用[5]。
目前實驗室檢測Pre-S1Ag的常用方法是酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。其方法操作簡單，結果容易判斷，價格低廉，無須特殊儀器和高標準的實驗條件，易于推廣應用。為評價ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制的價值，本研究全面收集相關文獻進行Meta分析，以期為臨床提供更可靠的證據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
國內外已發表的ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制的診斷性試驗。文種僅限中、英文。
1.1.2 研究對象
①乙型肝炎患者，非乙型肝炎對照者（健康志愿者、血液透析患者、HDV感染者、獻血者等）；②研究結果中含有或通過計算可獲得四格表數據。
1.1.3 診斷方法
待評價試驗為酶聯免疫吸附試驗（ELISA），而HBV-DNA是反映體內HBV感染、復制和傳染性強弱的金標準[6]。
1.1.4 結局指標
靈敏度（sensitivity，Sen）、特異度（specificity，Spe）、陽性似然比（positive likelihood ratio，+LR）、陰性似然比（negative likelihood ratio，-LR）和診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR）。
1.1.5 排除標準
①未描述具體診斷標準、未經金標準確認的文獻；②重復發表文獻。
1.2 檢索策略
計算機檢索PubMed、EMbase、The Cochrane Library（2014年第3期）、CBM、CNKI、VIP和WanFang Data，全面收集ELISA試劑檢測血清中HBV Pre-S1Ag診斷HBV復制的診斷性試驗，檢索時限均為從建庫至2014年5月1日。手工檢索2009年1月至2014年3月期間的《中華肝臟病雜志》、《中華檢驗醫學雜志》和《中華醫院感染雜志》等。同時追溯納入文獻的參考文獻。中文檢索詞包括乙型肝炎、前S1抗原、酶聯免疫吸附試驗、聚合酶鏈反應、HBV-DNA、靈敏度、特異度；英文檢索詞包括hepatitis B、Pre-S1Ag、ELISA、PCR、HBV-DNA、sensitivity、specificity。以PubMed為例，其檢索策略見框1。
框1 PubMed檢索策略
hepatitis B Pre-S1Ag ELISA PCR HBV-DNA sensitivity specificity #3 OR #4 OR #5 OR #6 OR #7 #1 AND #2 AND #8
1.3 文獻篩選、資料提取與質量評價
由2位評價者按照納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料和評價納入研究的方法學質量，如遇分歧討論解決。資料提取內容包括：作者姓名、發表年代、研究國家（省份）、樣本量、檢測試劑、金標準、真陽性例數、假陽性例數、真陰性例數、假陰性例數、Sen和Spe。然后，根據QUADAS [7, 8]條目對納入的每個研究逐條按“是”、“否”和“不清楚”進行評價，“是”為滿足此條標準，“否”為不滿足或未提及，部分滿足或從文獻中無法得到足夠信息的計為“不清楚”。
1.4 統計分析
采用Meta-Disc 1.4軟件進行Meta分析，首先分析異質性，包括閾值效應和非閾值效應引起的異質性。若存在閾值效應，則數據最好的合并方法是擬合SROC曲線并計算曲線下面積（AUC），或應用其他統計量如Q指數；若異質性是由非閾值效應所致，則使用隨機效應模型進行Meta分析，計算合并的Sen、Spe、+LR、-LR和DOR，繪制SROC曲線，并計算AUC。若無異質性，則采用固定效應模型進行Meta分析。合并效應量時，可嘗試在同質的亞組內合并分析[9]。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出452篇文獻，通逐層篩選，最終納入14個研究[10-23]，其中13個研究來自中國（含11個省）[10, 12-23]，1個研究來自比利時[11]。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征與方法學質量評價
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的方法學質量評價
2.3 異質性檢驗
2.3.1 閾值效應
本系統評價通過ROC曲線平面圖檢驗閾值效應，結果顯示不呈“肩臂狀”分布（圖 2），提示不存在閾值效應。進一步計算靈敏度對數與（1-特異度）對數的Spearman相關系數=-0.013，P=0.965，也表明不存在閾值效應。
圖2
納入研究精確估計量在ROC曲線平面分布
2.3.2 非閾值效應
系統評價通過DOR探討非閾值效應引起的異質性，DOR的Cochran-Q檢驗（I2=90.0%，Cochran-Q=139.84，P=0.000 0）分析結果表明，存在非閾值效應引起的異質性，故Meta分析模型選用隨機效應模型。
2.4 Meta分析結果
2.4.1 合并統計量
隨機效應模型Meta分析結果顯示：Sen合并=0.76[95%CI（0.74，0.78）]，Spe合并=0.90[95%CI（0.88，0.91）]，+LR合并=8.54[95%CI（4.25，17.15）]，-LR合并=0.17[95%CI（0.10，0.27）]，DOR合并=65.12[95%CI（24.91，170.28）]（圖 3～7）。SROC曲線下面積AUC=0.943 0（SE=0.018 1），Q*=0.881 3（SE=0.023 4）（圖 8）。
圖3
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制Sen的Meta分析
圖4
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制Spe的Meta分析
圖5
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制+LR的Meta分析
圖6
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制–LR的Meta分析
圖7
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制DOR的Meta分析
圖8
ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制的SROC曲線
2.4.2 亞組分析
由于各納入研究間存在非閾值效應引起的異質性，我們按ELISA試劑生產廠家的不同進行亞組分析。生產廠家為上海阿爾法生物技術有限公司的研究有7個，采用隨機效應模型對該7個研究進行Meta分析，結果見表 3。其余生產廠家納入研究均不超過2個，無法進行合并分析。
表3
采用上海阿爾法生物技術有限公司生產的ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制各診斷指標的合并分析結果
2.4.3 不同生產廠家的ELISA試劑檢測HBV Pre-S1Ag的靈敏度和特異度
結果見表 4。
表4
同生產廠家的ELISA試劑檢測HBV Pre-S1Ag的靈敏度和特異度
3 討論
HBV感染是全世界范圍內的重大公共衛生問題，但不同地區HBV的流行趨勢差異很大，我國是全球HBV感染最為嚴重的地區之一[24]。因此，判斷HBV的復制和活動情況對于乙肝的早期診斷及早期切斷傳染源具有重要意義。
人體感染HBV后，其最早的免疫應答方式針對的是Pre-S1抗原，檢測Pre-S1抗原可反映患者機體的免疫狀況及病情的轉歸情況，在一定程度上提示了HBV的復制情況[25]。
早在1992年就已有研究資料表明，HBV Pre-S1抗原具有非常高的免疫原性，是人體感染HBV后最先出現、也是最先消失的血清標志物[26]。對于HBV感染者而言，如果Pre-S1抗原表現為陰性，說明HBV表現不活躍，而且傳染性較小；反之HBV Pre-S1抗原陽性時，預示著病毒復制處于比較活躍的狀態，傳染性較強。因此HBV Pre-S1抗原的意義優于HBeAg，應引起臨床重視[25]。
本系統評價納入的均為與金標準比較的研究，納入人群全部使用同一參考標準，說明在一定程度上控制了偏倚的發生，納入研究均報告了待評價試驗和金標準試驗的檢測方法和使用試劑的生產商，試驗操作的重復性較好。疾病譜和納入標準的描述較為清晰。納入研究均未提及觀察試驗結果時是否采用盲法，是否存在退出病例和難以解釋的試驗結果，說明存在偏倚的可能。
本系統評價的SROC曲線平面圖不呈“肩臂狀”分布，且Spearman相關系數=-0.013（P=0.965），均表明各納入研究間不存在閾值效應引起的異質性。
本系統評價診斷比值比的Cochran-Q檢驗分析表明存在非閾值效應引起的異質性，其原因可能在于研究對象、試驗條件、標準試驗等。15個納入研究雖均采用ELISA試劑檢測Pre-S1Ag，但由于使用了不同公司生產的試劑，提示由于采用不同的試劑或各個實驗室存在方法學異質性，原因可能在于包被抗原的表達系統、包被工藝、質量等不同。
本系統評價結果表明ELISA試劑檢測血清Pre-S1Ag漏診率較高，但其誤診率較低，Pre-S1Ag陽性時，HBV復制的可能性大，Pre-S1Ag陰性時不能排除HBV復制的可能性，AUC接近1.0，診斷的真實性好。
不同研究者使用同一公司（上海阿爾法生物技術有限公司）ELISA試劑檢測Pre-S1Ag，合并的SEN、SPE、DOR值均較高，AUC接近1.0，提示采用阿爾法公司生產的ELISA試劑檢測血清Pre-S1Ag對診斷HBV復制有較大的價值。而Sen和Spe存在較大差異，說明各實驗室檢測準確性差異較大，異質性的產生與實驗操作、研究對象的選擇、實驗標準的選擇等有較大關系。
本研究尚存在以下局限性：①檢索文種僅限于中、英文，可能存在語種偏倚；②只納入公開發表的文獻，未獲取灰色文獻，可能存在發表偏倚；③部分納入研究的方法學質量不高，會影響Meta分析結果的可靠性，如部分納入研究未明確說明病例譜是否包含各種病例及易混淆的疾病病例，未對納入研究對象的特征、試驗方法、測量指標、質量控制等進行詳細描述和說明，所有研究均未對樣本量進行估計，且均未提及盲法方案。
綜上所述，ELISA試劑檢測Pre-S1Ag診斷HBV復制特異度高，誤診率低，且與HBV-DNA有高度的一致性，因此適用于HBV的確診，不適用于篩查。而在目前ELISA法檢測水平下平均SROC曲線下面積為0.943 0，顯示Pre-S1Ag用于HBV復制的診斷有較高的診斷價值。但由于納入研究存在的方法學缺陷，本研究結論尚需進一步開展高質量的診斷性試驗進行驗證。
