引用本文： 周凜梅, 徐光艷, 楊紅霞, 張建勇. MCC950干預對哮喘小鼠氣道NLRP3炎癥小體及氣道黏蛋白Muc5ac表達水平的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(12): 842-848. doi: 10.7507/1671-6205.202210020 復制
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種細胞以及細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病。我國約有4570萬哮喘患者[1]，其發病率及死亡率仍逐年上升[2]，重癥哮喘不斷增加，帶來了巨大的經濟負擔[3]。研究發現，NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3）炎癥小體異常激活參與哮喘、慢阻肺等氣道慢性炎癥反應[4]，且與氣道黏蛋白5ac（Muc5ac）的高表達有密切關系，而氣道Muc5ac高分泌是評估哮喘病情嚴重程度及預后的獨立危險因素。本研究旨在觀察NLRP3炎癥小體拮抗劑MCC950干預對哮喘小鼠氣道Muc5ac水平的影響，探討NLRP3炎癥小體在哮喘氣道黏液高分泌中的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
無特定病原體級的雌性BALB/c小鼠50只，體重（18±2）g，6～8周齡。動物實驗經遵義醫學院動物實驗委員會批準，倫理審查編號：KLLY(A)-2021-129。
1.1.2 試劑
雞卵清白蛋白（Ⅴ級，美國Sigma公司），氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司），MCC950（美國MedchemExpess公司），阿爾新藍–碘酸雪夫（Alcian blue-periodic acid Schiff base，AB-PAS）染色試劑盒（北京索來寶生物技術有限公司），白細胞介素（interluekin，IL）-18及IL-18的酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海江萊生物技術有限公司），小鼠抗小鼠-MUC5ac單克隆抗體、NLRP3單克隆抗體、Caspase-1單克隆抗體，山羊抗兔、抗小鼠IgG辣根過氧化物酶及二氨基聯苯胺顯色試劑盒（英國Abcam公司），免疫組織化學通用型二步法檢測試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司），RNAiso Reagent、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒、RT-PCR引物［MUC5ac、NLRP3、Caspase-1、β肌動蛋白（β-actin），大連TaKaRa公司］。
1.1.3 儀器
壓縮霧化器 L2160003（中國魚躍醫療），電子分析天平（德國賽多利思公司，感量：0.1 mg），高速冷凍離心機（美國貝克曼公司），Multiskan spectrum酶標儀（美國Thermo scientific公司），光學顯微鏡（日本NIKON公司），核酸蛋白測量儀ND-1000（美國Nanodrop公司），CFX96熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）。
1.2 方法
1.2.1 動物分組、哮喘模型制備及干預方法
50只雌性BALB/c小鼠，隨機分為正常對照組（NS組）、哮喘組（AS組）、MCC950低劑量干預組（ML組）、MCC950高劑量干預組（MH組）及地塞米松組（Dex組），每組10只。采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏及激發建立哮喘模型。AS組在實驗第1天和第13天腹腔注射40 μg OVA+1 mg氧化鋁凝膠溶液、頸部皮下注射20 μg OVA+1 mg氫氧化鋁凝膠溶液及雙側大腿根部皮下分別注射10 μg OVA+1 mg氫氧化鋁凝膠溶液注射致敏，第19～23天，將小鼠置于自制的密閉透明的霧化箱中，予10% OVA生理鹽水溶液霧化吸入激發，1次/d，每次30 min；NS組用磷酸鹽緩沖液腹腔聯合皮下注射，以生理鹽水霧化吸入；L組激發前30 min腹腔注射MCC950 10 mg/kg（隔日注射、共3次），MH組激發前30 min 連續5 d腹腔注射MCC950 10 mg/kg，Dex組激發前30 min連續5 d腹腔注射地塞米松0.2 mL，其余方法同AS組。
1.2.2 標本采集
各組小鼠于末次激發24 h后麻醉、固定并處死，開胸取右肺組織，右上葉和中葉肺組織置入EP管，保存于–80 ℃冰箱用于RNA提取；取其余兩葉肺組織放入4%多聚甲醛固定24 h，常規漂洗脫水，石蠟包埋，切片。頸部氣管充分暴露，作“V”型切口將留置針插入氣管，緩慢注入磷酸鹽緩沖液0.3 mL于肺內，回抽灌洗液，灌洗3次，每次回收0.25～0.3 mL，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）置于EP管中，先取10 μL行總細胞計數，其余BALF離心后沉淀物涂片行瑞士–吉姆薩染色行白細胞分類計數，上清液行ELISA檢測。
1.2.3 BALF總細胞計數及瑞士–吉姆薩染色白細胞分類計數
各組小鼠新鮮BALF 10 μL經破紅細胞膜處理后滴在細胞計數板上，覆蓋蓋玻片，在低倍鏡下計數4個大方格（16個小方格），原則“弓”字形計數，計算公式為細胞總數=n/4×104/L（n=四個大方里的細胞數總和）；其余BALF離心后沉淀物涂片，在檢驗科自動染片機上行瑞士–吉姆薩染色，每張涂片油鏡下“弓”字形分類計數200個白細胞，并計算出每組嗜酸粒細胞、單核細胞、中性粒細胞所占百分比。
1.2.4 ELISA檢測BALF中IL-18、IL-1β濃度
各組小鼠BALF離心后上清液行ELISA檢測。按試劑盒說明操作各個步驟，最后用酶標儀在490 nm處讀取吸光度值，計算BALF中IL-18、IL-1β濃度。使用ELISAcalc軟件，以標準濃度為X軸，對應的OD值為Y軸，繪制出標準品的線性回歸線。以Y值計算X值，再乘以稀釋倍數，得出對應的濃度，單位為pg/mL。
1.2.5 肺組織病理學切片蘇木精–伊紅染色圖像分析
各組小鼠肺組織切片，常規石蠟及梯度乙醇脫水，蘇木素染液染5 min后自來水沖洗，鹽酸酒精分化5 min后再次用自來水沖洗，靜置返藍10 min，再次梯度乙醇脫水，二甲苯透明5 min，自然干燥后中性樹膠封片。每只小鼠選取3張肺組織切片行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后在普通光學顯微鏡下觀察，根據支氣管周圍炎癥細胞浸潤情況評分，判斷標準：① 無炎癥細胞（0分）；② 少許炎癥細胞（1分）；③ 較多分布不均炎癥細胞（2分）；④ 大量炎癥細胞，分布較均勻，少見聚集成團（3分）；⑤ 大量炎癥細胞聚集成團（4分）。由兩位病理科醫生進行盲法閱片，每組測定≥25個氣道。
1.2.6 肺組織病理學切片氣道黏液物質AB-PAS染色圖像分析
各組小鼠肺組織切片，阿爾新藍染色液染色15 min（避光），置入過碘酸溶液氧化5 min，水洗，放入Schiff Reagent浸染20 min，流動自來水沖洗10 min，蘇木素染細胞核，酸性分化液分化，滴入Scott藍化液返藍，逐級乙醇溶液浸泡脫水，二甲苯溶液透明，中性樹膠封片。AB-PAS染色著色后酸性黏液物質或細胞呈藍色，中性黏液物質或細胞呈紅色，混合黏液物質或細胞呈紫紅色。染色后的肺組織病理學切片，采用Leica顯微鏡DFC295彩圖系統，相同光學條件相同倍數下采圖，每張切片隨機選擇5個直徑約70 μm完整氣道，應用Image-proplus6.0圖像分析軟件，獲得各組每張圖片陽性染色面積。
1.2.7 免疫組織化學檢測肺組織MUC5ac、NLRP3、Caspase-1蛋白表達情況
各組肺組織切片常規脫蠟、水化，采用過氧化氫（濃度為3%）將內源性氧化酶去除，高壓修復抗原，按試劑盒說明書封閉特異性抗體、加入一抗、二抗及顯色，高倍鏡下觀察染色呈淡黃色、黃色及棕黃色染色為陽性細胞。采用Leica顯微鏡DFC295彩圖系統，相同光學條件不同倍數下采圖，每張切片隨機選擇5個直徑約70 μm完整氣道，應用Image-proplus6.0圖像分析軟件以積分光密度及區域為指標，計算平均積分光密度值。
1.2.8 qRT-PCR 檢測肺組織MUC5ac、NLRP3、Caspase-1相對mRNA水平
各組肺組織放至冰上解凍，然后經勻漿、乳糜、沉淀、洗滌、溶解后，提取總RNA；ND-1000核酸蛋白測量儀檢測RNA純度和濃度，用逆轉錄試劑盒10 μL反應體系，將mRNA逆轉錄成cDNA；各組樣本采用SYBRGreenⅡ嵌合熒光法，根據相同反應體系、不同反應條件，進行cDNA擴增qRT-PCR反應。Muc5ac、Caspase-1、NLRP3及內參β-actin引物序列數如下：Muc5ac、Caspase-1、NLRP3及內參β-actin引物序列數如下：Muc5ac–F 5′-ACCAGTGTGAGAAGCACCAG-3′，Muc5ac–R 5′-ATGGTACACAGCACAGGTCG-3′；Caspase-1–F 5′-TGCTGGAGGATCTGGGGTAT-3′，Caspase-1–R 5′-GGCAGGCAGCAAATTCTTTCA-3′；NLRP3–F 5′-TCCCAGACACTCATGTTGCC-3′，NLRP3–R 5′-GTCCAGTTCAGTGAGGCTCC-3′；β-actin-F 5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，β-actin-R 5′-TGATGTCACGCACGATTTCC-3′。各組標本擴增效率尚可，融解曲線目的基因融解峰值基本一致，無引物二聚體及非特異擴增峰。樣本反應結束后得出各自Ct值(thresholdcycle)，最后采用2–△△Ct法進行相對定量mRNA表達情況。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0統計軟件。根據資料的屬性對各組數據進行統計學比較時采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。單因素方差分析有差異者，采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組小鼠行為學改變
AS組小鼠激發現出豎毛、抓耳撓腮、呼吸急促或躁動不安等一種或多種癥狀；MCC950干預組及Dex組上述癥狀明顯減少；NS組無上述表現。
2.2 各組小鼠BALF總細胞數計數及瑞士–吉姆薩染色白細胞分類計數
AS組BALF總細胞計數、嗜酸性粒細胞百分比較NS組增高（P<0.05）；ML組、MH組及Dex組BALF總細胞計數、嗜酸性粒細胞百分比較AS組降低（P<0.05），ML組、MH組總細胞計數、嗜酸性粒細胞百分比較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標的組間差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1。
表1
各組小鼠BALF細胞總數及白細胞分類計數的變化［（
），n=8］
2.3 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-18濃度的變化
AS組BALF中IL-1β、IL-18濃度較NS組增高（P<0.05），ML組、MH組及Dex組BALF中IL-1β、IL-18濃度較AS組減少（P<0.05），ML組及MH組BALF中IL-1β、IL-18濃度較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標的組間差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表2。
表2
各組小鼠BALF中IL-1β、IL-18濃度的變化［pg/mL，（
），n=8］
2.4 各組小鼠肺組織病理學切片HE染色圖像分析
AS組支氣管周圍炎癥細胞浸潤評分較NS增高（P<0.05），ML組、MH組及Dex組支氣管周圍炎癥細胞浸潤評分較AS組減低（P<0.05），MH組支氣管周圍炎癥細胞浸潤評分較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標組間差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表3、圖1。
表3
各組小鼠支氣管周圍炎癥細胞浸潤病理評分的比較［（
），n=8］
圖1
小鼠肺組織病理像（HE×200）
a. NS組：氣道上皮細胞排列整齊，氣管及肺血管周圍少量炎癥細胞浸潤；b. AS組：氣道大量黏液堵塞，氣管及肺血管周圍大量炎性細胞浸潤；c. ML組、d. MH組及e. Dex組：管腔通暢，氣道周圍少量炎性細胞浸潤。
2.5 各組小鼠肺組織病理學切片氣道黏液物質AB-PAS染色圖像分析
AS組氣道黏液陽性相對面積較NS組升高（P<0.05），ML組、MH組及Dex組氣道黏液陽性相對面積較AS組減少（P<0.05），ML組、MH組氣道黏液陽性相對面積較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標組間差異無統計學意義（P>0.05）。結果詳見表4、圖2。
表4
各組小鼠氣道組織黏液物質陽性對著色面積的比較［（
），n=8］
圖2
小鼠肺組織病理像（AB-PAS×200）
a. NS組：氣道中極少杯狀細胞，未見黏液分泌；b. AS組：氣道中杯狀細胞增生明顯，大量黏液分堵塞氣道；c. ML組、d. MH組及e. Dex組：管腔通暢，氣道中少量杯狀細胞，黏液分泌較少。
2.6 各組小鼠支氣管肺組織氣道Muc5ac、Caspase-1、NLRP3蛋白表達水平變化
AS組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3蛋白表達水平較NS組升高，ML組、MH組及Dex組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3蛋白表達水平較AS組減少（P<0.05），ML組及MH組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3蛋白表達水平較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。
圖3
小鼠肺組織MUC5ac、Caspase-1、NLRP3免疫組織化學染色結果（×200）
AS組小鼠肺組織中MUC5ac、Caspase-1、NLRP3的表達呈強陽性，NS組表達較弱；不同劑量MCC950及地塞米松干預后上述蛋白的表達強度較AS組進一步減弱。
2.7 各組小鼠肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3相對mRNA表達量的變化
AS組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3相對mRNA表達量較NS組增高（P<0.05），ML組、MH組及Dex組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3相對mRNA表達量較AS組降低（P<0.05），ML組及MH組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3相對mRNA表達量較Dex組較增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標的組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。
圖4
各組小鼠肺組織相對mRNA表達量的變化
a. Caspase-1；b.NLRP3；c. Muc5ac。*表示與NS組比較，#表示與AS組比較，Δ表示與ML組比較，^表示與MH組比較。與正常對照組比較，
3 討論
哮喘是由多種細胞和細胞組份共同參與的一種慢性氣道炎癥，表現出不同的炎癥表型和臨床表型，具有異質性。哮喘的發病機制尚未完全闡明，涉及多種炎癥細胞、結構細胞、炎癥介質、細胞因子多種細胞信號轉導通路與調節機制。本研究觀察發現，AS組小鼠行為學上出現毛發豎立、抓耳撓腮、呼吸頻率增快、煩躁不安等癥狀；AS組小鼠氣道炎癥和黏液分泌較NS組明顯升高，表現為BALF總細胞計數、EOS百分比升高，肺組織切片HE染色見大量炎癥細胞浸潤，AB-PAS染色見氣道黏液分泌明顯增多，甚至阻塞管腔以及肺組織免疫組化Muc5ac表達、肺組織Muc5ac的mRNA表達量升高，具備典型哮喘氣道炎癥及黏液高分泌特征。本研究采用腹腔注射聯合多部位（頸部、雙側大腿根部）皮下注射的改進方法致敏，該哮喘小鼠模型的成功建立得益于課題組多年來對構建哮喘小鼠模型的探索[5]。NLRP3炎癥小體主要由NLRP3、含有半胱天冬酶募集結構域凋亡相關斑點樣蛋白和半胱天冬氨酸酶-1前體（pro-caspase-1）構成。NLRP3炎癥小體的成功激活需要兩個步驟：先啟動，再激活，啟動的關鍵是核轉錄因子-κB介導NLRP3和pro-IL-1β的轉錄，而激活需要多種分子模式的有效刺激[6-7]。研究顯示，過敏原吸入會促進哮喘小鼠氣道激活NLRP3炎癥小體，增加IL-1β及IL-18釋放[8-9]。2018年Kim等[10]通過細胞培養研究相繼發現，重疊危險信號激活NLRP3炎癥小體通過信號通路誘導氣道上皮細胞產生Muc5ac。2019年，Tan等[11]發現過敏性哮喘模型中，炎癥小體相關分子如Caspase-1和IL-1β表達增加，Muc5ac在嗜酸性粒細胞表型中上調。本研究顯示，與NS組相比，AS組小鼠肺組織NLRP3及Caspase-1蛋白表達水平升高（P<0.05），肺組織NLRP3及Caspase-1的mRNA表達量升高（P<0.05），BALF中IL-18及IL-1β濃度升高（P<0.05），提示NLRP3炎癥小體及下游促炎因子IL-18、IL-1β參與哮喘的慢性炎癥發生發展，并發揮作用。
MCC950是目前作用最強的NLRP3炎癥小體拮抗劑，主要通過抑制NLRP3炎癥小體激活階段進行調控。惠超等[12]通過用NLRP3敲除哮喘小鼠進行對比實驗，發現與NLRP3-野生組相比，NLRP3敲除組肺組織炎癥評分、BALF中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞計數及IL-1β、IL-18含量，肺組織中NLRP3、caspase-1的表達水均較低（P<0.05）。在急性肺損傷、塵肺及病毒感染小鼠模型中，MCC950降低肺組織NLRP3蛋白的表達及Caspase-1的自身激活，抑制炎癥介質IL-1β和IL-18表達，從而減輕肺部炎癥反應和纖維化[13-18]。Chen等[19]在中性粒細胞哮喘小鼠實驗中發現，MCC950阻斷NLRP3的激活及caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達，同時顯著緩解氣道高反應性、氣道炎癥及Muc5ac表達。Hu等[20]用蟑螂致敏哮喘小鼠模型，發現MCC950抑制炎癥小體，減弱了過敏性氣道炎癥和Muc5ac表達。本研究顯示，在OVA致敏哮喘小鼠模型中，與AS組相比，ML組及MH組小鼠肺組織Muc5ac、NLRP3及Caspase-1蛋白表達水平降低（P<0.05），mRNA表達量降低（P<0.05），BALF中IL-18及IL-1β濃度降低（P<0.05）；與AS組相比，ML組及MH組小鼠BALF總細胞計數、嗜酸性粒細胞百分比、支氣管周圍炎癥細胞浸潤、氣道黏液陽性相對面積減輕；提示MCC950干預可抑制氣道NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表達，下調氣道粘蛋白Muc5ac，減輕氣道炎癥及氣道黏液高分泌。但目前關于NLRP3炎性小體與MUC5ac表達水平的關系及其機制的研究較少，需要更多的基礎實驗及臨床研究進一步證實。
糖皮質激素是臨床治療哮喘的主要藥物之一，地塞米松在哮喘患者的療效評價及哮喘小鼠實驗研究數據中，表現出較好的抗炎作用。但由于地塞米松不良反應較多，部分患者存在糖皮質激素抵抗，所以新藥的探索及研究具有重要意義。本次實驗中還發現，MCC950劑量組與低劑量組組間差異無統計學意義，很難評價高低濃度的優劣性，但MCC950曾被報道較重的肝臟毒性[21]，高劑量使用時更應關注這一點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種細胞以及細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病。我國約有4570萬哮喘患者[1]，其發病率及死亡率仍逐年上升[2]，重癥哮喘不斷增加，帶來了巨大的經濟負擔[3]。研究發現，NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3）炎癥小體異常激活參與哮喘、慢阻肺等氣道慢性炎癥反應[4]，且與氣道黏蛋白5ac（Muc5ac）的高表達有密切關系，而氣道Muc5ac高分泌是評估哮喘病情嚴重程度及預后的獨立危險因素。本研究旨在觀察NLRP3炎癥小體拮抗劑MCC950干預對哮喘小鼠氣道Muc5ac水平的影響，探討NLRP3炎癥小體在哮喘氣道黏液高分泌中的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
無特定病原體級的雌性BALB/c小鼠50只，體重（18±2）g，6～8周齡。動物實驗經遵義醫學院動物實驗委員會批準，倫理審查編號：KLLY(A)-2021-129。
1.1.2 試劑
雞卵清白蛋白（Ⅴ級，美國Sigma公司），氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司），MCC950（美國MedchemExpess公司），阿爾新藍–碘酸雪夫（Alcian blue-periodic acid Schiff base，AB-PAS）染色試劑盒（北京索來寶生物技術有限公司），白細胞介素（interluekin，IL）-18及IL-18的酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海江萊生物技術有限公司），小鼠抗小鼠-MUC5ac單克隆抗體、NLRP3單克隆抗體、Caspase-1單克隆抗體，山羊抗兔、抗小鼠IgG辣根過氧化物酶及二氨基聯苯胺顯色試劑盒（英國Abcam公司），免疫組織化學通用型二步法檢測試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司），RNAiso Reagent、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒、RT-PCR引物［MUC5ac、NLRP3、Caspase-1、β肌動蛋白（β-actin），大連TaKaRa公司］。
1.1.3 儀器
壓縮霧化器 L2160003（中國魚躍醫療），電子分析天平（德國賽多利思公司，感量：0.1 mg），高速冷凍離心機（美國貝克曼公司），Multiskan spectrum酶標儀（美國Thermo scientific公司），光學顯微鏡（日本NIKON公司），核酸蛋白測量儀ND-1000（美國Nanodrop公司），CFX96熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）。
1.2 方法
1.2.1 動物分組、哮喘模型制備及干預方法
50只雌性BALB/c小鼠，隨機分為正常對照組（NS組）、哮喘組（AS組）、MCC950低劑量干預組（ML組）、MCC950高劑量干預組（MH組）及地塞米松組（Dex組），每組10只。采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏及激發建立哮喘模型。AS組在實驗第1天和第13天腹腔注射40 μg OVA+1 mg氧化鋁凝膠溶液、頸部皮下注射20 μg OVA+1 mg氫氧化鋁凝膠溶液及雙側大腿根部皮下分別注射10 μg OVA+1 mg氫氧化鋁凝膠溶液注射致敏，第19～23天，將小鼠置于自制的密閉透明的霧化箱中，予10% OVA生理鹽水溶液霧化吸入激發，1次/d，每次30 min；NS組用磷酸鹽緩沖液腹腔聯合皮下注射，以生理鹽水霧化吸入；L組激發前30 min腹腔注射MCC950 10 mg/kg（隔日注射、共3次），MH組激發前30 min 連續5 d腹腔注射MCC950 10 mg/kg，Dex組激發前30 min連續5 d腹腔注射地塞米松0.2 mL，其余方法同AS組。
1.2.2 標本采集
各組小鼠于末次激發24 h后麻醉、固定并處死，開胸取右肺組織，右上葉和中葉肺組織置入EP管，保存于–80 ℃冰箱用于RNA提取；取其余兩葉肺組織放入4%多聚甲醛固定24 h，常規漂洗脫水，石蠟包埋，切片。頸部氣管充分暴露，作“V”型切口將留置針插入氣管，緩慢注入磷酸鹽緩沖液0.3 mL于肺內，回抽灌洗液，灌洗3次，每次回收0.25～0.3 mL，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）置于EP管中，先取10 μL行總細胞計數，其余BALF離心后沉淀物涂片行瑞士–吉姆薩染色行白細胞分類計數，上清液行ELISA檢測。
1.2.3 BALF總細胞計數及瑞士–吉姆薩染色白細胞分類計數
各組小鼠新鮮BALF 10 μL經破紅細胞膜處理后滴在細胞計數板上，覆蓋蓋玻片，在低倍鏡下計數4個大方格（16個小方格），原則“弓”字形計數，計算公式為細胞總數=n/4×104/L（n=四個大方里的細胞數總和）；其余BALF離心后沉淀物涂片，在檢驗科自動染片機上行瑞士–吉姆薩染色，每張涂片油鏡下“弓”字形分類計數200個白細胞，并計算出每組嗜酸粒細胞、單核細胞、中性粒細胞所占百分比。
1.2.4 ELISA檢測BALF中IL-18、IL-1β濃度
各組小鼠BALF離心后上清液行ELISA檢測。按試劑盒說明操作各個步驟，最后用酶標儀在490 nm處讀取吸光度值，計算BALF中IL-18、IL-1β濃度。使用ELISAcalc軟件，以標準濃度為X軸，對應的OD值為Y軸，繪制出標準品的線性回歸線。以Y值計算X值，再乘以稀釋倍數，得出對應的濃度，單位為pg/mL。
1.2.5 肺組織病理學切片蘇木精–伊紅染色圖像分析
各組小鼠肺組織切片，常規石蠟及梯度乙醇脫水，蘇木素染液染5 min后自來水沖洗，鹽酸酒精分化5 min后再次用自來水沖洗，靜置返藍10 min，再次梯度乙醇脫水，二甲苯透明5 min，自然干燥后中性樹膠封片。每只小鼠選取3張肺組織切片行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后在普通光學顯微鏡下觀察，根據支氣管周圍炎癥細胞浸潤情況評分，判斷標準：① 無炎癥細胞（0分）；② 少許炎癥細胞（1分）；③ 較多分布不均炎癥細胞（2分）；④ 大量炎癥細胞，分布較均勻，少見聚集成團（3分）；⑤ 大量炎癥細胞聚集成團（4分）。由兩位病理科醫生進行盲法閱片，每組測定≥25個氣道。
1.2.6 肺組織病理學切片氣道黏液物質AB-PAS染色圖像分析
各組小鼠肺組織切片，阿爾新藍染色液染色15 min（避光），置入過碘酸溶液氧化5 min，水洗，放入Schiff Reagent浸染20 min，流動自來水沖洗10 min，蘇木素染細胞核，酸性分化液分化，滴入Scott藍化液返藍，逐級乙醇溶液浸泡脫水，二甲苯溶液透明，中性樹膠封片。AB-PAS染色著色后酸性黏液物質或細胞呈藍色，中性黏液物質或細胞呈紅色，混合黏液物質或細胞呈紫紅色。染色后的肺組織病理學切片，采用Leica顯微鏡DFC295彩圖系統，相同光學條件相同倍數下采圖，每張切片隨機選擇5個直徑約70 μm完整氣道，應用Image-proplus6.0圖像分析軟件，獲得各組每張圖片陽性染色面積。
1.2.7 免疫組織化學檢測肺組織MUC5ac、NLRP3、Caspase-1蛋白表達情況
各組肺組織切片常規脫蠟、水化，采用過氧化氫（濃度為3%）將內源性氧化酶去除，高壓修復抗原，按試劑盒說明書封閉特異性抗體、加入一抗、二抗及顯色，高倍鏡下觀察染色呈淡黃色、黃色及棕黃色染色為陽性細胞。采用Leica顯微鏡DFC295彩圖系統，相同光學條件不同倍數下采圖，每張切片隨機選擇5個直徑約70 μm完整氣道，應用Image-proplus6.0圖像分析軟件以積分光密度及區域為指標，計算平均積分光密度值。
1.2.8 qRT-PCR 檢測肺組織MUC5ac、NLRP3、Caspase-1相對mRNA水平
各組肺組織放至冰上解凍，然后經勻漿、乳糜、沉淀、洗滌、溶解后，提取總RNA；ND-1000核酸蛋白測量儀檢測RNA純度和濃度，用逆轉錄試劑盒10 μL反應體系，將mRNA逆轉錄成cDNA；各組樣本采用SYBRGreenⅡ嵌合熒光法，根據相同反應體系、不同反應條件，進行cDNA擴增qRT-PCR反應。Muc5ac、Caspase-1、NLRP3及內參β-actin引物序列數如下：Muc5ac、Caspase-1、NLRP3及內參β-actin引物序列數如下：Muc5ac–F 5′-ACCAGTGTGAGAAGCACCAG-3′，Muc5ac–R 5′-ATGGTACACAGCACAGGTCG-3′；Caspase-1–F 5′-TGCTGGAGGATCTGGGGTAT-3′，Caspase-1–R 5′-GGCAGGCAGCAAATTCTTTCA-3′；NLRP3–F 5′-TCCCAGACACTCATGTTGCC-3′，NLRP3–R 5′-GTCCAGTTCAGTGAGGCTCC-3′；β-actin-F 5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，β-actin-R 5′-TGATGTCACGCACGATTTCC-3′。各組標本擴增效率尚可，融解曲線目的基因融解峰值基本一致，無引物二聚體及非特異擴增峰。樣本反應結束后得出各自Ct值(thresholdcycle)，最后采用2–△△Ct法進行相對定量mRNA表達情況。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0統計軟件。根據資料的屬性對各組數據進行統計學比較時采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。單因素方差分析有差異者，采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組小鼠行為學改變
AS組小鼠激發現出豎毛、抓耳撓腮、呼吸急促或躁動不安等一種或多種癥狀；MCC950干預組及Dex組上述癥狀明顯減少；NS組無上述表現。
2.2 各組小鼠BALF總細胞數計數及瑞士–吉姆薩染色白細胞分類計數
AS組BALF總細胞計數、嗜酸性粒細胞百分比較NS組增高（P<0.05）；ML組、MH組及Dex組BALF總細胞計數、嗜酸性粒細胞百分比較AS組降低（P<0.05），ML組、MH組總細胞計數、嗜酸性粒細胞百分比較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標的組間差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1。
表1
各組小鼠BALF細胞總數及白細胞分類計數的變化［（），n=8］
2.3 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-18濃度的變化
AS組BALF中IL-1β、IL-18濃度較NS組增高（P<0.05），ML組、MH組及Dex組BALF中IL-1β、IL-18濃度較AS組減少（P<0.05），ML組及MH組BALF中IL-1β、IL-18濃度較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標的組間差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表2。
表2
各組小鼠BALF中IL-1β、IL-18濃度的變化［pg/mL，（），n=8］
2.4 各組小鼠肺組織病理學切片HE染色圖像分析
AS組支氣管周圍炎癥細胞浸潤評分較NS增高（P<0.05），ML組、MH組及Dex組支氣管周圍炎癥細胞浸潤評分較AS組減低（P<0.05），MH組支氣管周圍炎癥細胞浸潤評分較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標組間差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表3、圖1。
表3
各組小鼠支氣管周圍炎癥細胞浸潤病理評分的比較［（），n=8］
圖1
小鼠肺組織病理像（HE×200）
a. NS組：氣道上皮細胞排列整齊，氣管及肺血管周圍少量炎癥細胞浸潤；b. AS組：氣道大量黏液堵塞，氣管及肺血管周圍大量炎性細胞浸潤；c. ML組、d. MH組及e. Dex組：管腔通暢，氣道周圍少量炎性細胞浸潤。
2.5 各組小鼠肺組織病理學切片氣道黏液物質AB-PAS染色圖像分析
AS組氣道黏液陽性相對面積較NS組升高（P<0.05），ML組、MH組及Dex組氣道黏液陽性相對面積較AS組減少（P<0.05），ML組、MH組氣道黏液陽性相對面積較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標組間差異無統計學意義（P>0.05）。結果詳見表4、圖2。
表4
各組小鼠氣道組織黏液物質陽性對著色面積的比較［（），n=8］
圖2
小鼠肺組織病理像（AB-PAS×200）
a. NS組：氣道中極少杯狀細胞，未見黏液分泌；b. AS組：氣道中杯狀細胞增生明顯，大量黏液分堵塞氣道；c. ML組、d. MH組及e. Dex組：管腔通暢，氣道中少量杯狀細胞，黏液分泌較少。
2.6 各組小鼠支氣管肺組織氣道Muc5ac、Caspase-1、NLRP3蛋白表達水平變化
AS組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3蛋白表達水平較NS組升高，ML組、MH組及Dex組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3蛋白表達水平較AS組減少（P<0.05），ML組及MH組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3蛋白表達水平較Dex組增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。
圖3
小鼠肺組織MUC5ac、Caspase-1、NLRP3免疫組織化學染色結果（×200）
AS組小鼠肺組織中MUC5ac、Caspase-1、NLRP3的表達呈強陽性，NS組表達較弱；不同劑量MCC950及地塞米松干預后上述蛋白的表達強度較AS組進一步減弱。
2.7 各組小鼠肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3相對mRNA表達量的變化
AS組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3相對mRNA表達量較NS組增高（P<0.05），ML組、MH組及Dex組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3相對mRNA表達量較AS組降低（P<0.05），ML組及MH組肺組織Muc5ac、Caspase-1、NLRP3相對mRNA表達量較Dex組較增高（P<0.05），ML組與MH組比較，上述指標的組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。
圖4
各組小鼠肺組織相對mRNA表達量的變化
a. Caspase-1；b.NLRP3；c. Muc5ac。*表示與NS組比較，#表示與AS組比較，Δ表示與ML組比較，^表示與MH組比較。與正常對照組比較，
3 討論
哮喘是由多種細胞和細胞組份共同參與的一種慢性氣道炎癥，表現出不同的炎癥表型和臨床表型，具有異質性。哮喘的發病機制尚未完全闡明，涉及多種炎癥細胞、結構細胞、炎癥介質、細胞因子多種細胞信號轉導通路與調節機制。本研究觀察發現，AS組小鼠行為學上出現毛發豎立、抓耳撓腮、呼吸頻率增快、煩躁不安等癥狀；AS組小鼠氣道炎癥和黏液分泌較NS組明顯升高，表現為BALF總細胞計數、EOS百分比升高，肺組織切片HE染色見大量炎癥細胞浸潤，AB-PAS染色見氣道黏液分泌明顯增多，甚至阻塞管腔以及肺組織免疫組化Muc5ac表達、肺組織Muc5ac的mRNA表達量升高，具備典型哮喘氣道炎癥及黏液高分泌特征。本研究采用腹腔注射聯合多部位（頸部、雙側大腿根部）皮下注射的改進方法致敏，該哮喘小鼠模型的成功建立得益于課題組多年來對構建哮喘小鼠模型的探索[5]。NLRP3炎癥小體主要由NLRP3、含有半胱天冬酶募集結構域凋亡相關斑點樣蛋白和半胱天冬氨酸酶-1前體（pro-caspase-1）構成。NLRP3炎癥小體的成功激活需要兩個步驟：先啟動，再激活，啟動的關鍵是核轉錄因子-κB介導NLRP3和pro-IL-1β的轉錄，而激活需要多種分子模式的有效刺激[6-7]。研究顯示，過敏原吸入會促進哮喘小鼠氣道激活NLRP3炎癥小體，增加IL-1β及IL-18釋放[8-9]。2018年Kim等[10]通過細胞培養研究相繼發現，重疊危險信號激活NLRP3炎癥小體通過信號通路誘導氣道上皮細胞產生Muc5ac。2019年，Tan等[11]發現過敏性哮喘模型中，炎癥小體相關分子如Caspase-1和IL-1β表達增加，Muc5ac在嗜酸性粒細胞表型中上調。本研究顯示，與NS組相比，AS組小鼠肺組織NLRP3及Caspase-1蛋白表達水平升高（P<0.05），肺組織NLRP3及Caspase-1的mRNA表達量升高（P<0.05），BALF中IL-18及IL-1β濃度升高（P<0.05），提示NLRP3炎癥小體及下游促炎因子IL-18、IL-1β參與哮喘的慢性炎癥發生發展，并發揮作用。
MCC950是目前作用最強的NLRP3炎癥小體拮抗劑，主要通過抑制NLRP3炎癥小體激活階段進行調控。惠超等[12]通過用NLRP3敲除哮喘小鼠進行對比實驗，發現與NLRP3-野生組相比，NLRP3敲除組肺組織炎癥評分、BALF中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞計數及IL-1β、IL-18含量，肺組織中NLRP3、caspase-1的表達水均較低（P<0.05）。在急性肺損傷、塵肺及病毒感染小鼠模型中，MCC950降低肺組織NLRP3蛋白的表達及Caspase-1的自身激活，抑制炎癥介質IL-1β和IL-18表達，從而減輕肺部炎癥反應和纖維化[13-18]。Chen等[19]在中性粒細胞哮喘小鼠實驗中發現，MCC950阻斷NLRP3的激活及caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達，同時顯著緩解氣道高反應性、氣道炎癥及Muc5ac表達。Hu等[20]用蟑螂致敏哮喘小鼠模型，發現MCC950抑制炎癥小體，減弱了過敏性氣道炎癥和Muc5ac表達。本研究顯示，在OVA致敏哮喘小鼠模型中，與AS組相比，ML組及MH組小鼠肺組織Muc5ac、NLRP3及Caspase-1蛋白表達水平降低（P<0.05），mRNA表達量降低（P<0.05），BALF中IL-18及IL-1β濃度降低（P<0.05）；與AS組相比，ML組及MH組小鼠BALF總細胞計數、嗜酸性粒細胞百分比、支氣管周圍炎癥細胞浸潤、氣道黏液陽性相對面積減輕；提示MCC950干預可抑制氣道NLRP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β的表達，下調氣道粘蛋白Muc5ac，減輕氣道炎癥及氣道黏液高分泌。但目前關于NLRP3炎性小體與MUC5ac表達水平的關系及其機制的研究較少，需要更多的基礎實驗及臨床研究進一步證實。
糖皮質激素是臨床治療哮喘的主要藥物之一，地塞米松在哮喘患者的療效評價及哮喘小鼠實驗研究數據中，表現出較好的抗炎作用。但由于地塞米松不良反應較多，部分患者存在糖皮質激素抵抗，所以新藥的探索及研究具有重要意義。本次實驗中還發現，MCC950劑量組與低劑量組組間差異無統計學意義，很難評價高低濃度的優劣性，但MCC950曾被報道較重的肝臟毒性[21]，高劑量使用時更應關注這一點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
