引用本文： 劉碧翠, 李奎, 丁飛, 胡莉麗, 羅永霄, 劉春濤. 支氣管擴張氣道細菌微生物組學及與臨床特征的相關性研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(5): 311-318. doi: 10.7507/1671-6205.202209060 復制
支氣管擴張（簡稱支擴）以不可逆轉的一個或多個支氣管擴張異常破壞和持續擴張為特征，導致氣道黏液間歇或持久的分泌以及細菌的持續定植和反復感染，形成氣道阻塞、炎癥和組織破壞的惡性循環[1]。支擴患者急性加重的癥狀有發熱、膿痰、呼吸困難[2]，頻繁加重會導致肺功能和生活質量顯著下降[3]。利用傳統的細菌培養技術檢測到支擴患者氣道常見細菌為流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌 [4]。然而，相當比例的患者即使咯膿性痰，痰培養也未能分離出任何病原菌。基于非培養基礎的16S rRNA基因檢測可以有效繞開微生物的純培養過程，具有快速、準確、高效的優點，也可以從相同的標本中檢測出更多種類的微生物[5]。
在既往的支擴患者氣道細菌微生物組學的變化特點的研究中，有結果不支持患者病情加重是由某一種細菌過度生長所導致[1]，有結果顯示急性加重期和穩定期及治療前后氣道的細菌微生物組學變化不明顯[5-6]，也有研究表明支擴氣道細菌微生態構成比的改變與肺功能及病情嚴重程度有關[7]。總之支擴患者氣道微生物的結構和動態改變影響患者的臨床狀態和疾病進程仍沒有統一的定論，故本研究假設支擴患者氣道微生態的構成特點與其臨床特征有一定的相關性，應用16S rRNA基因高通量測序技術結合傳統細菌培養對支擴患者的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）行檢測及對比分析，比較了支擴患者與對照組氣道細菌微生物組學的區別，以了解支擴患者氣道微生物的構成比和動態變化及其與病情加重的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
收集2017年10月—2018年4月華西醫院呼吸與危重癥醫學科門診經胸部高分辨CT確診的支擴患者，對照組為呼吸與危重癥醫學科門診因胸部小結節行支氣管鏡檢查的患者。支擴的診斷標準：（1）支氣管內腔直徑大于伴發肺動脈內腔直徑；（2）外周支氣管無逐漸變細的特點；（3）在胸膜表面1 cm內可見周圍支氣管[8]。
支擴組納入標準：（1）年齡在18～70歲；（2）至少有咳嗽、咳痰、呼吸困難中的一種癥狀。排除標準：（1）4周內應用抗生素治療者；（2）4周內應用糖皮質激素治療者；（3）存在其他呼吸道疾病；（4）存在支氣管鏡檢查的禁忌證；⑤ 支擴繼發于肺間質纖維化。對照組納入標準：（1）年齡在18～70歲；（2）胸部單一小結節（病變直徑≤10 mm）行支氣管鏡檢查且病理學檢查結果陰性的患者。對照組排除標準：（1）4周內應用抗生素治療者；（2）4周內應用糖皮質激素治療者；（3）存在其他呼吸系統疾病。研究方案獲得四川大學華西醫院倫理委員會的審核并同意批準（批件號：2017年審299號）。在試驗前向所有受試對象解釋本試驗的目的、意義、測試項目、可能獲益及安全性，取得其同意并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 支擴患者急性加重期與穩定期的定義
目前尚無統一的支擴急性加重期定義，1994年Fuchs定義的支擴急性加重標準被普遍采用：（1）咳痰量增加；（2）新發生的咯血；（3）咳嗽增加；（4）呼吸困難加重；（5）萎靡、倦怠、嗜睡；（6）體溫>38 ℃；（7）厭食、體重下降；（8）副鼻竇疼痛或壓痛；（9）鼻腔分泌物增加；（10）胸部聽診啰音的發生改變；（11）肺功能中用力肺活量（forced vital capacity，FVC）或第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）下降10%；（12）胸部CT提示肺部感染。存在12個指標中的4項改變確定為急性加重，需要抗生素治療[9]。將在4周內無加重或無抗生素治療定義為支擴穩定期[6]。
1.2.2 收集受試者BALF
患者行支氣管鏡檢查前常規禁食、禁水8 h。操作者在操作前使用2%利多卡因對患者鼻咽部進行噴霧麻醉，心電血壓及脈搏血氧飽和度的監測，然后將支氣管鏡經鼻腔進入咽喉部，通過會厭及聲門，為避免上呼吸道分泌物的污染對結果產生影響，在此過程中禁止進行負壓吸引，動作輕柔、準確、快速，進入下呼吸道支氣管擴張的病變部位，在支氣管鏡成功楔入經胸部高分辨CT證實的病變支氣管后，注入室溫無菌生理鹽水（20 mL/次），灌洗液注入后，需立即負壓吸引回收BALF，直到總回收灌洗液約 60 mL后停止灌注。回收的灌洗液保存于無菌痰液收集管內，分裝一半立即送華西醫院檢驗科細菌室行細菌培養及藥敏檢查，剩余部分立即–80 ℃冰箱保存。對照組受試者檢查時，留取的標本為結節病變對側的下葉基底段支氣管BALF，留取方法同支擴患者。為了減少不同批次、不同檢測試劑、不同檢測深度帶來基因檢測的誤差，所有標本于2018年4月統一外送歐易生物公司檢測分析。
1.2.3 BALF細菌培養
BALF細菌選擇性培養基主要包括血瓊脂平板培養基和巧克力色血瓊脂平板培養基（鄭州安圖生物工程有限公司）。使用SPUTASOL將BALF均質化，并使用標準接種膠環將有意義的菌液接種至培養基上，然后將培養基置于含5%二氧化碳的37 ℃恒溫培養箱中隔夜培養，使得培養基中菌落數達到30～300 cfu。對培養陰性的培養基繼續進行培養，其后每天觀察細菌生長情況，觀察上限為4 d。
1.2.4 BALF標本16S rRNA基因測序及分析
本研究基因組DNA 的提取、 PCR 擴增及生物信息分析由上海歐易生物醫學科技有限公司開展完成。
1.2.4.1 16S rRNA基因測序
首先，應用Good’s Coverage指數（Good’s nonparametic Coverage Estimator）進行全部樣本的檢測深度檢驗。Good’s Coverage指數由Esty[10]提出，目的是反映測序深度，Good’s Coverage指數接近于 1，表明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種。隨后，采用DNA抽提試劑盒（Life Technologies公司，Cat.No.Q328520）對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，留取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，在進行樣品總RNA提取過程中，運用KAPA公司的HiFi Hot Start Ready Mix高保真酶進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。細菌多樣性鑒定對應區域：16S V3-V4區（前端引物343F序列：5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'和后端引物798R序列：5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）。PCR產物使用電泳檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并進行二輪PCR擴增、電泳檢測及磁珠純化，純化后對PCR產物進行Qubit定量。根據PCR產物濃度進行等量混樣，并上機測序。
1.2.4.2 生物信息分析
由Illumina Miseq測序得出原始數據。在微生物多樣性測序分析中，原始雙端測序數據經過一系列質控得到較優質的序列即有效序列（Valid tags）[11]，Valid tags進行操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）分類，挑選豐度最大的序列作為代表序列，與Silva數據庫（v123）進行比對后得到OTU分類表格。使用Trimmomatic軟件，采用滑動窗口法，對原始數據序列掃描，使用Flash軟件，將合格的雙端原始數據序列拼接，序列拼接時最大重疊為200 bp，得到完整配對結尾序列（Paired end序列）。使用Split_libraries軟件去除配對結尾序列中含有N堿基的序列，去除單堿基重復大于8的序列，去除長度小于200 bp的序列，得到高質量序列（Clean tags）。使用UCHIME軟件去除高質量序列中的嵌合體，最終得到用于OTU劃分的Valid tags。利用Shannon指數反映細菌的數量及分配的均勻性，以間接反映菌群的多樣性。菌群的差異性分析基于加權Unifrac距離算法的Heatmap差異性分析法。Heatmap差異性分析法是利用樣本兩兩交叉比較物種的多樣性，生成Heatmap圖，圖形方格的顏色代表交叉樣品兩兩之間的相異系數，相異系數越小表示物種多樣性的差異越小，顏色也越紅。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0統計軟件。用Kolmogorov-Smirnov方法測試連續變量的分布，正態分布用均值±標準差（
±s）表示，非正態分布用中位數（四分位數）表示。對于正態分布，采用獨立t檢驗或多因素方差分析，對于非正態分布采用非參數檢驗。分類數據以例數（百分比）表示，采用χ2檢驗。采用PAST（Paleontological statistics programme）V.2.16進行菌落相似性的Bray-Curtis定量指數分析，使用基于物種進化關系或數量距離矩陣的NMDS配合Anosim檢驗方法分析各組間微生物組Beta多樣性，采用XLSTAT程序進行Mantel檢驗。進行兩組數據的相關性分析時，若數據呈正態分布時按Pearson法進行直線相關性分析，若數據呈非正態分布時按Spearman法進行直線相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
收集了32例門診支擴的患者，以下患者被排除：7例就診前4周內接受過抗生素治療的患者，1例患者就診前4周內行全身糖皮質激素治療，1例患者無支擴相關癥狀，2例患者因不能耐受行支氣管鏡檢查， 3例患者拒絕行支氣管鏡檢查，1例患者未簽署本項研究的知情同意書。最終納入17例支擴患者并完成臨床試驗，按照Fuchs標準，其中8例為穩定期，9例為急性加重期。
6例因肺部磨玻璃結節行支氣管鏡檢查者作為對照組，留取其健側BALF。支擴組患者與對照組患者相比較，肺功能參數差異均有統計學意義（均P<0.001），其余基本情況無顯著差異。結果見表1。
表1
納入支擴患者與對照組患者基本參數特征［例（%）/（
）］
2.2 支擴患者臨床特點
在納入的支擴患者中，男性占47.1%，平均年齡為53.4歲，平均體重指數為20.9 kg/m2。其中有吸煙史的患者占23.5%，有飲酒史的患者占5.9%。支擴的病程中位數為10年。圣喬治評分為39.3分，萊切斯特咳嗽評分為12.3分，支氣管擴張嚴重指數為8.9分。FEV1%pred為58.2%±18.9%，FVC%pred為77.8%±16.5%，FEV1/FVC為62.6%±14.8%。7例（41.2%）患者BALF細菌培養呈陽性，其中5例為銅綠假單胞菌陽性，1例為流感嗜血桿菌，1例為肺炎克雷伯菌（表2）。影像學類型：囊狀支擴10例（58.8%），柱狀支擴6例（35.3%），靜脈曲張型支擴1例（5.9%），Reiff評分8.1分。
表2
支擴患者的BALF細菌培養結果與16S rRNA基因測序結果比較
2.3 全部樣本的檢測深度檢驗
所有樣本的Good’s Coverage指數值均接近1，說明本次檢測的深度已足夠覆蓋樣本中的全部物種，可信度高，具體結果見圖1。
圖1
全部檢測樣本的Good’s Coverage指數
D：對照組。P：支擴組。其中，支擴組有2例患者進行了2次測試，1例患者進行了3次測試。
2.4 支擴組與對照組Valid tags和OTU數量比較
所有樣本中共檢測出1383273個Valid tags，鑒定出1893類OTU，在質控之后的Clean tags數據量分布在33922～41907之間，Clean tags經過去除嵌合體得到Valid tags數據量分布在29137～38620之間，Valid tags平均長度分布在424.21～439.7 bp，各樣本OTU個數分布在282～792之間。
支擴患者的Valid tags數量為35542（31648～36495），對照組的Valid tags數量為35068（33959～35877），兩組間比較，差異無統計學意義（P=0.606）。支擴患者的OTU數量為390（321～470），對照組的OTU數量為412（385～435），兩組間比較，差異無統計學意義（P=0.840）。結果見圖2a、b。
圖2
支擴組與對照組生物信息分析
a. Valid tags數量對比；b. OTU數量對比；c. Shannon指數對比。
2.5 支擴組與對照組菌群的多樣性
支擴組與對照組Shannon指數分別為5.2、6.2，支擴組Shannon指數較對照組低，但差異無統計學意義（P=0.234），見圖2c。
2.6 支擴組細菌培養分類與對照組氣道細菌微生物組學特點比較
為進一步明確支擴患者氣道細菌微生物組學的特點，根據BALF細菌培養的結果，分為菌陽組（BALF細菌培養陽性）和菌陰組（BALF細菌培養陰性），并與對照組比較菌群構成比差別。
2.6.1 三組受試者的Valid tags和OTU數量對比分析
Valid tags、OTU數量差別可反映組間細菌的豐度和細菌的物種數。結果顯示菌陽組的Valid tags較菌陰組稍高，差異有統計學意義（P<0.05），而菌陰組和菌陽組的Valid tags與對照組比較，差異均無統計學意義（均P>0.05）；三組受試者之間兩兩對比，OTU數量差異均無統計學意義（均P>0.05）。結果見圖3a、b。
圖3
菌陽組、菌陰組與對照組生物信息分析
a. Valid tags數量比較；b. OTU數量比較；c. Shannon指數比較。
2.6.2 三組受試者的Shannon指數及與菌陽的相關性分析
結果顯示菌陽組、菌陰組、對照組平均Shannon指數分別為3.7、6.1、6.2，菌陽組較其他兩組顯著降低，差異有統計學意義（均P<0.001），而菌陰組與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），提示菌陽組的樣本中細菌物種數相對較少，物種分布的均勻性相對較低，而菌陰組與對照組樣本中細菌的種類相對較多，分布較均勻。結果見圖3c。支擴患者Shannon指數與菌陽的相關性分析結果顯示兩者呈負相關（r=?0.659，P=0.004），有統計學意義，其散點圖見圖4a。支擴患者Shannon指數預測細菌培養陽性的受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析結果顯示，ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）=0.833，P=0.015， Yonden指數J=0.74，當樣本Shannon指數≤4.5時對細菌培養陽性的預測敏感性為83.3%，特異性為90.9%，結果見圖4b。
2.6.3 支擴患者的BALF細菌培養結果與16S rRNA基因測序結果比較
表2中列出了基因測序的每個樣本中屬水平排名第一和第二的菌屬與細菌培養的結果，以便進行比對。細菌培養的結果提示5例銅綠假單胞菌，1例流感嗜血桿菌，1例肺炎克雷伯菌，以細菌培養的結果為基準，發現16S rRNA基因測序屬水平相對豐度第一的菌屬與細菌培養結果一致的有4例（57.1%），若結合相對豐度第二的菌屬一起比較與細菌培養結果一致的共有6例（85.7%）。
2.6.4 三組受試者的菌群的差異性分析
支擴菌陽組、菌陰組與對照組三組受試者的菌群的差異性分析見圖5，菌陰組的各個樣本與對照組的的各樣本交叉小方格總體顏色偏紅、黃，對應差異系數相對較小，表明菌陰組與對照組樣本物種多樣性的差異較小；而菌陽組內各個樣本間及與菌陰組、對照組各個樣本交叉小方格總體顏色偏綠、藍，對應差異系數相對較大，表明菌陽組內各樣本間及與菌陰組、對照組各樣本物種多樣性的差異較大。
2.7 支擴患者穩定期與急性加重期對比
2.7.1 支擴患者發生急性加重與Shannon指數的相關性
支擴患者急性加重期的患者樣本16S rRNA基因檢測Shannon指數顯著降低，提示支擴患者急性加重與Shannon指數之間存在一定的關聯，兩者呈負相關（r=?0.676，P=0.003），其散點圖見圖6a。Shannon指數預測支擴患者發生急性加重的ROC曲線分析結果顯示，AUC=0.875（P<0.001），Yonden指數J=0.78。當Shannon指數<5.0時預測支擴患者發生急性加重的敏感性為77.8%，特異性為100.0%，結果有統計學意義，具體見圖6b。
2.7.2 Shannon指數與炎癥指標的相關性分析
支擴患者急性加重期的患者樣本16S rRNA基因檢測Shannon指數顯著降低，提示支擴患者急性加重與Shannon指數之間呈負相關。進一步檢測Shannon指數與炎癥指標之間的相關性，發現Shannon指數與C反應蛋白呈負相關（r=?0.624，P=0.007），有統計學意義，詳細結果見圖7。Shannon指數與血白細胞計數進行相關性分析結果提示呈負相關，r=?0.434（P=0.082），無統計學意義。結果見圖8。
圖8
Shannon 指數與血白細胞計數相關性散點圖
3 討論
支擴的本質是氣道結構的改變引起氣道黏液的間歇或持久的分泌以及細菌的反復定植和感染，引起氣道炎癥、阻塞和組織破壞的惡性循環。目前關于支擴氣道菌群的研究相對較少，國外開展的相關研究結果一致性較低[12-14]，且目前針對中國支擴患者的氣道細菌微生物組學與其臨床特點的相關性研究報道較少。本研究報道了支擴患者與對照組氣道細菌微生物組學的差別，并分析了支擴患者急性加重期及穩定期氣道菌群微生物組學特點，以及Shannon指數與支擴患者BALF細菌培養陽性、炎癥指標、發生急性加重的相關性。
研究結果顯示，對照組的細菌分布與支擴患者在細菌豐度、菌群種類及多樣性方面無顯著差異，與文獻報道基本一致[12-13]。在其他慢性氣道疾病中關于氣道微生物組的研究結果不一，有研究表明慢性氣道疾病患者與對照組下呼吸道微生物菌群多樣性及菌群豐度存在一定的差異[14]，研究結果的差異可能與納排標準不統一、研究的病例數、樣本中細菌菌群多樣性個體差異較大以及留取的標本不一樣有關，不同研究用的標本分別有痰液、支氣管灌洗液、支氣管保護性毛刷等。之前的報道中尚未見支擴組與對照組的微生物組學特點對比研究，有待更多的研究數據來進一步證實我們的結果。
本研究還明確了對照組的菌群與支擴患者菌陰組和菌陽組的菌群差異。三組菌群特點對比分析結果顯示，菌陽組樣本中的細菌總量較菌陰組高，菌陰組與對照組細菌總量無顯著差異。Shannon指數反映細菌的數量及分配的均勻性綜合指標，間接反映菌群的多樣性，對比分析了三組樣本的Shannon指數，結果顯示菌陽組較其他兩組顯著降低，說明菌陽組的樣本中菌群分布的均勻性相對較低，多樣性較差，而菌陰組與對照組樣本中細菌的分布較均勻，且兩組之間的多樣性無顯著性差異。進一步分析支擴患者Shannon指數與BALF細菌培養菌陽的相關性，結果顯示兩者呈負相關，當樣本Shannon指數≤4.5時對菌陽的預測的敏感性為83.3%，特異性為90.9%，該結果可為臨床上常常出現細菌培養結果與肺部感染特征不相符或出現假陰性的現象提供更多參考信息。
本研究中，Heatmap 分析的結果也表明菌陰組與對照組各個樣本中物種多樣性的差異較小，而菌陽組的各個樣本間及與菌陰組、對照組物種多樣性的差異較大，提示支擴患者雖然有長期咳嗽、咳痰，甚至咳膿性痰，但樣本中細菌培養陰性的患者，其菌群特點與對照組無顯著差異，而菌陽組的菌群特點與上述兩組比較存在顯著差異，主要體現在菌陽組中菌群的多樣性較低、16S rRNA基因測序結果中屬水平排名第一細菌的相對豐度較高。這也解釋了本研究中對照組與支擴患者在細菌種類、菌群豐度、Shannon指數差異不大的原因，可能與對照組的微生物組學特征與菌陰組類似，而菌陰組在所有支擴患者中占了58.8%的比例，導致整體上出現陰性結果。
在本研究中對支擴患者的BALF細菌培養結果與16S rRNA基因測序結果進行了比較。細菌培養提示5例銅綠假單胞菌，1例流感嗜血桿菌，1例肺炎克雷伯菌，研究也證實支擴患者以銅綠假單胞菌感染為主[15]。我們以細菌培養的結果為對照標準，發現16S rRNA基因測序屬水平相對豐度第一的菌屬與細菌培養結果一致的有4例（57.1%），若結合排名第二的菌屬一起分析則與細菌培養結果一致的有6例（85.7%），兩者較為吻合，結果還表明BALF細菌培養的結果僅能代表有生長優勢的生物菌落，但不一定是細菌菌屬相對豐度第一的細菌，而且培養陽性的細菌不一定就是真正的致病菌，因為細菌在培養基中的生長繁殖速度及生長競爭能力存在一定的差異性，敏感度較低、生長緩慢、代謝不典型或需要特殊培養基的微生物、細菌本身某些生化反應不典型、菌體受到損傷、藥品生產過程干擾微生物的代謝均可影響鑒定準確性。而16S rRNA基因測序的分子生物學鑒定分型方法可以有效繞開微生物的培養過程，提供了樣本中的全部菌落的生物信息[16]，再結合細菌培養的結果一起分析，有可能為臨床醫生提供更多更準確的信息。
我們在研究中將支擴患者穩定期與急性加重期OTU數量、Valid tags數量、Shannon指數對比分析，結果顯示急性加重期Valid tags數量較穩定期高，提示平均細菌豐度較高；急性加重期Shannon指數值較穩定期低，表明急性加重期的支擴患者細菌的平均豐度更高、平均樣本分布均勻性較低，提示患者發生急性加重的主要原因可能是某一種細菌數量的增加引起整體菌群的分布不均勻引起，這與Whelan等[17]研究團隊的結果一致，但與Cox等[18]研究團隊的結果不一致。我們進一步分析Shannon指數與患者發生急性加重的相關性，結果顯示二者呈負相關。當Shannon指數<5.0時預測支擴患者發生急性加重敏感性為77.8%，特異性為100.0%。對Shannon指數與炎癥指標之間的相關性進行分析，結果提示Shannon指數與C反應蛋白呈負相關，說明Shannon指數可以作為炎癥指標的補充來反映機體的炎癥水平。
本研究特點尚存在以下不足：（1）由于篩選、入組患者困難，研究的對象數量偏少，可能影響統計效能；（2）研究對象縱向觀察時間較短；（3）單中心研究可能存在選擇性偏倚。但本研究首次將從對照組與支擴患者的微生物組特點進行對比，且采用BALF標本，較既往大多數研究采用口咽部標本更能反映下呼吸道的微生物組特征，此為本研究的優勢所在。鑒于病例搜集困難，需要進一步增加研究對象的數量、縱向觀察隨訪的時間及進行多中心同步研究。通過本研究發現16S rRNA基因測序結果中的Shannon指數對急性加重期有一定的預測價值，16S rRNA基因測序結合細菌培養結果，有助于指導臨床醫生提供更精準的治療方案。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
支氣管擴張（簡稱支擴）以不可逆轉的一個或多個支氣管擴張異常破壞和持續擴張為特征，導致氣道黏液間歇或持久的分泌以及細菌的持續定植和反復感染，形成氣道阻塞、炎癥和組織破壞的惡性循環[1]。支擴患者急性加重的癥狀有發熱、膿痰、呼吸困難[2]，頻繁加重會導致肺功能和生活質量顯著下降[3]。利用傳統的細菌培養技術檢測到支擴患者氣道常見細菌為流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌 [4]。然而，相當比例的患者即使咯膿性痰，痰培養也未能分離出任何病原菌。基于非培養基礎的16S rRNA基因檢測可以有效繞開微生物的純培養過程，具有快速、準確、高效的優點，也可以從相同的標本中檢測出更多種類的微生物[5]。
在既往的支擴患者氣道細菌微生物組學的變化特點的研究中，有結果不支持患者病情加重是由某一種細菌過度生長所導致[1]，有結果顯示急性加重期和穩定期及治療前后氣道的細菌微生物組學變化不明顯[5-6]，也有研究表明支擴氣道細菌微生態構成比的改變與肺功能及病情嚴重程度有關[7]。總之支擴患者氣道微生物的結構和動態改變影響患者的臨床狀態和疾病進程仍沒有統一的定論，故本研究假設支擴患者氣道微生態的構成特點與其臨床特征有一定的相關性，應用16S rRNA基因高通量測序技術結合傳統細菌培養對支擴患者的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）行檢測及對比分析，比較了支擴患者與對照組氣道細菌微生物組學的區別，以了解支擴患者氣道微生物的構成比和動態變化及其與病情加重的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
收集2017年10月—2018年4月華西醫院呼吸與危重癥醫學科門診經胸部高分辨CT確診的支擴患者，對照組為呼吸與危重癥醫學科門診因胸部小結節行支氣管鏡檢查的患者。支擴的診斷標準：（1）支氣管內腔直徑大于伴發肺動脈內腔直徑；（2）外周支氣管無逐漸變細的特點；（3）在胸膜表面1 cm內可見周圍支氣管[8]。
支擴組納入標準：（1）年齡在18～70歲；（2）至少有咳嗽、咳痰、呼吸困難中的一種癥狀。排除標準：（1）4周內應用抗生素治療者；（2）4周內應用糖皮質激素治療者；（3）存在其他呼吸道疾病；（4）存在支氣管鏡檢查的禁忌證；⑤ 支擴繼發于肺間質纖維化。對照組納入標準：（1）年齡在18～70歲；（2）胸部單一小結節（病變直徑≤10 mm）行支氣管鏡檢查且病理學檢查結果陰性的患者。對照組排除標準：（1）4周內應用抗生素治療者；（2）4周內應用糖皮質激素治療者；（3）存在其他呼吸系統疾病。研究方案獲得四川大學華西醫院倫理委員會的審核并同意批準（批件號：2017年審299號）。在試驗前向所有受試對象解釋本試驗的目的、意義、測試項目、可能獲益及安全性，取得其同意并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 支擴患者急性加重期與穩定期的定義
目前尚無統一的支擴急性加重期定義，1994年Fuchs定義的支擴急性加重標準被普遍采用：（1）咳痰量增加；（2）新發生的咯血；（3）咳嗽增加；（4）呼吸困難加重；（5）萎靡、倦怠、嗜睡；（6）體溫>38 ℃；（7）厭食、體重下降；（8）副鼻竇疼痛或壓痛；（9）鼻腔分泌物增加；（10）胸部聽診啰音的發生改變；（11）肺功能中用力肺活量（forced vital capacity，FVC）或第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）下降10%；（12）胸部CT提示肺部感染。存在12個指標中的4項改變確定為急性加重，需要抗生素治療[9]。將在4周內無加重或無抗生素治療定義為支擴穩定期[6]。
1.2.2 收集受試者BALF
患者行支氣管鏡檢查前常規禁食、禁水8 h。操作者在操作前使用2%利多卡因對患者鼻咽部進行噴霧麻醉，心電血壓及脈搏血氧飽和度的監測，然后將支氣管鏡經鼻腔進入咽喉部，通過會厭及聲門，為避免上呼吸道分泌物的污染對結果產生影響，在此過程中禁止進行負壓吸引，動作輕柔、準確、快速，進入下呼吸道支氣管擴張的病變部位，在支氣管鏡成功楔入經胸部高分辨CT證實的病變支氣管后，注入室溫無菌生理鹽水（20 mL/次），灌洗液注入后，需立即負壓吸引回收BALF，直到總回收灌洗液約 60 mL后停止灌注。回收的灌洗液保存于無菌痰液收集管內，分裝一半立即送華西醫院檢驗科細菌室行細菌培養及藥敏檢查，剩余部分立即–80 ℃冰箱保存。對照組受試者檢查時，留取的標本為結節病變對側的下葉基底段支氣管BALF，留取方法同支擴患者。為了減少不同批次、不同檢測試劑、不同檢測深度帶來基因檢測的誤差，所有標本于2018年4月統一外送歐易生物公司檢測分析。
1.2.3 BALF細菌培養
BALF細菌選擇性培養基主要包括血瓊脂平板培養基和巧克力色血瓊脂平板培養基（鄭州安圖生物工程有限公司）。使用SPUTASOL將BALF均質化，并使用標準接種膠環將有意義的菌液接種至培養基上，然后將培養基置于含5%二氧化碳的37 ℃恒溫培養箱中隔夜培養，使得培養基中菌落數達到30～300 cfu。對培養陰性的培養基繼續進行培養，其后每天觀察細菌生長情況，觀察上限為4 d。
1.2.4 BALF標本16S rRNA基因測序及分析
本研究基因組DNA 的提取、 PCR 擴增及生物信息分析由上海歐易生物醫學科技有限公司開展完成。
1.2.4.1 16S rRNA基因測序
首先，應用Good’s Coverage指數（Good’s nonparametic Coverage Estimator）進行全部樣本的檢測深度檢驗。Good’s Coverage指數由Esty[10]提出，目的是反映測序深度，Good’s Coverage指數接近于 1，表明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種。隨后，采用DNA抽提試劑盒（Life Technologies公司，Cat.No.Q328520）對樣本的基因組DNA進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，留取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，在進行樣品總RNA提取過程中，運用KAPA公司的HiFi Hot Start Ready Mix高保真酶進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。細菌多樣性鑒定對應區域：16S V3-V4區（前端引物343F序列：5'-TACGGRAGGCAGCAG-3'和后端引物798R序列：5'-AGGGTATCTAATCCT-3'）。PCR產物使用電泳檢測后使用磁珠純化，純化后作為二輪PCR模板，并進行二輪PCR擴增、電泳檢測及磁珠純化，純化后對PCR產物進行Qubit定量。根據PCR產物濃度進行等量混樣，并上機測序。
1.2.4.2 生物信息分析
由Illumina Miseq測序得出原始數據。在微生物多樣性測序分析中，原始雙端測序數據經過一系列質控得到較優質的序列即有效序列（Valid tags）[11]，Valid tags進行操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）分類，挑選豐度最大的序列作為代表序列，與Silva數據庫（v123）進行比對后得到OTU分類表格。使用Trimmomatic軟件，采用滑動窗口法，對原始數據序列掃描，使用Flash軟件，將合格的雙端原始數據序列拼接，序列拼接時最大重疊為200 bp，得到完整配對結尾序列（Paired end序列）。使用Split_libraries軟件去除配對結尾序列中含有N堿基的序列，去除單堿基重復大于8的序列，去除長度小于200 bp的序列，得到高質量序列（Clean tags）。使用UCHIME軟件去除高質量序列中的嵌合體，最終得到用于OTU劃分的Valid tags。利用Shannon指數反映細菌的數量及分配的均勻性，以間接反映菌群的多樣性。菌群的差異性分析基于加權Unifrac距離算法的Heatmap差異性分析法。Heatmap差異性分析法是利用樣本兩兩交叉比較物種的多樣性，生成Heatmap圖，圖形方格的顏色代表交叉樣品兩兩之間的相異系數，相異系數越小表示物種多樣性的差異越小，顏色也越紅。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0統計軟件。用Kolmogorov-Smirnov方法測試連續變量的分布，正態分布用均值±標準差（±s）表示，非正態分布用中位數（四分位數）表示。對于正態分布，采用獨立t檢驗或多因素方差分析，對于非正態分布采用非參數檢驗。分類數據以例數（百分比）表示，采用χ2檢驗。采用PAST（Paleontological statistics programme）V.2.16進行菌落相似性的Bray-Curtis定量指數分析，使用基于物種進化關系或數量距離矩陣的NMDS配合Anosim檢驗方法分析各組間微生物組Beta多樣性，采用XLSTAT程序進行Mantel檢驗。進行兩組數據的相關性分析時，若數據呈正態分布時按Pearson法進行直線相關性分析，若數據呈非正態分布時按Spearman法進行直線相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
收集了32例門診支擴的患者，以下患者被排除：7例就診前4周內接受過抗生素治療的患者，1例患者就診前4周內行全身糖皮質激素治療，1例患者無支擴相關癥狀，2例患者因不能耐受行支氣管鏡檢查， 3例患者拒絕行支氣管鏡檢查，1例患者未簽署本項研究的知情同意書。最終納入17例支擴患者并完成臨床試驗，按照Fuchs標準，其中8例為穩定期，9例為急性加重期。
6例因肺部磨玻璃結節行支氣管鏡檢查者作為對照組，留取其健側BALF。支擴組患者與對照組患者相比較，肺功能參數差異均有統計學意義（均P<0.001），其余基本情況無顯著差異。結果見表1。
表1
納入支擴患者與對照組患者基本參數特征［例（%）/（）］
2.2 支擴患者臨床特點
在納入的支擴患者中，男性占47.1%，平均年齡為53.4歲，平均體重指數為20.9 kg/m2。其中有吸煙史的患者占23.5%，有飲酒史的患者占5.9%。支擴的病程中位數為10年。圣喬治評分為39.3分，萊切斯特咳嗽評分為12.3分，支氣管擴張嚴重指數為8.9分。FEV1%pred為58.2%±18.9%，FVC%pred為77.8%±16.5%，FEV1/FVC為62.6%±14.8%。7例（41.2%）患者BALF細菌培養呈陽性，其中5例為銅綠假單胞菌陽性，1例為流感嗜血桿菌，1例為肺炎克雷伯菌（表2）。影像學類型：囊狀支擴10例（58.8%），柱狀支擴6例（35.3%），靜脈曲張型支擴1例（5.9%），Reiff評分8.1分。
表2
支擴患者的BALF細菌培養結果與16S rRNA基因測序結果比較
2.3 全部樣本的檢測深度檢驗
所有樣本的Good’s Coverage指數值均接近1，說明本次檢測的深度已足夠覆蓋樣本中的全部物種，可信度高，具體結果見圖1。
圖1
全部檢測樣本的Good’s Coverage指數
D：對照組。P：支擴組。其中，支擴組有2例患者進行了2次測試，1例患者進行了3次測試。
2.4 支擴組與對照組Valid tags和OTU數量比較
所有樣本中共檢測出1383273個Valid tags，鑒定出1893類OTU，在質控之后的Clean tags數據量分布在33922～41907之間，Clean tags經過去除嵌合體得到Valid tags數據量分布在29137～38620之間，Valid tags平均長度分布在424.21～439.7 bp，各樣本OTU個數分布在282～792之間。
支擴患者的Valid tags數量為35542（31648～36495），對照組的Valid tags數量為35068（33959～35877），兩組間比較，差異無統計學意義（P=0.606）。支擴患者的OTU數量為390（321～470），對照組的OTU數量為412（385～435），兩組間比較，差異無統計學意義（P=0.840）。結果見圖2a、b。
圖2
支擴組與對照組生物信息分析
a. Valid tags數量對比；b. OTU數量對比；c. Shannon指數對比。
2.5 支擴組與對照組菌群的多樣性
支擴組與對照組Shannon指數分別為5.2、6.2，支擴組Shannon指數較對照組低，但差異無統計學意義（P=0.234），見圖2c。
2.6 支擴組細菌培養分類與對照組氣道細菌微生物組學特點比較
為進一步明確支擴患者氣道細菌微生物組學的特點，根據BALF細菌培養的結果，分為菌陽組（BALF細菌培養陽性）和菌陰組（BALF細菌培養陰性），并與對照組比較菌群構成比差別。
2.6.1 三組受試者的Valid tags和OTU數量對比分析
Valid tags、OTU數量差別可反映組間細菌的豐度和細菌的物種數。結果顯示菌陽組的Valid tags較菌陰組稍高，差異有統計學意義（P<0.05），而菌陰組和菌陽組的Valid tags與對照組比較，差異均無統計學意義（均P>0.05）；三組受試者之間兩兩對比，OTU數量差異均無統計學意義（均P>0.05）。結果見圖3a、b。
圖3
菌陽組、菌陰組與對照組生物信息分析
a. Valid tags數量比較；b. OTU數量比較；c. Shannon指數比較。
2.6.2 三組受試者的Shannon指數及與菌陽的相關性分析
結果顯示菌陽組、菌陰組、對照組平均Shannon指數分別為3.7、6.1、6.2，菌陽組較其他兩組顯著降低，差異有統計學意義（均P<0.001），而菌陰組與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05），提示菌陽組的樣本中細菌物種數相對較少，物種分布的均勻性相對較低，而菌陰組與對照組樣本中細菌的種類相對較多，分布較均勻。結果見圖3c。支擴患者Shannon指數與菌陽的相關性分析結果顯示兩者呈負相關（r=?0.659，P=0.004），有統計學意義，其散點圖見圖4a。支擴患者Shannon指數預測細菌培養陽性的受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析結果顯示，ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）=0.833，P=0.015， Yonden指數J=0.74，當樣本Shannon指數≤4.5時對細菌培養陽性的預測敏感性為83.3%，特異性為90.9%，結果見圖4b。
2.6.3 支擴患者的BALF細菌培養結果與16S rRNA基因測序結果比較
表2中列出了基因測序的每個樣本中屬水平排名第一和第二的菌屬與細菌培養的結果，以便進行比對。細菌培養的結果提示5例銅綠假單胞菌，1例流感嗜血桿菌，1例肺炎克雷伯菌，以細菌培養的結果為基準，發現16S rRNA基因測序屬水平相對豐度第一的菌屬與細菌培養結果一致的有4例（57.1%），若結合相對豐度第二的菌屬一起比較與細菌培養結果一致的共有6例（85.7%）。
2.6.4 三組受試者的菌群的差異性分析
支擴菌陽組、菌陰組與對照組三組受試者的菌群的差異性分析見圖5，菌陰組的各個樣本與對照組的的各樣本交叉小方格總體顏色偏紅、黃，對應差異系數相對較小，表明菌陰組與對照組樣本物種多樣性的差異較小；而菌陽組內各個樣本間及與菌陰組、對照組各個樣本交叉小方格總體顏色偏綠、藍，對應差異系數相對較大，表明菌陽組內各樣本間及與菌陰組、對照組各樣本物種多樣性的差異較大。
2.7 支擴患者穩定期與急性加重期對比
2.7.1 支擴患者發生急性加重與Shannon指數的相關性
支擴患者急性加重期的患者樣本16S rRNA基因檢測Shannon指數顯著降低，提示支擴患者急性加重與Shannon指數之間存在一定的關聯，兩者呈負相關（r=?0.676，P=0.003），其散點圖見圖6a。Shannon指數預測支擴患者發生急性加重的ROC曲線分析結果顯示，AUC=0.875（P<0.001），Yonden指數J=0.78。當Shannon指數<5.0時預測支擴患者發生急性加重的敏感性為77.8%，特異性為100.0%，結果有統計學意義，具體見圖6b。
2.7.2 Shannon指數與炎癥指標的相關性分析
支擴患者急性加重期的患者樣本16S rRNA基因檢測Shannon指數顯著降低，提示支擴患者急性加重與Shannon指數之間呈負相關。進一步檢測Shannon指數與炎癥指標之間的相關性，發現Shannon指數與C反應蛋白呈負相關（r=?0.624，P=0.007），有統計學意義，詳細結果見圖7。Shannon指數與血白細胞計數進行相關性分析結果提示呈負相關，r=?0.434（P=0.082），無統計學意義。結果見圖8。
圖8
Shannon 指數與血白細胞計數相關性散點圖
3 討論
支擴的本質是氣道結構的改變引起氣道黏液的間歇或持久的分泌以及細菌的反復定植和感染，引起氣道炎癥、阻塞和組織破壞的惡性循環。目前關于支擴氣道菌群的研究相對較少，國外開展的相關研究結果一致性較低[12-14]，且目前針對中國支擴患者的氣道細菌微生物組學與其臨床特點的相關性研究報道較少。本研究報道了支擴患者與對照組氣道細菌微生物組學的差別，并分析了支擴患者急性加重期及穩定期氣道菌群微生物組學特點，以及Shannon指數與支擴患者BALF細菌培養陽性、炎癥指標、發生急性加重的相關性。
研究結果顯示，對照組的細菌分布與支擴患者在細菌豐度、菌群種類及多樣性方面無顯著差異，與文獻報道基本一致[12-13]。在其他慢性氣道疾病中關于氣道微生物組的研究結果不一，有研究表明慢性氣道疾病患者與對照組下呼吸道微生物菌群多樣性及菌群豐度存在一定的差異[14]，研究結果的差異可能與納排標準不統一、研究的病例數、樣本中細菌菌群多樣性個體差異較大以及留取的標本不一樣有關，不同研究用的標本分別有痰液、支氣管灌洗液、支氣管保護性毛刷等。之前的報道中尚未見支擴組與對照組的微生物組學特點對比研究，有待更多的研究數據來進一步證實我們的結果。
本研究還明確了對照組的菌群與支擴患者菌陰組和菌陽組的菌群差異。三組菌群特點對比分析結果顯示，菌陽組樣本中的細菌總量較菌陰組高，菌陰組與對照組細菌總量無顯著差異。Shannon指數反映細菌的數量及分配的均勻性綜合指標，間接反映菌群的多樣性，對比分析了三組樣本的Shannon指數，結果顯示菌陽組較其他兩組顯著降低，說明菌陽組的樣本中菌群分布的均勻性相對較低，多樣性較差，而菌陰組與對照組樣本中細菌的分布較均勻，且兩組之間的多樣性無顯著性差異。進一步分析支擴患者Shannon指數與BALF細菌培養菌陽的相關性，結果顯示兩者呈負相關，當樣本Shannon指數≤4.5時對菌陽的預測的敏感性為83.3%，特異性為90.9%，該結果可為臨床上常常出現細菌培養結果與肺部感染特征不相符或出現假陰性的現象提供更多參考信息。
本研究中，Heatmap 分析的結果也表明菌陰組與對照組各個樣本中物種多樣性的差異較小，而菌陽組的各個樣本間及與菌陰組、對照組物種多樣性的差異較大，提示支擴患者雖然有長期咳嗽、咳痰，甚至咳膿性痰，但樣本中細菌培養陰性的患者，其菌群特點與對照組無顯著差異，而菌陽組的菌群特點與上述兩組比較存在顯著差異，主要體現在菌陽組中菌群的多樣性較低、16S rRNA基因測序結果中屬水平排名第一細菌的相對豐度較高。這也解釋了本研究中對照組與支擴患者在細菌種類、菌群豐度、Shannon指數差異不大的原因，可能與對照組的微生物組學特征與菌陰組類似，而菌陰組在所有支擴患者中占了58.8%的比例，導致整體上出現陰性結果。
在本研究中對支擴患者的BALF細菌培養結果與16S rRNA基因測序結果進行了比較。細菌培養提示5例銅綠假單胞菌，1例流感嗜血桿菌，1例肺炎克雷伯菌，研究也證實支擴患者以銅綠假單胞菌感染為主[15]。我們以細菌培養的結果為對照標準，發現16S rRNA基因測序屬水平相對豐度第一的菌屬與細菌培養結果一致的有4例（57.1%），若結合排名第二的菌屬一起分析則與細菌培養結果一致的有6例（85.7%），兩者較為吻合，結果還表明BALF細菌培養的結果僅能代表有生長優勢的生物菌落，但不一定是細菌菌屬相對豐度第一的細菌，而且培養陽性的細菌不一定就是真正的致病菌，因為細菌在培養基中的生長繁殖速度及生長競爭能力存在一定的差異性，敏感度較低、生長緩慢、代謝不典型或需要特殊培養基的微生物、細菌本身某些生化反應不典型、菌體受到損傷、藥品生產過程干擾微生物的代謝均可影響鑒定準確性。而16S rRNA基因測序的分子生物學鑒定分型方法可以有效繞開微生物的培養過程，提供了樣本中的全部菌落的生物信息[16]，再結合細菌培養的結果一起分析，有可能為臨床醫生提供更多更準確的信息。
我們在研究中將支擴患者穩定期與急性加重期OTU數量、Valid tags數量、Shannon指數對比分析，結果顯示急性加重期Valid tags數量較穩定期高，提示平均細菌豐度較高；急性加重期Shannon指數值較穩定期低，表明急性加重期的支擴患者細菌的平均豐度更高、平均樣本分布均勻性較低，提示患者發生急性加重的主要原因可能是某一種細菌數量的增加引起整體菌群的分布不均勻引起，這與Whelan等[17]研究團隊的結果一致，但與Cox等[18]研究團隊的結果不一致。我們進一步分析Shannon指數與患者發生急性加重的相關性，結果顯示二者呈負相關。當Shannon指數<5.0時預測支擴患者發生急性加重敏感性為77.8%，特異性為100.0%。對Shannon指數與炎癥指標之間的相關性進行分析，結果提示Shannon指數與C反應蛋白呈負相關，說明Shannon指數可以作為炎癥指標的補充來反映機體的炎癥水平。
本研究特點尚存在以下不足：（1）由于篩選、入組患者困難，研究的對象數量偏少，可能影響統計效能；（2）研究對象縱向觀察時間較短；（3）單中心研究可能存在選擇性偏倚。但本研究首次將從對照組與支擴患者的微生物組特點進行對比，且采用BALF標本，較既往大多數研究采用口咽部標本更能反映下呼吸道的微生物組特征，此為本研究的優勢所在。鑒于病例搜集困難，需要進一步增加研究對象的數量、縱向觀察隨訪的時間及進行多中心同步研究。通過本研究發現16S rRNA基因測序結果中的Shannon指數對急性加重期有一定的預測價值，16S rRNA基因測序結合細菌培養結果，有助于指導臨床醫生提供更精準的治療方案。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
