引用本文： 陳雯, 張湘燕, 葉賢偉, 董晗, 張程. 慢性阻塞性肺疾病頻繁急性加重與合并呼吸衰竭對呼吸道微生態的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(5): 305-310. doi: 10.7507/1671-6205.202208065 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種以不完全可逆的持續氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，其急性加重可嚴重影響生活質量，患者也常常因為去門診急救或住院增加自身的經濟負擔[1]，因此防治慢阻肺急性加重、改善患者生活質量及其預后尤為重要。慢阻肺的發病率高，急性加重時常常合并呼吸衰竭，可導致嚴重的低氧血癥和高碳酸血癥，所以具有較高的病死率。眾所周知，感染是許多慢性呼吸道疾病急性發作的重要因素[2-6]，其中細菌感染占絕大多數[3] ，部分與病毒性感染有關[7-8]。由于傳統培養技術只能培養特定以及常見的病原體，導致我們對呼吸道微生物的認識非常局限。近年來，隨著高通量測序技術的發展，尤其是二代測序技術在微生物組學研究的應用，研究發現肺部微生物學變化是慢阻肺病情進展的一個重要組成部分[9]。慢阻肺急性加重頻繁對患者肺功能損傷嚴重，是導致呼吸功能衰竭的重要原因，有文獻報道年急性發作次數≥3次是慢阻肺患者發生呼吸衰竭的高危因素之一[10-11]。氣道感染是引起呼吸衰竭的一個主要因素，80%的呼吸衰竭是由下呼吸道感染引起[12]，其治療也有待于進一步提高。因此，探討慢阻肺頻繁急性加重及合并呼吸衰竭時呼吸道微生物的特點有非常重要的臨床意義，但目前尚無此方面相關報道，本研究使用16S rRNA高通量測序技術測定慢阻肺頻繁急性加重以及合并呼吸衰竭對呼吸道微生物的影響，為精準治療提供依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2021年11月—2022年3月在貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科住院的慢阻肺急性加重患者60例（有明顯的咳痰癥狀）。將所有入組患者隨機分為兩對亞組：以文獻報道慢阻肺發生呼吸衰竭的高危因素之一為年急性發作次數≥3次為依據[10-11]，第一對亞組按上一年急性加重次數≤2次的患者納入非頻繁急性加重組（簡稱非頻繁組，28例），上一年急性加重次數>2次者為頻繁急性加重組（簡稱頻繁組，32例）。第二對亞組，按慢阻肺急性加重是否合并呼吸衰竭分為：慢阻肺急性加重未并發呼吸衰竭組（簡稱非呼衰組，27例）以及慢阻肺急性加重并發呼吸衰竭組（簡稱呼衰組，33例）。納入標準：慢阻肺急性加重入組標準根據GOLD2021指南[13]及慢性肺部疾病急性加重工具（EXACT-PRO）[14-17]。呼吸衰竭診斷標準按照動脈血氣分析結果：在海平面呼吸室內空氣條件下，PaO2<60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和（或） PaCO2>50 mm Hg，提示呼吸衰竭[18]。排除標準：近期患有口腔疾病者；合并肺結核、肺癌等其他肺部疾病；臨床信息不完整、依從性差的患者。所有患者均知情同意，本研究經醫院倫理委員會批準通過（審批號〔2020〕11號）。
1.2 方法
1.2.1 標本采集及預處理
采集樣品前囑患者漱口清潔口腔，咳深部痰于無菌痰杯中并進行編號；隨后，在1 h內迅速置于–80 ℃冰箱中備用。取其中一部分痰液做痰涂片鏡檢，并使用吉姆薩染色，觀察每低倍鏡視野鱗狀上皮細胞數目，若鱗狀上皮細胞計數比>20%則視為不合格標本。后將合格標本送至檢測公司進行16S rRNA檢測。
1.2.2 痰DNA提取、PCR擴增、文庫構建及基因測序
首先根據 DNA 操作手冊步驟使用天根磁珠法提取試劑盒（美國 Qiagen 公司）提取誘導痰樣本 DNA，后選取DNA片段上V3-V4高變區設計引物進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。正向引物序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，反向引物序列為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產物，對目的條帶使用Universal DNA純化回收試劑盒進行回收。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，將構建好的文庫使用Qubit進行檢測和Q-PCR定量；待文庫合格后，使用NovaSeq6000（Illumina公司，San Diego，CA，美國）進行上機測序。
1.2.3 生物學信息分析
根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣本數據，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個樣本的讀數進行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數據（Raw Tags），平均每樣品測得84689條tags；隨后使用fastp軟件對拼接得到的Raw Tags經過嚴格的過濾處理得到高質量的Tags數據（Clean Tags），平均得到 83276條有效數據，質控有效數據量達69260，質控有效率達81.76%。利用Uparse算法對所有樣本的全部有效數據進行聚類，默認以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs），共得到9778個OTUs。然后對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA138的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1），獲得分類學信息并分別在各個分類水平。使用MUSCLE 軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。使用Qiime軟件計算Chao1、Shannon、Simpson、Ace指數，以及加權Unifrac距離等，并使用R軟件進行Alpha、Beta多樣性指數組間差異分析。
1.3 統計學方法
采用SPSS 21.0統計軟件。對計量資料進行正態與非正態檢測，若為正態分布且方差齊，采用均數±標準差（
±s）表示，對兩獨立樣本進行t檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。若計量資料為非正態分布的用秩和檢驗。生物信息學分析采用R語言包進行分析。使用廣義UniFrac距離進行微生物群落結構分析。使用LEfSe獲得組間的差異性物種。在本研究中，使用的LDA評分閾值>4.0。
2 結果
2.1 一般臨床資料
共收集痰合格樣品60份，為慢阻肺急性加重期患者在住院第1天使用抗生素前獲取的痰樣品。非頻繁組患者共28例，其中男22例，女6例，平均年齡（75.7±10.1）歲；頻繁組患者共32例，男26例，女6例，平均年齡（70.7±9.7）歲，兩組在性別、年齡、住院時間、吸煙、體重指數等方面差異無統計學意義（均P>0.05）。結果見表1。非呼衰組患者共27例，其中男22例，女5例，平均年齡（75.0±7.7）歲；呼衰組患者共33例，其中男27例，女6例，平均年齡（69.0±10.6）歲；兩組在性別、年齡、住院時間、吸煙、體重指數等方面差異無統計學意義（均 P>0.05）。結果見表2。
表1
非頻繁組和頻繁組患者的臨床情況［例/（
）/例（%）］
表2
非呼衰組和呼衰組患者的臨床情況［例/（
）/例（%）］
2.2 微生態生物信息學分析
2.2.1 Alpha多樣性指數
OTUs是以97%相似的序列聚類，并選擇97%為閾值分別對非頻繁組及頻繁組（表3），非呼衰組及呼衰組（表4）不同痰樣本微生態的Alpha多樣性指數進行統計分析。結果顯示：（1）非頻繁組Shannon指數高于頻繁組，差異有統計學意義（P<0.05），而Simpson指數比較，差異沒有統計學意義（P>0.05），非頻繁組Chao1指數、Ace指數高于頻繁組，差異有統計學意義（P<0.05）；（2）Shannon指數、Simpson指數分析，呼衰組小于非呼衰組，但差異沒有統計學意義（P>0.05）；Chao1指數、Ace指數分析，呼衰組大于非呼衰組，但差異沒有統計學意義（P>0.05）。
表3
非頻繁組和頻繁組多樣性指數與豐富度指數比較
表4
非呼衰組與呼衰組多樣性指數與豐富度指數比較
2.2.2 Beta 多樣性分析
基于加權Unifrac距離來對所有60個痰樣本進行PCoA分析，并選取貢獻率最大的主坐標分別組合繪制PCoA圖，兩個痰樣本之間的距離越近，表明其微生態群落結構越相似，反之亦然。非頻繁組與頻繁組呼吸道微生態群落結構存在差異，PC1貢獻率為36.73%，PC2的貢獻率為20.30%（圖1a）；非呼衰組與呼衰組呼吸道微生態群落結構存在差異，PC1貢獻率為36.74%，PC2貢獻率為20.29%（圖2a）。
圖1
非頻繁組和頻繁組微生態生物信息學分析
a. PcoA分析圖；b. 門水平物種分布柱狀圖；c. 屬水平物種分布柱狀圖；d. LefSe差異性分析圖。
2.3 微生態分析
2.3.1 門水平
所有患者門水平排名前10的菌門，分別是Firmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidota（擬桿菌門）、Spirochaetota、Halobacterota、Cyanobacteria（藍藻菌門）、Euryarchaeota、Fusobacteriota、Actinobacteria（放線菌門）、Campylobacterota（彎曲桿菌門）。頻繁組的變形菌門構成高于非頻繁組，差異有統計學意義（P<0.05），呼衰組變形菌門構成高于非呼衰組，但差異無統計學意義（P>0.05）；非頻繁組的擬桿菌門構成較頻繁組高，但差異無統計學意義（P>0.05）；非頻繁組、非呼衰組的厚壁菌門、放線菌門構成分別較頻繁組、呼衰組高，但差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖1b和圖2b。
圖2
非呼衰組與呼衰組微生態生物信息學分析
a. PcoA分析圖；b. 門水平物種分布柱狀圖；c. 屬水平物種分布柱狀圖；d. LefSe差異性分析圖。
2.3.2 屬水平
屬水平排名前10的菌屬，分別是Burkholderia-Caballeronla-Paraburkholderia、Haemophilus（流感嗜血桿菌屬）、Streptococcus（鏈球菌）、Veillonella、Brevundimonas、Porphyromonas（紫單胞菌屬）、Prevotella-7（普雷沃氏菌屬-7）、Neisseria（奈瑟菌屬）、Sphaerochaeta、Methanosaeta。頻繁組、呼衰組流感嗜血桿菌屬構成均較非頻繁組、非呼衰組高，頻繁組鏈球菌屬構成較非頻繁組高，非頻繁組普雷沃氏菌屬-7構成分別較頻繁組高，但差異均無統計學意義（均P>0.05）；非呼衰組普雷沃氏菌屬-7相對豐度較呼衰組高，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖1c和圖2c。
2.4 物種分類差異
通過LefSe差異性分析分析出不同分類水平的細菌。頻繁組在門水平上變形菌門相對豐度升高；非頻繁組在屬水平上以Bacteroides相對豐度升高，在科水平上以Bacteroidaceae、Lachnospiraceae相對豐度升高；非呼衰組在屬水平上以Prevotella、Prevotella-7相對豐度升高。結果見圖1d和圖2d。
3 討論
Alpha多樣性指數中的Shannon指數和Simpson指數為度量菌群多樣性的指標，Chao1指數和Ace指數為度量菌群豐度的指標；而Beta多樣性則是用于不同的樣品或不同組別的菌群結構分析。本研究顯示非頻繁組呼吸道微生態多樣性高于頻繁組；慢阻肺急性加重并呼吸衰竭時呼吸道微生態多樣性較無呼吸衰竭時降低，而豐度大于無呼吸衰竭時。微生物多樣性是健康微生物組的重要組成部分，菌群豐度代表菌群細菌的拷貝數量，我們的研究提示：慢阻肺急性加重并呼吸衰竭時伴隨著菌群的明顯富集，尤其是特定細菌門、菌屬是慢阻肺急性加重患者預后的重要因素，表明細菌感染為其病情加重的重要原因。普雷沃氏菌是人類口腔中第二豐富的屬[19] ，它只要存在，即基本上是腸道微生物群中豐度最高的細菌，近年來提出的“腸–肺”軸理論[20-21]，呼吸道與腸道間存在病理生理的相互作用[22]。有研究表明，慢阻肺患者腸道通透性較健康人群高，而腸道高通透性可引起細菌或其產物移位從而導致相應組織部位的炎癥，由此推論，慢阻肺患者肺部普雷沃氏菌豐度可能較高。本研究發現：普雷沃氏菌屬-7為屬水平中排名前十的細菌，支持上述推論；而且非頻繁組、非呼衰組的普雷沃氏菌屬-7構成均分別比頻繁組、呼衰組高。Huang等[23] 縱向觀察了慢阻肺患者急性發作前后的氣道微生態，發現穩定的慢阻肺個體中微生物組保持穩定；慢阻肺急性加重的起始階段，菌群豐富度、均勻度和多樣性沒有變化 ；而隨著變形菌門的增加和放線菌門，梭菌綱和擬桿菌門的減少，分類組成發生了顯著變化 ；變形菌門中流感嗜血桿菌隨著病情加重逐漸增加，與之在系統發育樹中密切相關的細菌菌落也得到了豐富，在系統發育樹中遙遠的分類群下降。還有學者發現哮喘患者與非哮喘人群相比也伴隨變形菌門構成及豐度的明顯升高[24]。本研究中，頻繁組及呼衰組變形菌門、流感嗜血桿菌屬構成均比非頻繁組、非呼衰組高；頻繁組鏈球菌屬構成比非頻繁組高；說明了流感嗜血桿菌、鏈球菌在慢阻肺急性加重期病程演變中的重要作用。以傳統培養方式檢測，慢阻肺急性加重與流感嗜血桿菌、卡他莫拉桿菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌等有關 [25]。現有研究證明，不同嚴重程度的慢阻肺急性加重，致病菌種類不同，隨著肺功能的下降，顯示慢阻肺急性加重的致病菌從肺炎鏈球菌向流感嗜血桿菌、腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌轉化[26]，并且有研究已證明流感嗜血桿菌能夠直接誘導中性粒細胞外誘捕網[27]，而肺炎鏈球菌的細菌懸液刺激肺泡巨噬細胞系可導致細胞因子腫瘤壞死因子和環氧合酶-2分泌增加顯著[28]，所以流感嗜血桿菌、鏈球菌在慢阻肺疾病進展和惡化過程中發揮著很重要的角色[29]。有文獻報道重度和極重度慢阻肺患者的變形桿菌和嗜血桿菌比中度慢阻肺患者顯著增加、普雷沃氏菌減少[30]。此次研究中頻繁組變形菌門相對豐度比非頻繁組高，差異有統計學意義；非呼衰組普雷沃氏菌屬-7相對豐度比呼衰組高，差異有統計學意義；頻繁組及呼衰組流感嗜血桿菌相對豐度比非頻繁組及非呼衰組高，呼衰組變形菌門相對豐度比非呼衰組高，非頻繁組中普雷沃氏菌屬-7相對豐度比頻繁組高，但差異均無統計學意義，這不排除與樣本量少有關。
有研究報道，當慢阻肺急性發作≤2次/年時，患者第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）下降3.59%，而當急性發作>2 次/年時，FEV1下降4.22%[10-11]，且急性發作頻次增加與FEV1下降呈正比，而FEV1受損嚴重是引起慢阻肺急性加重的獨立危險因素[31-32]，慢阻肺發作的頻率與患者肺功能的損害程度成正比，當次數積累到一定的程度，便導致了呼吸衰竭的癥狀。換言之，慢性阻塞性肺疾病致呼吸衰竭的危險因素包括每年發生慢阻肺急性發作次數[33]，因此，對于慢阻肺患者治療的主要目標是減少急性加重，預防呼吸衰竭的發生，一旦發展為呼吸衰竭，影響療效、增加死亡率。慢阻肺的主要病理特征是慢性氣道炎癥，而氣道微生態的長期定植與反復感染是氣道結構重塑與免疫失調的主要機制[34]。然而，目前暫無關于慢阻肺頻繁急性加重與呼吸衰竭患者微生態16S rRNA基因測序方面的報道。我們的研究發現，頻繁組與呼衰組的氣道微生態菌群在門水平、屬水平上相對豐度高的菌群相同，從微生態方面證實頻繁急性加重可導致呼吸衰竭。本次研究亦了解了非頻繁組及非呼衰組氣道微生態菌群的特點，可為臨床診療及病情判斷提供理論依據，精準化治療以減少急性加重，預防呼吸衰竭。
本研究有一些需要改進地方。首先，我們的樣本量偏少，也許不能全面反映出患者氣道微生態的特點；其次，部分慢阻肺患者長期使用吸入性激素治療，采集痰樣本前因病情較重未能停藥，痰樣本受到糖皮質激素的影響；最后，本研究只針對細菌，慢阻肺的發病與細菌、真菌、病毒等有關，故下一步可擴展該方面的研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種以不完全可逆的持續氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，其急性加重可嚴重影響生活質量，患者也常常因為去門診急救或住院增加自身的經濟負擔[1]，因此防治慢阻肺急性加重、改善患者生活質量及其預后尤為重要。慢阻肺的發病率高，急性加重時常常合并呼吸衰竭，可導致嚴重的低氧血癥和高碳酸血癥，所以具有較高的病死率。眾所周知，感染是許多慢性呼吸道疾病急性發作的重要因素[2-6]，其中細菌感染占絕大多數[3] ，部分與病毒性感染有關[7-8]。由于傳統培養技術只能培養特定以及常見的病原體，導致我們對呼吸道微生物的認識非常局限。近年來，隨著高通量測序技術的發展，尤其是二代測序技術在微生物組學研究的應用，研究發現肺部微生物學變化是慢阻肺病情進展的一個重要組成部分[9]。慢阻肺急性加重頻繁對患者肺功能損傷嚴重，是導致呼吸功能衰竭的重要原因，有文獻報道年急性發作次數≥3次是慢阻肺患者發生呼吸衰竭的高危因素之一[10-11]。氣道感染是引起呼吸衰竭的一個主要因素，80%的呼吸衰竭是由下呼吸道感染引起[12]，其治療也有待于進一步提高。因此，探討慢阻肺頻繁急性加重及合并呼吸衰竭時呼吸道微生物的特點有非常重要的臨床意義，但目前尚無此方面相關報道，本研究使用16S rRNA高通量測序技術測定慢阻肺頻繁急性加重以及合并呼吸衰竭對呼吸道微生物的影響，為精準治療提供依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2021年11月—2022年3月在貴州省人民醫院呼吸與危重癥醫學科住院的慢阻肺急性加重患者60例（有明顯的咳痰癥狀）。將所有入組患者隨機分為兩對亞組：以文獻報道慢阻肺發生呼吸衰竭的高危因素之一為年急性發作次數≥3次為依據[10-11]，第一對亞組按上一年急性加重次數≤2次的患者納入非頻繁急性加重組（簡稱非頻繁組，28例），上一年急性加重次數>2次者為頻繁急性加重組（簡稱頻繁組，32例）。第二對亞組，按慢阻肺急性加重是否合并呼吸衰竭分為：慢阻肺急性加重未并發呼吸衰竭組（簡稱非呼衰組，27例）以及慢阻肺急性加重并發呼吸衰竭組（簡稱呼衰組，33例）。納入標準：慢阻肺急性加重入組標準根據GOLD2021指南[13]及慢性肺部疾病急性加重工具（EXACT-PRO）[14-17]。呼吸衰竭診斷標準按照動脈血氣分析結果：在海平面呼吸室內空氣條件下，PaO2<60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和（或） PaCO2>50 mm Hg，提示呼吸衰竭[18]。排除標準：近期患有口腔疾病者；合并肺結核、肺癌等其他肺部疾病；臨床信息不完整、依從性差的患者。所有患者均知情同意，本研究經醫院倫理委員會批準通過（審批號〔2020〕11號）。
1.2 方法
1.2.1 標本采集及預處理
采集樣品前囑患者漱口清潔口腔，咳深部痰于無菌痰杯中并進行編號；隨后，在1 h內迅速置于–80 ℃冰箱中備用。取其中一部分痰液做痰涂片鏡檢，并使用吉姆薩染色，觀察每低倍鏡視野鱗狀上皮細胞數目，若鱗狀上皮細胞計數比>20%則視為不合格標本。后將合格標本送至檢測公司進行16S rRNA檢測。
1.2.2 痰DNA提取、PCR擴增、文庫構建及基因測序
首先根據 DNA 操作手冊步驟使用天根磁珠法提取試劑盒（美國 Qiagen 公司）提取誘導痰樣本 DNA，后選取DNA片段上V3-V4高變區設計引物進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。正向引物序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，反向引物序列為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產物，對目的條帶使用Universal DNA純化回收試劑盒進行回收。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，將構建好的文庫使用Qubit進行檢測和Q-PCR定量；待文庫合格后，使用NovaSeq6000（Illumina公司，San Diego，CA，美國）進行上機測序。
1.2.3 生物學信息分析
根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣本數據，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個樣本的讀數進行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數據（Raw Tags），平均每樣品測得84689條tags；隨后使用fastp軟件對拼接得到的Raw Tags經過嚴格的過濾處理得到高質量的Tags數據（Clean Tags），平均得到 83276條有效數據，質控有效數據量達69260，質控有效率達81.76%。利用Uparse算法對所有樣本的全部有效數據進行聚類，默認以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs），共得到9778個OTUs。然后對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA138的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1），獲得分類學信息并分別在各個分類水平。使用MUSCLE 軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。使用Qiime軟件計算Chao1、Shannon、Simpson、Ace指數，以及加權Unifrac距離等，并使用R軟件進行Alpha、Beta多樣性指數組間差異分析。
1.3 統計學方法
采用SPSS 21.0統計軟件。對計量資料進行正態與非正態檢測，若為正態分布且方差齊，采用均數±標準差（±s）表示，對兩獨立樣本進行t檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。若計量資料為非正態分布的用秩和檢驗。生物信息學分析采用R語言包進行分析。使用廣義UniFrac距離進行微生物群落結構分析。使用LEfSe獲得組間的差異性物種。在本研究中，使用的LDA評分閾值>4.0。
2 結果
2.1 一般臨床資料
共收集痰合格樣品60份，為慢阻肺急性加重期患者在住院第1天使用抗生素前獲取的痰樣品。非頻繁組患者共28例，其中男22例，女6例，平均年齡（75.7±10.1）歲；頻繁組患者共32例，男26例，女6例，平均年齡（70.7±9.7）歲，兩組在性別、年齡、住院時間、吸煙、體重指數等方面差異無統計學意義（均P>0.05）。結果見表1。非呼衰組患者共27例，其中男22例，女5例，平均年齡（75.0±7.7）歲；呼衰組患者共33例，其中男27例，女6例，平均年齡（69.0±10.6）歲；兩組在性別、年齡、住院時間、吸煙、體重指數等方面差異無統計學意義（均 P>0.05）。結果見表2。
表1
非頻繁組和頻繁組患者的臨床情況［例/（）/例（%）］
表2
非呼衰組和呼衰組患者的臨床情況［例/（）/例（%）］
2.2 微生態生物信息學分析
2.2.1 Alpha多樣性指數
OTUs是以97%相似的序列聚類，并選擇97%為閾值分別對非頻繁組及頻繁組（表3），非呼衰組及呼衰組（表4）不同痰樣本微生態的Alpha多樣性指數進行統計分析。結果顯示：（1）非頻繁組Shannon指數高于頻繁組，差異有統計學意義（P<0.05），而Simpson指數比較，差異沒有統計學意義（P>0.05），非頻繁組Chao1指數、Ace指數高于頻繁組，差異有統計學意義（P<0.05）；（2）Shannon指數、Simpson指數分析，呼衰組小于非呼衰組，但差異沒有統計學意義（P>0.05）；Chao1指數、Ace指數分析，呼衰組大于非呼衰組，但差異沒有統計學意義（P>0.05）。
表3
非頻繁組和頻繁組多樣性指數與豐富度指數比較
表4
非呼衰組與呼衰組多樣性指數與豐富度指數比較
2.2.2 Beta 多樣性分析
基于加權Unifrac距離來對所有60個痰樣本進行PCoA分析，并選取貢獻率最大的主坐標分別組合繪制PCoA圖，兩個痰樣本之間的距離越近，表明其微生態群落結構越相似，反之亦然。非頻繁組與頻繁組呼吸道微生態群落結構存在差異，PC1貢獻率為36.73%，PC2的貢獻率為20.30%（圖1a）；非呼衰組與呼衰組呼吸道微生態群落結構存在差異，PC1貢獻率為36.74%，PC2貢獻率為20.29%（圖2a）。
圖1
非頻繁組和頻繁組微生態生物信息學分析
a. PcoA分析圖；b. 門水平物種分布柱狀圖；c. 屬水平物種分布柱狀圖；d. LefSe差異性分析圖。
2.3 微生態分析
2.3.1 門水平
所有患者門水平排名前10的菌門，分別是Firmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidota（擬桿菌門）、Spirochaetota、Halobacterota、Cyanobacteria（藍藻菌門）、Euryarchaeota、Fusobacteriota、Actinobacteria（放線菌門）、Campylobacterota（彎曲桿菌門）。頻繁組的變形菌門構成高于非頻繁組，差異有統計學意義（P<0.05），呼衰組變形菌門構成高于非呼衰組，但差異無統計學意義（P>0.05）；非頻繁組的擬桿菌門構成較頻繁組高，但差異無統計學意義（P>0.05）；非頻繁組、非呼衰組的厚壁菌門、放線菌門構成分別較頻繁組、呼衰組高，但差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖1b和圖2b。
圖2
非呼衰組與呼衰組微生態生物信息學分析
a. PcoA分析圖；b. 門水平物種分布柱狀圖；c. 屬水平物種分布柱狀圖；d. LefSe差異性分析圖。
2.3.2 屬水平
屬水平排名前10的菌屬，分別是Burkholderia-Caballeronla-Paraburkholderia、Haemophilus（流感嗜血桿菌屬）、Streptococcus（鏈球菌）、Veillonella、Brevundimonas、Porphyromonas（紫單胞菌屬）、Prevotella-7（普雷沃氏菌屬-7）、Neisseria（奈瑟菌屬）、Sphaerochaeta、Methanosaeta。頻繁組、呼衰組流感嗜血桿菌屬構成均較非頻繁組、非呼衰組高，頻繁組鏈球菌屬構成較非頻繁組高，非頻繁組普雷沃氏菌屬-7構成分別較頻繁組高，但差異均無統計學意義（均P>0.05）；非呼衰組普雷沃氏菌屬-7相對豐度較呼衰組高，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖1c和圖2c。
2.4 物種分類差異
通過LefSe差異性分析分析出不同分類水平的細菌。頻繁組在門水平上變形菌門相對豐度升高；非頻繁組在屬水平上以Bacteroides相對豐度升高，在科水平上以Bacteroidaceae、Lachnospiraceae相對豐度升高；非呼衰組在屬水平上以Prevotella、Prevotella-7相對豐度升高。結果見圖1d和圖2d。
3 討論
Alpha多樣性指數中的Shannon指數和Simpson指數為度量菌群多樣性的指標，Chao1指數和Ace指數為度量菌群豐度的指標；而Beta多樣性則是用于不同的樣品或不同組別的菌群結構分析。本研究顯示非頻繁組呼吸道微生態多樣性高于頻繁組；慢阻肺急性加重并呼吸衰竭時呼吸道微生態多樣性較無呼吸衰竭時降低，而豐度大于無呼吸衰竭時。微生物多樣性是健康微生物組的重要組成部分，菌群豐度代表菌群細菌的拷貝數量，我們的研究提示：慢阻肺急性加重并呼吸衰竭時伴隨著菌群的明顯富集，尤其是特定細菌門、菌屬是慢阻肺急性加重患者預后的重要因素，表明細菌感染為其病情加重的重要原因。普雷沃氏菌是人類口腔中第二豐富的屬[19] ，它只要存在，即基本上是腸道微生物群中豐度最高的細菌，近年來提出的“腸–肺”軸理論[20-21]，呼吸道與腸道間存在病理生理的相互作用[22]。有研究表明，慢阻肺患者腸道通透性較健康人群高，而腸道高通透性可引起細菌或其產物移位從而導致相應組織部位的炎癥，由此推論，慢阻肺患者肺部普雷沃氏菌豐度可能較高。本研究發現：普雷沃氏菌屬-7為屬水平中排名前十的細菌，支持上述推論；而且非頻繁組、非呼衰組的普雷沃氏菌屬-7構成均分別比頻繁組、呼衰組高。Huang等[23] 縱向觀察了慢阻肺患者急性發作前后的氣道微生態，發現穩定的慢阻肺個體中微生物組保持穩定；慢阻肺急性加重的起始階段，菌群豐富度、均勻度和多樣性沒有變化 ；而隨著變形菌門的增加和放線菌門，梭菌綱和擬桿菌門的減少，分類組成發生了顯著變化 ；變形菌門中流感嗜血桿菌隨著病情加重逐漸增加，與之在系統發育樹中密切相關的細菌菌落也得到了豐富，在系統發育樹中遙遠的分類群下降。還有學者發現哮喘患者與非哮喘人群相比也伴隨變形菌門構成及豐度的明顯升高[24]。本研究中，頻繁組及呼衰組變形菌門、流感嗜血桿菌屬構成均比非頻繁組、非呼衰組高；頻繁組鏈球菌屬構成比非頻繁組高；說明了流感嗜血桿菌、鏈球菌在慢阻肺急性加重期病程演變中的重要作用。以傳統培養方式檢測，慢阻肺急性加重與流感嗜血桿菌、卡他莫拉桿菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌等有關 [25]。現有研究證明，不同嚴重程度的慢阻肺急性加重，致病菌種類不同，隨著肺功能的下降，顯示慢阻肺急性加重的致病菌從肺炎鏈球菌向流感嗜血桿菌、腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌轉化[26]，并且有研究已證明流感嗜血桿菌能夠直接誘導中性粒細胞外誘捕網[27]，而肺炎鏈球菌的細菌懸液刺激肺泡巨噬細胞系可導致細胞因子腫瘤壞死因子和環氧合酶-2分泌增加顯著[28]，所以流感嗜血桿菌、鏈球菌在慢阻肺疾病進展和惡化過程中發揮著很重要的角色[29]。有文獻報道重度和極重度慢阻肺患者的變形桿菌和嗜血桿菌比中度慢阻肺患者顯著增加、普雷沃氏菌減少[30]。此次研究中頻繁組變形菌門相對豐度比非頻繁組高，差異有統計學意義；非呼衰組普雷沃氏菌屬-7相對豐度比呼衰組高，差異有統計學意義；頻繁組及呼衰組流感嗜血桿菌相對豐度比非頻繁組及非呼衰組高，呼衰組變形菌門相對豐度比非呼衰組高，非頻繁組中普雷沃氏菌屬-7相對豐度比頻繁組高，但差異均無統計學意義，這不排除與樣本量少有關。
有研究報道，當慢阻肺急性發作≤2次/年時，患者第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）下降3.59%，而當急性發作>2 次/年時，FEV1下降4.22%[10-11]，且急性發作頻次增加與FEV1下降呈正比，而FEV1受損嚴重是引起慢阻肺急性加重的獨立危險因素[31-32]，慢阻肺發作的頻率與患者肺功能的損害程度成正比，當次數積累到一定的程度，便導致了呼吸衰竭的癥狀。換言之，慢性阻塞性肺疾病致呼吸衰竭的危險因素包括每年發生慢阻肺急性發作次數[33]，因此，對于慢阻肺患者治療的主要目標是減少急性加重，預防呼吸衰竭的發生，一旦發展為呼吸衰竭，影響療效、增加死亡率。慢阻肺的主要病理特征是慢性氣道炎癥，而氣道微生態的長期定植與反復感染是氣道結構重塑與免疫失調的主要機制[34]。然而，目前暫無關于慢阻肺頻繁急性加重與呼吸衰竭患者微生態16S rRNA基因測序方面的報道。我們的研究發現，頻繁組與呼衰組的氣道微生態菌群在門水平、屬水平上相對豐度高的菌群相同，從微生態方面證實頻繁急性加重可導致呼吸衰竭。本次研究亦了解了非頻繁組及非呼衰組氣道微生態菌群的特點，可為臨床診療及病情判斷提供理論依據，精準化治療以減少急性加重，預防呼吸衰竭。
本研究有一些需要改進地方。首先，我們的樣本量偏少，也許不能全面反映出患者氣道微生態的特點；其次，部分慢阻肺患者長期使用吸入性激素治療，采集痰樣本前因病情較重未能停藥，痰樣本受到糖皮質激素的影響；最后，本研究只針對細菌，慢阻肺的發病與細菌、真菌、病毒等有關，故下一步可擴展該方面的研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
