引用本文： 楊赟, 楊寵玉, 王亞麗, 崔德月, 畢輝, 何騫, 葛運起, 李志英, 張秋娣, 邱慧, 周軍. 4-苯基丁酸對博來霉素誘導小鼠肺纖維化的保護作用及機制探討. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(11): 797-803. doi: 10.7507/1671-6205.202208018 復制
特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的，以尋常型間質性肺炎為病理特征的，慢性進展性纖維化性肺疾病。IPF的發病機制尚不明確，越來越多的證據表明，反復肺泡上皮損傷促使成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，導致不可逆性的細胞外基質沉積和肺組織重塑。IPF預后較差，除肺移植外，尚無有效地治療IPF的藥物[1-2]。研究表明，內質網應激通過誘導肺泡上皮細胞凋亡和促進成纖維細胞大量增殖而參與到IPF的發生發展過程中[3]。我們前期的實驗證實內質網應激分子標志物感受器活化轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）在博來霉素（bleomycin，BLM）誘導的肺纖維化小鼠肺組織中高表達，從而參與IPF的發生發展[4-5]。4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）除了作為氨清除劑外，也可作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑和內質網應激抑制劑[6-9]。研究證實4-PBA可減輕內質網應激[10]，在心肌肥大、急性腎損傷及心臟纖維化等多種疾病中起保護作用[7, 9, 11-13]，但其在IPF中的保護作用及機制尚未被深入研究。本研究旨在探索4-PBA在BLM誘導的肺纖維化小鼠中的作用，有助于深入理解IPF的發病機制，并為IPF提供一種新的治療策略。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和實驗材料
120只無特定病原體級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，20～22 g（上海斯萊克實驗動物有限公司），戊巴比妥鈉（上海博光生物科技有限公司），BLM（日本Nippon Kayaku公司），羥脯氨酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），RNA提取試劑盒（美國BIOMIGA公司），ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒（日本TOYOBO公司），合成引物（上海生工公司），Thunderbird SYBR qPCR Mix Kit（日本TOYOBO公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒（中國威奧生物科技公司），放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（上海索萊寶生物科技有限公司），十二烷基硫酸鈉聚丙凝膠配置試劑盒（中國威奧生物科技公司），牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA，美國Sigma公司），ATF6抗體（美國Abcam公司），CHOP抗體（美國Cell Signaling公司），β-肌動蛋白（β-actin）抗體（上海普邁生物科技有限公司），辣根過氧化物酶二抗（中國華安生物科技有限公司），微孔板分光光度計Epoch2（美國BioTek有限公司），ABI-7500熒光定量PCR反應擴增儀（美國ABI公司），Bio-Rad凝膠成像系統（美國Rio-Rad公司），小鼠肺功能檢測儀（美國DSI Buxco公司）。
1.2 實驗動物處理
雄性C57BL/6小鼠購買后在12 h明暗光照循環，溫度22～24 ℃和相對濕度50%～60%的環境中飼養，小鼠自由飲水和正常飲食。小鼠適應性飼養1周以后，隨機分為BLM組、BLM+4-PBA組和對照組，每組40只小鼠。動物實驗由蘇州大學實驗動物管理和使用委員會批準（批準號K18-028）。
所有小鼠在實驗的第0天用2%戊巴比妥鈉5 mL/kg腹腔注射麻醉。BLM組和BLM+4-PBA組小鼠在氣管內注射5.0 U/kg的BLM制造小鼠肺纖維化模型[14]，同時對照組小鼠氣管注射等體積的生理鹽水。參考文獻［15］，在實驗的第15天連續2周每天在BLM+4-PBA組腹腔內注射4-PBA（500 mg/kg），同時BLM組和對照組小鼠每天注射等體積的磷酸鹽緩沖液。在實驗的第21天和28天，每組各處死10只小鼠，各組余下的20只小鼠用于生存研究。
1.3 小鼠肺功能檢測
在實驗的第21和28天，各組隨機選擇5只小鼠，在小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后行氣管切開術，插入18G靜脈導管，將小鼠放入肺功能檢測系統的體積描記儀腔體中進行肺功能檢測，所有操作步驟按照DSI's Buxco公司的操作標準執行[16]。每只小鼠的肺功能指標用力肺活量（forced vital volume，FVC）、50毫秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 50 millisecond，FEV50）及動態肺順應性（dynamic compliance，Cdyn）測量3次，取平均值用于統計分析。測量完肺功能以后，所有存活的小鼠被處死，肺組織用于進一步評估。
1.4 小鼠肺組織膠原蛋白檢測
羥脯氨酸是膠原蛋白的標志性成分，為膠原纖維所特有。檢測羥脯氨酸來判斷肺纖維化程度。使用羥脯氨酸堿水解法試劑盒，按照說明書步驟操作，通過測定樣本水解液550 nm處吸光值，按照標準公式計算出小鼠肺組織羥脯氨酸的含量。
1.5 小鼠組織病理學
在實驗的第21和28天處死小鼠。肺組織以福爾馬林液固定后進行石蠟包埋切片，然后進行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和馬松（Masson）染色，顯微鏡下觀察。兩位有經驗的病理科醫生參照Ashcroft評分來獨立評估肺組織急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和肺纖維化程度[17]。
1.6 qRT-PCR檢測
在實驗的第21和28天，各組隨機選擇6只小鼠肺組織，使用RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA，使用分光光度計檢測RNA的濃度和純度。使用ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。將制備好的cDNA作為模版，根據引物（ATF6 F：5′-CGGTCCACAGACTCGTGTTC-3′，R：5′-GCTGTCGCCATATAAGGAAAGG-3′；CHOP F：5′-CTGGAAGCCTGGTATGAGGAT-3′，R：5′-CAGGGTCAAGAGTAGTGAAGGT-3′；β-actin F：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，R：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′）按照PCR反應條件，用ABI-7500熒光定量PCR進行Real time PCR擴增。以β-actin為內參，用2?△△Ct計算肺組織中ATF6和CHOP的mRNA相對表達水平。
1.7 蛋白印跡法檢測
在實驗的第21和28天，各組隨機選擇6只小鼠肺組織，使用RIPA裂解液提取肺組織全蛋白，用BCA蛋白定量檢測試劑盒定量檢測蛋白濃度。取15～20 μg蛋白進行電泳和電轉。用5% BSA封閉蛋白后，4 ℃孵育一抗ATF6抗體（1∶1000）、CHOP抗體（1∶1000）和β-actin抗體（1∶2000）過夜。次日，用含Tween 20的Tris緩沖液（TBS with Tween-20，TBST）洗脫后加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2000），在室溫下孵育1 h，TBST洗脫后，使用化學發光法檢測蛋白表達，Bio-Rad凝膠成像系統掃描蛋白印記條帶，對蛋白表達情況進行定量分析。
1.8 統計學方法
實驗結果以均數±標準差（
±s）表示。兩組間比較采用Student t檢驗法。多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni法。繪制生存曲線采用Kaplan-Meier法，生存時間比較采用log-rank檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。所有統計學分析采用GraphPad Prism5.0軟件完成。
2 結果
2.1 小鼠肺組織病理形態學變化
通過HE和Masson染色，BLM組小鼠肺組織病理圖片可見肺泡間隔增寬、炎癥細胞浸潤、肺組織結構破壞及膠原纖維沉積，并且這些病理改變隨時間延長逐漸加重。4-PBA干預顯著減少了BLM造成的小鼠肺組織損傷，減輕了肺部炎癥和纖維化（圖1a～f及圖2a～f）。對照組、BLM組和BLM+4-PBA組小鼠第21天肺組織ALI評分依次為（0.20±0.42）、（5.30±1.63）、（3.00±0.94）分，差異具有統計學意義（F=71.456，P=0.000）；第28天肺組織ALI評分依次為（0.10±0.32）、（3.50±1.18）、（1.80±0.63）分，差異具有統計學意義（F=58.170，P=0.000）。三組小鼠第21天的肺纖維化評分依次為（0.10±0.31）、（3.00±1.05）、（0.80±0.63）分，差異具有統計學意義（F=35.311，P=0.000），第28天的肺纖維化評分依次為（0.10±0.32）、（5.40±1.58）、（1.90±0.74）分，差異具有統計學意義（F=70.790，P=0.000）。BLM組小鼠ALI和肺纖維化評分明顯高于對照組，接受4-PBA治療的小鼠ALI和肺纖維化評分明顯低于BLM組（圖1g及圖2g）。
圖1
小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a、d. 對照組肺泡結構正常，無明顯病理改變；b、e. BLM組肺泡間隔增寬、炎癥細胞浸潤、肺組織結構破壞及膠原纖維沉積；c、f. BLM+4-PBA組肺泡間隔增寬、炎癥細胞浸潤、肺組織結構破壞及膠原纖維沉積較BLM組減輕；g. 肺組織急性肺損傷評分（
圖2
小鼠肺組織病理檢查像（Masson×200）
a、d. 對照組未見明顯藍色膠原沉積；b、e. BLM組肺泡間隔增寬、藍色膠原沉積明顯；c、f. BLM+4-PBA組肺泡間隔增寬、藍色膠原沉積較BLM組減輕；f. 肺組織纖維化評分（
2.2 小鼠存活率變化
對照組無小鼠死亡，BLM組至實驗結束生存率為65%。BLM+4-PBA組至實驗結束生存率為80%，且4-PBA干預后僅有1只小鼠死亡。BLM組和BLM+4-PBA組比較，小鼠存活率差異有統計學意義（χ2=7.925，P<0.05）。生存曲線顯示，從第15天（肺纖維化形成期）開始接受為期2周的4-PBA治療的肺纖維化模型小鼠的存活率顯著增高（圖3）。
圖3
小鼠生存曲線（n=20）
2.3 小鼠肺組織織羥脯氨酸含量
小鼠肺組織羥脯氨酸檢測結果顯示，BLM造模后，小鼠肺組織羥脯氨酸含量隨時間的延長逐漸增加，4-PBA治療能夠顯著減少羥脯氨酸的含量，減輕肺纖維化（圖4和表1）。
圖4
小鼠肺組織羥脯氨酸含量（n=5）
與BLM組比較，*
表1
小鼠肺組織羥脯氨酸含量（μg/g，n=5，
）
2.4 小鼠肺功能
三組小鼠第21天的FVC依次為（1.35±0.03）、（0.88±0.17）、（1.15±0.16）mL，差異具有統計學意義（F=19.067，P=0.003），FEV50依次為（1.13±0.03）、（0.79±0.14）、（0.90±0.14）mL，差異具有統計學意義（F=17.785，P=0.003），Cydn依次為（0.04±0.00）、（0.02±0.01）、（0.03±0.00）mL/cm H2O，差異具有統計學意義（F=28.193，P=0.001）。三組小鼠第28天的FVC依次為（1.23±0.01）、（0.50±0.13）、（0.99±0.15）mL，差異具有統計學意義（F=76.749，P=0.000），FEV50依次為（1.05±0.04）、（0.40±0.25）、（0.81±0.13）mL，差異具有統計學意義（F=21.063，P=0.002），Cydn依次為依次為（0.03±0.03）、（0.01±0.01）、（0.02±0.02）mL/cm H2O，差異具有統計學意義（F=33.694，P=0.000）。與對照組小鼠相比，BLM組小鼠的FVC、FEV50和Cydn顯著下降，且隨著時間延長，肺功能進一步下降。而接受4-PBA治療的小鼠FVC、FEV50和Cydn較BLM組明顯改善（圖5）。
圖5
小鼠肺功能
a. FVC（
2.5 小鼠肺組織ATF6和CHOP mRNA的表達
三組小鼠肺組織中第21天ATF6 mRNA相對表達水平依次為（0.86±0.16）、（2.20±0.55）、（1.45±0.57），差異具有統計學意義（F=16.489，P=0.002），CHOP mRNA相對表達水平依次為（0.82±0.19）、（2.45±0.46）、（1.65±0.18），差異具有統計學意義（F=227.230，P=0.000）。三組小鼠肺組織中第28天ATF6 mRNA相對表達水平依次為（0.92±0.12）、（3.87±0.82）、（1.98±0.18），差異具有統計學意義（F=91.959，P=0.001），CHOP mRNA相對表達水平依次為（0.87±0.20）、（4.45±0.43）、（1.66±0.17），差異具有統計學意義（F=161.136，P=0.000）。與對照組相比，BLM組肺組織中ATF6和CHOP的mRNA表達水平明顯增高，并隨時間延長增高更為明顯。4-PBA治療1周后BLM小鼠肺組織中ATF6和CHOP的mRNA表達水平顯著降低，并且在治療2周后，CHOP的mRNA表達水平低于ATF6。結果見圖6。
圖6
小鼠肺組織ATF6和CHOP mRNA的表達
a. 第21天ATF6 mRNA的表達（
2.6 小鼠肺組織ATF6和CHOP 蛋白的表達
三組小鼠肺組織中第21天ATF6蛋白相對表達水平依次為（0.91±0.08）、（2.27±0.53）、（1.50±0.36），差異具有統計學意義（F=23.700，P=0.001），CHOP蛋白相對表達水平依次為（0.82±0.18）、（2.49±0.09）、（1.65±0.27），差異具有統計學意義（F=184.029，P=0.000）。三組小鼠肺組織中第28天ATF6蛋白相對表達水平依次為（0.92±0.14）、（3.92±0.56）、（2.01±0.30），差異具有統計學意義（F=94.522，P=0.001），CHOP蛋白相對表達水平依次為（0.86±0.21）、（4.40±0.18）、（1.76±0.26），差異具有統計學意義（F=151.798，P=0.000）。與對照組相比，BLM組肺組織中ATF6和CHOP的蛋白表達水平明顯增高，并隨時間延長增高更能為明顯。4-PBA治療1周后可以降低BLM小鼠肺組織中ATF6和CHOP的蛋白表達水平，并且在治療2周后，CHOP的蛋白表達水平低于ATF6。結果見圖7。
圖7
小鼠肺組織ATF6和CHOP蛋白的表達
a. 第21天免疫印跡檢測電泳條帶圖（
3 討論
IPF是一種進行性、破壞性的肺部疾病，死亡率高且病因不明[18]。迄今為止，尚未發現治療該疾病的特效藥物。因此，尋找有效的藥物治療IPF至關重要。
BLM已被廣泛用于誘導嚙齒動物IPF模型，其誘導小鼠肺纖維化的機制可能與基底膜損傷、肺泡上皮細胞的損傷和凋亡、免疫炎癥反應、氧化應激、上皮間充質轉化及內質網應激有關[19-20]。內質網應激主要涉及3條信號通路，包括肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）通路、胰腺內質網激酶（pancreatic endoplasmic reticulum kinase，PERK）通路和ATF6介導的通路。正常生理條件下，IRE1α、PERK和ATF6和免疫球蛋白重鏈結合蛋白（immunoglobulin heavy chain-binding protein，BiP，又名GRP78）結合處于無活性狀態。由于BiP對錯誤折疊的蛋白質親和力較高，當錯誤折疊的蛋白質在內質網中堆積時，BiP與這3個內質網感受器解離，從而啟動相應的信號通路來保護和恢復內質網的功能[21]。但是，強烈或持久的內質網應激則通過半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）12，CHOP和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）啟動細胞凋亡信號通路[22]。近年來，越來越多的研究發現內質網應激在IPF的發生發展中發揮著重要作用[2, 23-26]。Baek 等[27]發現內質網應激標志物如GRP78、CHOP和ATF6在BLM誘導的肺纖維化小鼠和IPF患者肺組織中均高表達。動物實驗表明，BLM通過誘導內質網應激導致肺纖維化，其機制可能與肺泡上皮細胞凋亡有關[2]。此外，另有研究證實炎癥反應和細胞表型的調節也是其可能的機制[28]。因此，本研究用BLM制造小鼠肺纖維化模型，并予4-PBA干預，HE染色、Masson染色、ALI評分和肺纖維化評分評估各組小鼠肺組織炎癥程度與肺纖維化程度，測定肺組織羥脯氨酸含量，肺功能儀檢測呼吸功能指標，觀察小鼠生存率，qRT-PCR檢測肺組織中ATF6和CHOP mRNA的表達情況，蛋白印跡法檢測ATF6和CHOP蛋白的表達情況，初步探討4-PBA在肺纖維化中的作用及機制。
4-PBA已被證實在IPF中通過抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，減輕內質網應激而發揮保護作用[27]。Zhao等[29]在實驗的第0天起連續3周向BLM+4-PBA組小鼠腹腔內注射150 mg/kg的PBA，結果顯示PBA治療通過抑制內質網應激介導的EMT來減輕BLM造成的小鼠肺纖維化。本研究成功建立了小鼠肺纖維化模型，發現與對照組相比，BLM組小鼠肺組織炎癥和纖維化明顯增加，ALI評分和肺纖維化評分上調，ATF6和CHOP的mRNA及蛋白水平上調。在4-PBA治療后，BLM導致的肺組織膠原沉積明顯減輕，羥脯氨酸含量減少，內質網應激相關標志物表達降低，其中CHOP較ATF6降低更為顯著，小鼠肺功能改善，生存率提高。因此，我們推測4-PBA通過抑制內質抑制網應激減緩肺纖維化進展。
與Zhao等[29]不同，本研究選取造模后第15天進行干預，此時小鼠肺纖維化已經形成[30]，隨后觀察不同時間點4-PBA干預后IPF小鼠肺組織的病理改變及內質網應激標志物的表達情況，更符合臨床診治的特點。另外，本研究中使用的4-PBA劑量為500 mg/kg，證實了高劑量的4-PBA在IPF中起保護作用，但由于只采用了單一劑量的4-PBA，因此4-PBA治療的最佳劑量和持續時間仍有待深入研究。本研究只初步探討4-PBA可能通過ATF6途徑和CHOP途徑抑制內質網應激，從而在BLM誘導的肺纖維化中發揮保護作用，但對其確切機制的了解仍非常有限，后續還需更多的研究來深入探討4-PBA改善肺纖維化的具體分子機制。
總之，內質網應激是一種普適性的保護機制，本研究表明4-PBA通過抑制內質網應激有效地保護了BLM誘導的小鼠肺纖維化，這一發現可能為IPF的治療提供新的干預靶點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的，以尋常型間質性肺炎為病理特征的，慢性進展性纖維化性肺疾病。IPF的發病機制尚不明確，越來越多的證據表明，反復肺泡上皮損傷促使成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，導致不可逆性的細胞外基質沉積和肺組織重塑。IPF預后較差，除肺移植外，尚無有效地治療IPF的藥物[1-2]。研究表明，內質網應激通過誘導肺泡上皮細胞凋亡和促進成纖維細胞大量增殖而參與到IPF的發生發展過程中[3]。我們前期的實驗證實內質網應激分子標志物感受器活化轉錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）在博來霉素（bleomycin，BLM）誘導的肺纖維化小鼠肺組織中高表達，從而參與IPF的發生發展[4-5]。4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）除了作為氨清除劑外，也可作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑和內質網應激抑制劑[6-9]。研究證實4-PBA可減輕內質網應激[10]，在心肌肥大、急性腎損傷及心臟纖維化等多種疾病中起保護作用[7, 9, 11-13]，但其在IPF中的保護作用及機制尚未被深入研究。本研究旨在探索4-PBA在BLM誘導的肺纖維化小鼠中的作用，有助于深入理解IPF的發病機制，并為IPF提供一種新的治療策略。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和實驗材料
120只無特定病原體級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，20～22 g（上海斯萊克實驗動物有限公司），戊巴比妥鈉（上海博光生物科技有限公司），BLM（日本Nippon Kayaku公司），羥脯氨酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），RNA提取試劑盒（美國BIOMIGA公司），ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒（日本TOYOBO公司），合成引物（上海生工公司），Thunderbird SYBR qPCR Mix Kit（日本TOYOBO公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒（中國威奧生物科技公司），放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（上海索萊寶生物科技有限公司），十二烷基硫酸鈉聚丙凝膠配置試劑盒（中國威奧生物科技公司），牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA，美國Sigma公司），ATF6抗體（美國Abcam公司），CHOP抗體（美國Cell Signaling公司），β-肌動蛋白（β-actin）抗體（上海普邁生物科技有限公司），辣根過氧化物酶二抗（中國華安生物科技有限公司），微孔板分光光度計Epoch2（美國BioTek有限公司），ABI-7500熒光定量PCR反應擴增儀（美國ABI公司），Bio-Rad凝膠成像系統（美國Rio-Rad公司），小鼠肺功能檢測儀（美國DSI Buxco公司）。
1.2 實驗動物處理
雄性C57BL/6小鼠購買后在12 h明暗光照循環，溫度22～24 ℃和相對濕度50%～60%的環境中飼養，小鼠自由飲水和正常飲食。小鼠適應性飼養1周以后，隨機分為BLM組、BLM+4-PBA組和對照組，每組40只小鼠。動物實驗由蘇州大學實驗動物管理和使用委員會批準（批準號K18-028）。
所有小鼠在實驗的第0天用2%戊巴比妥鈉5 mL/kg腹腔注射麻醉。BLM組和BLM+4-PBA組小鼠在氣管內注射5.0 U/kg的BLM制造小鼠肺纖維化模型[14]，同時對照組小鼠氣管注射等體積的生理鹽水。參考文獻［15］，在實驗的第15天連續2周每天在BLM+4-PBA組腹腔內注射4-PBA（500 mg/kg），同時BLM組和對照組小鼠每天注射等體積的磷酸鹽緩沖液。在實驗的第21天和28天，每組各處死10只小鼠，各組余下的20只小鼠用于生存研究。
1.3 小鼠肺功能檢測
在實驗的第21和28天，各組隨機選擇5只小鼠，在小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后行氣管切開術，插入18G靜脈導管，將小鼠放入肺功能檢測系統的體積描記儀腔體中進行肺功能檢測，所有操作步驟按照DSI's Buxco公司的操作標準執行[16]。每只小鼠的肺功能指標用力肺活量（forced vital volume，FVC）、50毫秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 50 millisecond，FEV50）及動態肺順應性（dynamic compliance，Cdyn）測量3次，取平均值用于統計分析。測量完肺功能以后，所有存活的小鼠被處死，肺組織用于進一步評估。
1.4 小鼠肺組織膠原蛋白檢測
羥脯氨酸是膠原蛋白的標志性成分，為膠原纖維所特有。檢測羥脯氨酸來判斷肺纖維化程度。使用羥脯氨酸堿水解法試劑盒，按照說明書步驟操作，通過測定樣本水解液550 nm處吸光值，按照標準公式計算出小鼠肺組織羥脯氨酸的含量。
1.5 小鼠組織病理學
在實驗的第21和28天處死小鼠。肺組織以福爾馬林液固定后進行石蠟包埋切片，然后進行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和馬松（Masson）染色，顯微鏡下觀察。兩位有經驗的病理科醫生參照Ashcroft評分來獨立評估肺組織急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和肺纖維化程度[17]。
1.6 qRT-PCR檢測
在實驗的第21和28天，各組隨機選擇6只小鼠肺組織，使用RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA，使用分光光度計檢測RNA的濃度和純度。使用ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。將制備好的cDNA作為模版，根據引物（ATF6 F：5′-CGGTCCACAGACTCGTGTTC-3′，R：5′-GCTGTCGCCATATAAGGAAAGG-3′；CHOP F：5′-CTGGAAGCCTGGTATGAGGAT-3′，R：5′-CAGGGTCAAGAGTAGTGAAGGT-3′；β-actin F：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，R：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′）按照PCR反應條件，用ABI-7500熒光定量PCR進行Real time PCR擴增。以β-actin為內參，用2?△△Ct計算肺組織中ATF6和CHOP的mRNA相對表達水平。
1.7 蛋白印跡法檢測
在實驗的第21和28天，各組隨機選擇6只小鼠肺組織，使用RIPA裂解液提取肺組織全蛋白，用BCA蛋白定量檢測試劑盒定量檢測蛋白濃度。取15～20 μg蛋白進行電泳和電轉。用5% BSA封閉蛋白后，4 ℃孵育一抗ATF6抗體（1∶1000）、CHOP抗體（1∶1000）和β-actin抗體（1∶2000）過夜。次日，用含Tween 20的Tris緩沖液（TBS with Tween-20，TBST）洗脫后加辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2000），在室溫下孵育1 h，TBST洗脫后，使用化學發光法檢測蛋白表達，Bio-Rad凝膠成像系統掃描蛋白印記條帶，對蛋白表達情況進行定量分析。
1.8 統計學方法
實驗結果以均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用Student t檢驗法。多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni法。繪制生存曲線采用Kaplan-Meier法，生存時間比較采用log-rank檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。所有統計學分析采用GraphPad Prism5.0軟件完成。
2 結果
2.1 小鼠肺組織病理形態學變化
通過HE和Masson染色，BLM組小鼠肺組織病理圖片可見肺泡間隔增寬、炎癥細胞浸潤、肺組織結構破壞及膠原纖維沉積，并且這些病理改變隨時間延長逐漸加重。4-PBA干預顯著減少了BLM造成的小鼠肺組織損傷，減輕了肺部炎癥和纖維化（圖1a～f及圖2a～f）。對照組、BLM組和BLM+4-PBA組小鼠第21天肺組織ALI評分依次為（0.20±0.42）、（5.30±1.63）、（3.00±0.94）分，差異具有統計學意義（F=71.456，P=0.000）；第28天肺組織ALI評分依次為（0.10±0.32）、（3.50±1.18）、（1.80±0.63）分，差異具有統計學意義（F=58.170，P=0.000）。三組小鼠第21天的肺纖維化評分依次為（0.10±0.31）、（3.00±1.05）、（0.80±0.63）分，差異具有統計學意義（F=35.311，P=0.000），第28天的肺纖維化評分依次為（0.10±0.32）、（5.40±1.58）、（1.90±0.74）分，差異具有統計學意義（F=70.790，P=0.000）。BLM組小鼠ALI和肺纖維化評分明顯高于對照組，接受4-PBA治療的小鼠ALI和肺纖維化評分明顯低于BLM組（圖1g及圖2g）。
圖1
小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a、d. 對照組肺泡結構正常，無明顯病理改變；b、e. BLM組肺泡間隔增寬、炎癥細胞浸潤、肺組織結構破壞及膠原纖維沉積；c、f. BLM+4-PBA組肺泡間隔增寬、炎癥細胞浸潤、肺組織結構破壞及膠原纖維沉積較BLM組減輕；g. 肺組織急性肺損傷評分（
圖2
小鼠肺組織病理檢查像（Masson×200）
a、d. 對照組未見明顯藍色膠原沉積；b、e. BLM組肺泡間隔增寬、藍色膠原沉積明顯；c、f. BLM+4-PBA組肺泡間隔增寬、藍色膠原沉積較BLM組減輕；f. 肺組織纖維化評分（
2.2 小鼠存活率變化
對照組無小鼠死亡，BLM組至實驗結束生存率為65%。BLM+4-PBA組至實驗結束生存率為80%，且4-PBA干預后僅有1只小鼠死亡。BLM組和BLM+4-PBA組比較，小鼠存活率差異有統計學意義（χ2=7.925，P<0.05）。生存曲線顯示，從第15天（肺纖維化形成期）開始接受為期2周的4-PBA治療的肺纖維化模型小鼠的存活率顯著增高（圖3）。
圖3
小鼠生存曲線（n=20）
2.3 小鼠肺組織織羥脯氨酸含量
小鼠肺組織羥脯氨酸檢測結果顯示，BLM造模后，小鼠肺組織羥脯氨酸含量隨時間的延長逐漸增加，4-PBA治療能夠顯著減少羥脯氨酸的含量，減輕肺纖維化（圖4和表1）。
圖4
小鼠肺組織羥脯氨酸含量（n=5）
與BLM組比較，*
表1
小鼠肺組織羥脯氨酸含量（μg/g，n=5，）
2.4 小鼠肺功能
三組小鼠第21天的FVC依次為（1.35±0.03）、（0.88±0.17）、（1.15±0.16）mL，差異具有統計學意義（F=19.067，P=0.003），FEV50依次為（1.13±0.03）、（0.79±0.14）、（0.90±0.14）mL，差異具有統計學意義（F=17.785，P=0.003），Cydn依次為（0.04±0.00）、（0.02±0.01）、（0.03±0.00）mL/cm H2O，差異具有統計學意義（F=28.193，P=0.001）。三組小鼠第28天的FVC依次為（1.23±0.01）、（0.50±0.13）、（0.99±0.15）mL，差異具有統計學意義（F=76.749，P=0.000），FEV50依次為（1.05±0.04）、（0.40±0.25）、（0.81±0.13）mL，差異具有統計學意義（F=21.063，P=0.002），Cydn依次為依次為（0.03±0.03）、（0.01±0.01）、（0.02±0.02）mL/cm H2O，差異具有統計學意義（F=33.694，P=0.000）。與對照組小鼠相比，BLM組小鼠的FVC、FEV50和Cydn顯著下降，且隨著時間延長，肺功能進一步下降。而接受4-PBA治療的小鼠FVC、FEV50和Cydn較BLM組明顯改善（圖5）。
圖5
小鼠肺功能
a. FVC（
2.5 小鼠肺組織ATF6和CHOP mRNA的表達
三組小鼠肺組織中第21天ATF6 mRNA相對表達水平依次為（0.86±0.16）、（2.20±0.55）、（1.45±0.57），差異具有統計學意義（F=16.489，P=0.002），CHOP mRNA相對表達水平依次為（0.82±0.19）、（2.45±0.46）、（1.65±0.18），差異具有統計學意義（F=227.230，P=0.000）。三組小鼠肺組織中第28天ATF6 mRNA相對表達水平依次為（0.92±0.12）、（3.87±0.82）、（1.98±0.18），差異具有統計學意義（F=91.959，P=0.001），CHOP mRNA相對表達水平依次為（0.87±0.20）、（4.45±0.43）、（1.66±0.17），差異具有統計學意義（F=161.136，P=0.000）。與對照組相比，BLM組肺組織中ATF6和CHOP的mRNA表達水平明顯增高，并隨時間延長增高更為明顯。4-PBA治療1周后BLM小鼠肺組織中ATF6和CHOP的mRNA表達水平顯著降低，并且在治療2周后，CHOP的mRNA表達水平低于ATF6。結果見圖6。
圖6
小鼠肺組織ATF6和CHOP mRNA的表達
a. 第21天ATF6 mRNA的表達（
2.6 小鼠肺組織ATF6和CHOP 蛋白的表達
三組小鼠肺組織中第21天ATF6蛋白相對表達水平依次為（0.91±0.08）、（2.27±0.53）、（1.50±0.36），差異具有統計學意義（F=23.700，P=0.001），CHOP蛋白相對表達水平依次為（0.82±0.18）、（2.49±0.09）、（1.65±0.27），差異具有統計學意義（F=184.029，P=0.000）。三組小鼠肺組織中第28天ATF6蛋白相對表達水平依次為（0.92±0.14）、（3.92±0.56）、（2.01±0.30），差異具有統計學意義（F=94.522，P=0.001），CHOP蛋白相對表達水平依次為（0.86±0.21）、（4.40±0.18）、（1.76±0.26），差異具有統計學意義（F=151.798，P=0.000）。與對照組相比，BLM組肺組織中ATF6和CHOP的蛋白表達水平明顯增高，并隨時間延長增高更能為明顯。4-PBA治療1周后可以降低BLM小鼠肺組織中ATF6和CHOP的蛋白表達水平，并且在治療2周后，CHOP的蛋白表達水平低于ATF6。結果見圖7。
圖7
小鼠肺組織ATF6和CHOP蛋白的表達
a. 第21天免疫印跡檢測電泳條帶圖（
3 討論
IPF是一種進行性、破壞性的肺部疾病，死亡率高且病因不明[18]。迄今為止，尚未發現治療該疾病的特效藥物。因此，尋找有效的藥物治療IPF至關重要。
BLM已被廣泛用于誘導嚙齒動物IPF模型，其誘導小鼠肺纖維化的機制可能與基底膜損傷、肺泡上皮細胞的損傷和凋亡、免疫炎癥反應、氧化應激、上皮間充質轉化及內質網應激有關[19-20]。內質網應激主要涉及3條信號通路，包括肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）通路、胰腺內質網激酶（pancreatic endoplasmic reticulum kinase，PERK）通路和ATF6介導的通路。正常生理條件下，IRE1α、PERK和ATF6和免疫球蛋白重鏈結合蛋白（immunoglobulin heavy chain-binding protein，BiP，又名GRP78）結合處于無活性狀態。由于BiP對錯誤折疊的蛋白質親和力較高，當錯誤折疊的蛋白質在內質網中堆積時，BiP與這3個內質網感受器解離，從而啟動相應的信號通路來保護和恢復內質網的功能[21]。但是，強烈或持久的內質網應激則通過半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）12，CHOP和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）啟動細胞凋亡信號通路[22]。近年來，越來越多的研究發現內質網應激在IPF的發生發展中發揮著重要作用[2, 23-26]。Baek 等[27]發現內質網應激標志物如GRP78、CHOP和ATF6在BLM誘導的肺纖維化小鼠和IPF患者肺組織中均高表達。動物實驗表明，BLM通過誘導內質網應激導致肺纖維化，其機制可能與肺泡上皮細胞凋亡有關[2]。此外，另有研究證實炎癥反應和細胞表型的調節也是其可能的機制[28]。因此，本研究用BLM制造小鼠肺纖維化模型，并予4-PBA干預，HE染色、Masson染色、ALI評分和肺纖維化評分評估各組小鼠肺組織炎癥程度與肺纖維化程度，測定肺組織羥脯氨酸含量，肺功能儀檢測呼吸功能指標，觀察小鼠生存率，qRT-PCR檢測肺組織中ATF6和CHOP mRNA的表達情況，蛋白印跡法檢測ATF6和CHOP蛋白的表達情況，初步探討4-PBA在肺纖維化中的作用及機制。
4-PBA已被證實在IPF中通過抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，減輕內質網應激而發揮保護作用[27]。Zhao等[29]在實驗的第0天起連續3周向BLM+4-PBA組小鼠腹腔內注射150 mg/kg的PBA，結果顯示PBA治療通過抑制內質網應激介導的EMT來減輕BLM造成的小鼠肺纖維化。本研究成功建立了小鼠肺纖維化模型，發現與對照組相比，BLM組小鼠肺組織炎癥和纖維化明顯增加，ALI評分和肺纖維化評分上調，ATF6和CHOP的mRNA及蛋白水平上調。在4-PBA治療后，BLM導致的肺組織膠原沉積明顯減輕，羥脯氨酸含量減少，內質網應激相關標志物表達降低，其中CHOP較ATF6降低更為顯著，小鼠肺功能改善，生存率提高。因此，我們推測4-PBA通過抑制內質抑制網應激減緩肺纖維化進展。
與Zhao等[29]不同，本研究選取造模后第15天進行干預，此時小鼠肺纖維化已經形成[30]，隨后觀察不同時間點4-PBA干預后IPF小鼠肺組織的病理改變及內質網應激標志物的表達情況，更符合臨床診治的特點。另外，本研究中使用的4-PBA劑量為500 mg/kg，證實了高劑量的4-PBA在IPF中起保護作用，但由于只采用了單一劑量的4-PBA，因此4-PBA治療的最佳劑量和持續時間仍有待深入研究。本研究只初步探討4-PBA可能通過ATF6途徑和CHOP途徑抑制內質網應激，從而在BLM誘導的肺纖維化中發揮保護作用，但對其確切機制的了解仍非常有限，后續還需更多的研究來深入探討4-PBA改善肺纖維化的具體分子機制。
總之，內質網應激是一種普適性的保護機制，本研究表明4-PBA通過抑制內質網應激有效地保護了BLM誘導的小鼠肺纖維化，這一發現可能為IPF的治療提供新的干預靶點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
