miR-155/COX-2/PGE2信號通路在薯蕷皂苷改善哮喘小鼠氣道炎癥中的作用_《中國呼吸與危重監護雜志》

作者：

梁敏 ¹ , 邊俊梅 ¹ , 熊詩思 ¹ , 李彎 ¹ ,  江震 ²

1. 武漢大學附屬同仁醫院（武漢市第三醫院）兒科（湖北武漢 430074）;
2. 武漢市第九醫院（湖北武漢 430074）;

關鍵詞：

薯蕷皂苷哮喘氣道炎癥 microRNA-155 環氧合酶2/前列腺素E2

DOI：

10.7507/1671-6205.202111005

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的探究薯蕷皂苷（dioscin，Dio）對哮喘小鼠氣道炎癥的作用及microRNA-155（miR-155）/環氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）/前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）通路在其中的變化。方法 70只小鼠隨機分為對照（control）組、模型組、抑制劑（inhibitor）陰性對照組（inhibitor-NC組）、miR-155 inhibitor組、Dio組、Dio+miR-155模擬物（mimic）陰性對照組（Dio+mimic-NC組）、Dio+miR-155 mimic組，每組10只。采用屋塵螨誘導制備哮喘小鼠模型；酶聯免疫吸附試驗檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中PGE2、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotriene 1，CysLTs）、半胱氨酰白三烯受體1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1）和白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-13水平；蘇木精–伊紅和高碘酸希夫染色觀察氣道周圍炎癥細胞的浸潤情況及杯狀細胞分泌黏液的情況；實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測小鼠肺組織miR-155、COX-2 mRNA的表達水平；蛋白印跡法檢測小鼠肺組織COX-2蛋白表達。結果 miR-155 inhibitor和Dio能降低哮喘小鼠BALF中PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1和IL-4、IL-5、IL-13水平，減輕肺組織炎癥細胞浸潤和杯狀細胞黏液分泌情況，并降低肺組織miR-155、COX-2的mRNA和蛋白表達；而miR-155 mimic能明顯削弱Dio的抗哮喘作用。結論 Dio的抗哮喘作用可能與抑制miR-155/COX-2/PGE2途徑，進而減輕哮喘小鼠氣道炎癥有關。

引用本文： 梁敏, 邊俊梅, 熊詩思, 李彎, 江震. miR-155/COX-2/PGE2信號通路在薯蕷皂苷改善哮喘小鼠氣道炎癥中的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(11): 790-796. doi: 10.7507/1671-6205.202111005 復制

哮喘是以氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為主要病理生理特征的氣道炎性疾病^[1]，其病因和發病機制復雜，大量臨床研究證實Th1/Th2、Th17/Treg介導的免疫應答和炎癥在哮喘發病機制中發揮重要作用^[2-3]。近年來，不少研究發現微RNA（microRNA，miRNA，miR）通過調控靶基因參與機體病理生理過程，在哮喘發生、發展過程中，多種miRNA存在異常表達，如miR-144-3p^[4]、miR-155、miR-30a-3p^[5]等。miR-155是一種內源性非編碼RNA，在活化的B細胞、T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞高度表達，主要參與免疫細胞的發育和免疫反應^[6-7]。在哮喘中，miR-155可以結合環氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2），并維持COX-2 mRNA的穩定性^[8]，此外，miR-155表達與哮喘人氣道平滑肌細胞中COX-2的表達呈正相關，可增強COX-2的表達和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的分泌，并通過調控COX-2/PGE2途徑參與哮喘發病^[9-10]。

薯蕷皂苷（dioscin，Dio）是一種甾體皂苷，在許多藥用植物中大量表達，例如薯蕷。這種天然產物具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒和保肝活性^[11]，對卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的哮喘小鼠的氣道炎癥具有顯著的改善作用^[12-13]，通過抑制COX-2水平，可減輕博來霉素誘導的小鼠肺部炎癥反應^[14]。然而，關于Dio對哮喘的作用機制的研究較少，尤其是屋塵螨（house dust mite，HDM）誘導的哮喘的影響研究。因此，我們探討了Dio在HDM誘導的哮喘小鼠模型中的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性健康SPF級Balb/c小鼠70只，6～8周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證為SCXK（京）2019-0009。小鼠飼養于武漢大學（醫學研究院）［使用許可證為SYXK（鄂）20180102］，放在可控制的光照下保持12 h明暗交替，溫度（20±2）℃，相對濕度45%～60%，可以自由獲取食物和水。研究得到本院實驗動物倫理委員會核準同意（批準號20190000237）。

1.2 藥品及試劑

Dio（HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司，貨號B21176）；HDM（美國Greer Labs，貨號XPB81D3A25）；小鼠miR-155抑制劑（inhibitor）和inhibitor陰性對照、miR-155模擬物（mimic）和mimic陰性對照以及PCR引物序列購自Gene Pharma公司（中國上海）；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑和二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（碧云天生物科技公司，批號分別為C0105、P0013B、P0012S）；小鼠PGE2、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（ml037542、ml002095、ml064310、ml063157、ml063123，上海酶聯生物科技有限公司）；小鼠半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotriene 1，CysLTs。貨號CD-106750）、半胱氨酰白三烯受體1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLTR1。貨號CD-103254）ELISA試劑盒（武漢純度生物科技有限公司）；高碘酸希夫（periodic acid-schiff，PAS）染色試劑盒（G1285，北京索萊寶科技有限公司）；兔抗小鼠COX-2（ab179800）、β-肌動蛋白（β-actin。貨號ab8227）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG二抗（ab205718）購自英國Abcam公司。iMark680多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）、BX61電動顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及藥物處理

小鼠適應性飼養7 d后開始實驗。70只小鼠隨機分為對照（control）組、模型組、inhibitor陰性對照組（inhibitor-NC組）、miR-155 inhibitor組、Dio組、Dio+miR-155 mimic陰性對照組（Dio+mimic-NC組）、Dio+miR-155 mimic組，每組10只。其中，對照組、模型組、Dio組用于探索Dio的作用；inhibitor-NC組、miR-155 inhibitor組、Dio+mimic-NC組、Dio+miR-155 mimic組用于探索Dio作用機制。根據文獻［15］的方法制備哮喘小鼠模型：除對照組外，其余組小鼠分別在實驗第1、7、14 d腹腔注射HDM 0.1 mL（0.5 mg/mL），第21～23 d開始連續3 d滴鼻，每天1次滴鼻10 μL的HDM（2.5 mg/mL）激發；對照組給予等量PBS溶液。于第17 d開始，inhibitor-NC組與miR-155 inhibitor組尾靜脈注射0.3 mL的miR-155 inhibitor陰性對照和miR-155 inhibitor；Dio+mimic-NC組和Dio+miR-155 mimic組尾靜脈注射0.3 mL的miR-155 mimic陰性對照和miR-155 mimic，然后給予Dio混懸液（60 mg/kg）灌胃^[12]，1次/d，共7次；Dio組給予Dio混懸液（60 mg/kg）灌胃，1次/d，共7次^[12]；最后一次激發24 h后處死小鼠并取材。

1.3.2 小鼠一般狀態觀察

觀察致敏和激發前后各組小鼠的行為學變化，是否有氣促、呼吸困難、打噴嚏、煩躁不安、喘息等典型的哮喘癥狀。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液中炎性相關因子的測定

處死小鼠，放入75%乙醇中浸泡2 min后暴露氣管，行氣管插管，結扎右肺，用注射器將0.3 mL的生理鹽水溶液緩慢注入左肺后回抽，以上過程重復3次，合并3次支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），紗布過濾去除黏液后離心（4 ℃、2000 r/min離心10 min），取上清保存于–20 ℃冰箱。按照ELISA試劑盒說明書的操作檢測各組小鼠BALF中PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1和Th2型細胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）水平。

1.3.4 肺組織病理學變化

取出小鼠的肺組織，生理鹽水沖洗后，濾紙吸干表面水分；左側肺組織分為兩部分，一部分液氮速凍后，–80 ℃冰箱保存，用于蛋白印跡法（Western blot），另一部分用于實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）；取右側肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，進行HE和PAS染色，觀察氣道周圍炎癥細胞的浸潤情況及杯狀細胞分泌黏液的情況；并對各組病理學進行分級評分；每只小鼠肺切片任取5個獨立區域進行評分，并取平均值。評分標準^[16-17]如下，0分為無炎癥細胞，染色面積<5%；1分為少許炎癥細胞，染色面積5%～25%；2分為炎癥細胞形成環狀，層厚為1個細胞，肺泡壁輕度增厚，染色面積25%～50%；3分為炎癥細胞成環狀，層厚為2～4個細胞，肺泡壁顯著增厚染色面積50%～75%；4分為炎癥細胞成環狀，層厚>4個細胞，肺泡壁顯著增厚，染色面積>75%。

1.3.5 RT-qPCR檢測肺組織miR-155、COX-2 mRNA的表達

使用TRIzol從各組織細胞中提取總RNA，按照試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA，進行PCR擴增。反應體系（20 μL）：cDNA（200 ng/μL）2 μL，SYBR^? Premix Ex Taq^TM（2×）10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH₂O 7.2 μL。反應條件：94 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，75 ℃延伸20 s，進行40個循環。用U6或甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為對照，miR-155、COX-2 mRNA的相對表達量采用2^–ΔΔCt方法計算。見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

表選項

下載CSV

基因	引物序列
miR-155	F: 5′-GCCTTAATGCTAATCGTGATAG-3′
R: 5′-TTCCGTATGCATCATGTGAGTA‐3′
U6	F: 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′
R: 5′-AAGAAACGATACAGATTGGAGTA-3′
COX-2	F: 5′-CAAGCACAATAGATGCACAAGAAG-3′
R: 5′-ATATAGAATGCGTAGAGAGGGGAG-3′
GAPDH	F: 5′-ATGGGTGTGAACCACGAGA‐3′
R: 5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA‐3′

1.3.6 Western blot檢測肺組織COX-2蛋白表達

按照試劑盒說明書的操作提取肺組織中的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后取等量蛋白質樣品上樣，十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（COX-2按1∶1000的比例稀釋；β-actin按1∶2000的比例稀釋），4 ℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，電化學發光顯色，以β-actin為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0和Image pro plus 6.0軟件進行統計分析。數據用均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間有差異進一步采用SNK-q檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠的一般狀態

模型組和inhibitor-NC組小鼠出現抓耳搔鼻、打噴嚏、煩躁不安、喘息等典型的哮喘癥狀，而miR-155 inhibitor組、Dio組和Dio+mimic-NC組小鼠的哮喘癥狀較HDM組明顯減少，Dio+miR-155 mimic組小鼠的哮喘癥狀較Dio組明顯增多，對照組小鼠表現正常。

2.2 各組小鼠肺組織病理學變化

對照組支氣管和肺泡結構清晰，未見明顯異常，且未見杯狀細胞增生；模型組和inhibitor-NC組小鼠肺組織支氣管和血管壁周圍可見大量炎癥細胞浸潤，杯狀細胞增生明顯（P<0.05）；與模型組相比，miR-155 inhibitor組、Dio組和Dio+mimic-NC組小鼠肺組織氣道炎癥明顯減輕，黏液分泌減少（P<0.05）；與Dio組相比，Dio+miR-155 mimic組小鼠肺組織氣道炎癥增加，黏液分泌增加（P<0.05）；與inhibitor-NC組相比，miR-155 inhibitor組小鼠肺組織氣道炎癥明顯減輕，黏液分泌減少（P<0.05）；與Dio+mimic-NC組相比，Dio+miR-155 mimic組小鼠肺組織氣道炎癥增加，黏液分泌增加（P<0.05）；見圖1、表2。

圖1 各組小鼠肺組織病理學變化（HE染色、PAS染色，200×）

對照組（①）小鼠肺部支氣管和肺泡結構清晰；模型組（②）和inhibitor-NC組（③）小鼠肺組織支氣管和血管壁周圍可見大量炎癥細胞浸潤，杯狀細胞增生明顯；miR-155 inhibitor組（④）、Dio組（⑤）和Dio+mimic-NC組（⑥）小鼠肺組織氣道周圍炎癥細胞浸潤和黏液分泌減少；Dio+miR-155 mimic組（⑦）小鼠肺組織氣道炎癥增加，黏液分泌增加。

圖選項

下載全尺寸圖像

下載幻燈片

表2 各組小鼠肺組織病理評分［（

），分，n=10］

表選項

下載CSV

組別	炎癥評分	黏液評分
對照組	0.00±0.00	0.00±0.00
模型組	3.26±0.25^a	2.34±0.21^a
inhibitor-NC組	3.23±0.24^a	2.36±0.24^a
miR-155 inhibitor組	1.75±0.17^abd	1.22±0.13^abd
Dio組	1.86±0.15^ab	1.41±0.15^ab
Dio+mimic-NC組	1.84±0.16^ab	1.43±0.17^ab
Dio+miR-155 mimic組	2.30±0.19^abce	1.87±0.18^abce
F值	364.707	226.018
P值	0.000	0.000
與對照組相比，^aP<0.05；與模型組相比，^bP<0.05；與Dio組相比，^cP<0.05；與inhibitor-NC組相比，^dP<0.05；與Dio+mimic-NC組相比，^eP<0.05。

2.3 各組小鼠BALF中炎性因子水平

與對照組相比，模型組和inhibitor-NC組小鼠BALF中PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1和IL-4、IL-5、IL-13水平顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，miR-155 inhibitor組、Dio組和Dio+mimic-NC組小鼠BALF中上述指標水平明顯降低（P<0.05）；與Dio組相比，Dio+miR-155 mimic組小鼠BALF中上述指標水平明顯升高（P<0.05）；與inhibitor-NC組相比，miR-155 inhibitor組小鼠BALF中上述指標水平明顯降低（P<0.05）；與Dio+mimic-NC組相比，Dio+miR-155 mimic組小鼠BALF中上述指標水平明顯升高（P<0.05）；見表3。

表3 各組小鼠BALF中炎性因子水平［（

），pg/mL，n=10］

表選項

下載CSV

組別	PGE2	TNF-α	CysLTs	CysLTR1	IL-4	IL-5	IL-13
對照組	82.17±8.15	51.29±6.04	17.53±1.86	12.66±1.35	11.54±1.39	40.21±6.05	82.30±9.24
模型組	174.34±13.22^a	116.30±7.59^a	38.61±2.47^a	33.74±2.01^a	97.26±11.08^a	127.60±14.29^a	165.17±20.52^a
inhibitor-NC組	168.45±14.17^a	120.54±8.13^a	40.39±3.02^a	31.86±2.55^a	100.15±10.93^a	130.45±15.36^a	171.29±21.30^a
miR-155 inhibitor組	116.27±10.26^abd	77.51±6.25^abd	23.42±2.18^abd	20.53±2.24^abd	52.48±6.73^abd	65.12±8.74^abd	108.06±15.81^abd
Dio組	125.98±12.21^ab	84.86±7.73^ab	29.08±2.45^ab	25.61±1.98^ab	64.10±7.82^ab	78.34±10.51^ab	113.42±14.57^ab
Dio+mimic-NC組	120.53±11.46^ab	87.21±8.42^ab	28.33±1.97^ab	23.49±2.12^ab	60.35±7.45^ab	73.50±8.47^ab	108.96±13.23^ab
Dio+miR-155 mimic組	157.30±13.55^abce	99.75±9.24^abce	36.70±2.83^ace	29.58±2.30^abce	85.04±10.16^abce	109.26±14.30^abce	140.15±17.64^abce
F值	76.101	95.523	120.561	119.513	130.076	85.939	39.477
P值	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000
與對照組相比，^aP<0.05；與模型組相比，^bP<0.05；與Dio組相比，^cP<0.05；與inhibitor-NC組相比，^dP<0.05；與Dio+mimic-NC組相比，^eP<0.05。

2.4 各組小鼠肺組織miR-155、COX-2 mRNA的表達

與對照組相比，模型組和inhibitor-NC組小鼠肺組織miR-155、COX-2 mRNA的表達顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，miR-155 inhibitor組、Dio組和Dio+mimic-NC組小鼠miR-155、COX-2 mRNA的表達明顯降低（P<0.05）；與Dio組相比，Dio+miR-155 mimic組小鼠COX-2 mRNA的表達明顯升高（P<0.05）；與inhibitor-NC組相比，miR-155 inhibitor組小鼠肺組織miR-155、COX-2 mRNA的表達明顯降低（P<0.05）；與Dio+mimic-NC組相比，Dio+miR-155 mimic組小鼠肺組織COX-2 mRNA的表達明顯升高（P<0.05）；見表4。

表4 各組小鼠肺組織miR-155、COX-2的表達［（

），n=10］

表選項

下載CSV

組別	miR-155	COX-2 mRNA	COX-2蛋白
對照組	1.00±0.00	1.00±0.00	0.35±0.04
模型組	1.89±0.12^a	2.06±0.19^a	0.86±0.07^a
inhibitor-NC組	1.92±0.15^a	1.99±0.17^a	0.83±0.05^a
miR-155 inhibitor組	1.43±0.13^abd	1.36±0.12^abd	0.41±0.06^bd
Dio組	1.56±0.11^ab	1.51±0.16^ab	0.53±0.04^ab
Dio+mimic-NC組	1.59±0.16^ab	1.55±0.14^ab	0.55±0.05^ab
Dio+miR-155 mimic組	1.70±0.15^ab	1.83±0.19^ace	0.70±0.06^abce
F值	59.906	61.228	135.846
P值	0.000	0.000	0.000
與對照組相比，^aP<0.05；與模型組相比，^bP<0.05；與Dio組相比，^cP<0.05；與inhibitor-NC組相比，^dP<0.05；與Dio+mimic-NC組相比，^eP<0.05。

2.5 各組小鼠肺組織COX-2蛋白表達

與對照組相比，模型組和inhibitor-NC組小鼠肺組織COX-2蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，miR-155 inhibitor組、Dio組和Dio+mimic-NC組小鼠COX-2蛋白表達明顯降低（P<0.05）；與Dio組相比，Dio+miR-155 mimic組小鼠COX-2蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與inhibitor-NC組相比，miR-155 inhibitor組小鼠肺組織COX-2蛋白表達明顯降低（P<0.05）；與Dio+mimic-NC組相比，Dio+miR-155 mimic組小鼠肺組織COX-2蛋白表達明顯升高（P<0.05）；見圖2、表4。

圖2 各組小鼠肺組織COX-2蛋白表達Western blot檢測像

圖選項

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3 討論

MiR-155是一種多效性microRNA，在調節炎癥反應中起關鍵作用。研究表明，哮喘患者的miR-155和COX-2、PGE2水平均升高；且在哮喘氣道平滑肌細胞中增加miR-155的表達可以提高COX-2蛋白的豐度，從而增加PGE2的分泌，使用COX-2選擇性抑制劑NS-398處理哮喘氣道平滑肌細胞可完全抑制PGE2的分泌^[9]；表明PGE2的分泌需要COX-2，抑制miR-155表達可以降低COX-2蛋白表達和PGE2分泌。COX-2通常在炎癥過程中被誘導，調節Th1、Th2和Th17細胞，與過敏原誘導的肺部炎癥的惡化、全身性炎癥和體內IgE產生有關^[18-19]。PGE2在過敏性肺部炎癥期間在氣道中產生，是一種有效的平滑肌松弛劑，同時也是一種有效的促炎介質，與多種炎癥性疾病有關。有研究顯示，PGE2可通過EP2促進B細胞分泌IgE，促進體內抗原特異性IgE反應，有助于哮喘的發展^[20]。在本研究中，在HDM誘導的哮喘小鼠中，miR-155和COX-2表達均升高，同時BALF中PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1水平和Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13水平均升高。CysLTs通過其受體CysLTR1可促使嗜酸性粒細胞聚集，促進氣道黏液分泌，引起氣道重塑，是哮喘發病過程中最重要的炎癥介質之一^[2]。病理結果顯示肺組織有大量炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生；而下調miR-155表達后，COX-2和PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1、Th2細胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）水平均降低，肺部炎癥減輕，這與以往的研究結果一致；提示，miR-155/COX-2/PGE2軸可能在調節哮喘氣道炎癥中起關鍵作用。

Dio是一類從藥用植物中分離出的甾體皂甙，已被證實具有抗哮喘作用，可抑制肺組織NF-κB活化和MAPK信號通路，進而抑制肺過敏性炎性因子生成，改善OVA誘發的哮喘模型中的氣道炎癥^[12-13]。Zhang等^[21]的研究顯示，Dio可通過調節miR-34a/Sirt1信號通路，降低COX-2和炎癥因子的表達，抑制炎癥、氧化–硝化應激和細胞凋亡，減輕順鉑引起的腎損傷；這表明Dio可通過調控miRNA，進而影響mRNA的表達。作為COX-2的上游調控因子，miR-155是否參與Dio對COX-2的調節及哮喘的改善作用還未可知。在本研究中，給予Dio干預后，發現哮喘小鼠肺組織中miR-155表達降低，同時COX-2、PGE2、TNF-α、CysLTs、CysLTR1水平均降低，肺部炎癥減輕，與miR-155 inhibitor治療效果一致；提示，Dio的抗哮喘作用可能與降低miR-155的表達有關。為了進一步驗證此結果，本研究在Dio干預的基礎上給予miR-155 mimic以上調miR-155表達，結果顯示，Dio對COX-2表達的抑制作用和抗哮喘作用被miR-155減弱。提示，Dio可能通過下調miR-155，降低COX-2的表達，進而抑制炎癥相關細胞因子的釋放，減輕哮喘小鼠氣道炎癥。

綜上所述，Dio的抗哮喘作用可能與抑制miR-155/COX-2/PGE2通路，進而減輕哮喘小鼠氣道炎癥有關。但本研究尚存在一定不足，首先，miR-155有多個靶基因，除了調節COX-2/PGE2信號通路外，是否有其他途徑參與Dio對哮喘氣道炎癥的改善作用仍有待進一步分析；其次，未對miR-155/COX-2/PGE2途徑下游相關免疫應答細胞因子（如Th1、Th2）水平進行檢測，后續會進行補充。此外，PGE2在哮喘發病機制中的作用存在一定爭議，一些研究表明PGE2在哮喘的發生、發展中起保護性作用^[22]；這與本研究結果看似矛盾，通過查閱資料發現，PGE2在哮喘中的作用（促進或抑制哮喘病理特征）可能與E-前列腺素（EP）受體亞型（EP1、2、3和4）有關，這些亞型在不同的駐留和浸潤氣道細胞上以不同水平表達^[23]。而Dio對PGE2的抑制作用是通過何種受體發揮抗哮喘作用的還未可知。因此，在未來的研究中將對PGE2受體亞型進行分析，進一步明確Dio的抗哮喘機制。

利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。