引用本文： 趙聰琳, 周永召, 楊洋, 蒙春莉, 劉凱. 宏基因組學二代測序在結核病診斷中的應用現狀及發展前景. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(9): 674-677. doi: 10.7507/1671-6205.202207067 復制
結核病是一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，2020年，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）指出全球新發結核病患者約為996萬，其中結核病死亡人數約141萬。中國是結核病的高發國家之一，約占全球結核病總數的8.5%[1]。近年來，耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的出現，給結核患者的治療帶來了新的難題[2]。MDR-TB患者治療總周期長，藥物不良反應多，治愈率較低，嚴重影響患者的生活質量[3]。早期的診斷和治療是改善結核病患者預后的關鍵環節。結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）復合群的病原微生物檢測方法主要包括培養、涂片鏡檢、Xpert MTB/RIF檢測等[4-7]。MTB培養是診斷結核病的金標準，但其敏感性低、耗時長，不能滿足快速臨床診斷的需求[8]。WHO推薦Xpert MTB/RIF檢測法作為一線診斷技術并協助MDR-TB的管理[2]，但在不同類型的標本中，Xpert MTB/RIF的特異性及敏感性差異較大，雖然在肺外樣本MTB的檢測中具有較高的特異性，但其敏感性有限[9]。
由于傳統微生物學診斷方法具有較大的局限性，及時、準確地診斷MTB感染較為困難。近年來，隨著分子生物技術的發展，宏基因組學二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）在臨床中得到了廣泛的應用。mNGS直接對樣本中的核酸序列進行高通量測序，不依賴于傳統病原微生物的培養，可以快速提供大量的病原學信息，包括病原微生物種屬、菌株、耐藥信息等，是一種高效靈敏的病原微生物診斷方法[10]，在結核病的快速診斷方面顯示出良好的臨床應用價值[5-6]。與傳統培養和Xpert MTB/RIF方法相比，mNGS在提高MTB檢測的敏感性和提供混合感染病原學信息方面具有優勢[7]。此外，mNGS與培養或Xpert MTB/RIF相結合可進一步提高MTB的檢測潛力[8]。
1 mNGS在肺結核診斷中的應用現狀
肺結核占結核病病例的80%，早期診斷肺結核對于預防疾病進展和改善預后至關重要。mNGS在肺結核診斷中，總體敏感性為44%～59.9%，特異性為88.9%～100%，優于傳統的病原學檢查方法[9]。對于肺結核患者，常見的樣本類型包括痰液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、肺組織和血液等[10]。痰液mNGS檢測的敏感性高于痰培養[11]，并且可以快速識別MDR-TB [12]。但是，在痰液標本中易混入上呼吸道定植菌，因此僅通過痰液mNGS結果區分感染與定植較為困難[13]。下呼吸道是一個相對無菌的解剖位置，BALF mNGS可提高病原體檢測的敏感性，為臨床診斷和治療提供指導[14]。mNGS在BALF與肺組織樣本中的診斷準確性差異無統計學意義，因此當BALF在特殊部位獲取病原學價值有限或者存在纖維支氣管鏡操作禁忌證的患者，可選擇肺組織作為mNGS的檢測樣本[15]。由于肺結核患者血液中可檢測到的MTB序列數量較少，血液mNGS的敏感性較低，故通常不采用血液作為肺結核患者mNGS的首選樣本[16]。綜上，mNGS可以作為疑似肺結核患者MTB的有效檢測方法，并推薦選擇BALF或肺組織作為首選的樣本類型[17]。mNGS的檢測目標為核酸序列，抗結核治療時間小于3個月不影響mNGS對MTB檢出的敏感性；但長期抗結核治療后，樣本的MTB負荷便會減少，從而使mNGS敏感性降低[18]。因此，在抗生素治療前進行收集樣本和診斷檢測具有重要意義。
臨床上，肺結核患者通常合并真菌感染，如煙曲霉、白色念珠菌、肺炎隱球菌等[19]。合并感染患者臨床表現多不典型，推薦將mNGS與血清學檢測相結合以提高合并感染診斷的準確性[9]。此外，全面評估結核病患者微生物群特征，探究患者微生態特征與臨床特征之間的關聯，對于結核病的診斷和治療十分重要。遺憾的是目前關于結核病患者整體病原微生態的研究較少，探索結核病患者病原微生態具有重要的臨床意義，可以為疾病精確診斷和治療提供新的思路[20]。
MTB是一種細胞內細菌，其特點是向細胞外釋放的核酸序列較少，因此mNGS只需檢測到1條屬水平的MTB核酸序列，即判斷為陽性[21]。mNGS使用單一的檢測方法識別多種病原體的能力顯示了其發現混合感染的潛力，然而呼吸道樣本的定植微生物會使mNGS結果的解釋復雜化[11]。因此，mNGS陽性結果的臨床解釋必須與患者臨床特征、影像學資料、實驗室檢查相結合[22]。
2 mNGS在肺外結核診斷中的應用
結核包括肺結核和肺外結核[23]，肺外結核的比例在全球范圍內逐漸升高[24]。結核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）患者每年約占所有新發結核病例的1%～5%[25]，是肺外結核最嚴重的類型，診斷和治療的延誤可能導致25%的患者預后較差[26]。mNGS在TBM的診斷中敏感性、特異性較高[27]，可以作為TBM的一線檢測手段。首次腰穿獲得的腦脊液，其mNGS檢測敏感性最高[28]。腦脊液中白細胞和蛋白水平升高或葡萄糖比值降低的患者，其mNGS出現陽性結果的可能性更大[29]。雖然mNGS提高了TBM的診斷效能，由于腦脊液中MTB負荷較低，mNGS不能作為TBM排除性診斷的檢測手段[30]，因此mNGS聯合其他診斷手段對臨床工作的指導意義更大[31]。除了MTB外，mNGS還可以檢測其他病原微生物，有助于腦膜炎的鑒別診斷[32]。盡管如此，mNGS在臨床應用中也面臨著巨大挑戰，包括信息解讀、樣本選擇等。目前關于mNGS在TBM中的應用研究較少，且部分結果存在爭議[27]，因此需要更多的研究來明確mNGS在中樞神經系統感染中的應用規范和臨床價值[29]。
此外，有部分研究也揭示了mNGS在其他類型肺外結核病診斷中的臨床價值。mNGS在漿液病原體檢測方面優于Xpert MTB/RIF[33]，結核性胸膜炎和結核性心包炎患者的胸水及心包積液中可檢測出MTB[28]。同時，mNGS在骨關節結核的診斷和合并感染的診斷等方面具有較大的應用前景 [34]。
3 mNGS對耐藥MTB的鑒定
隨著耐藥結核的日益增多，結核病的治療難度不斷增大，對MTB致病及耐藥機制的研究十分重要[35]。當前有多種方法可以檢測MTB的藥物敏感性，如表型分析、基因分型分析等，但其在臨床應用過程中存在一定的局限性，不能滿足臨床工作的需求[36]。隨著分子診斷技術的不斷發展，mNGS可以快速識別多個耐藥相關的基因靶點，提高耐藥結核的檢測效率和準確性[37]。目前的臨床研究主要集中在mNGS對于病原微生物的鑒定，mNGS耐藥基因檢測的報道較少，已有的報道指出可以使用mNGS技術來進行MTB的耐藥性分析[38-39]，進行MTB耐藥性的監測，指導抗結核藥物的選擇[40]，具有臨床應用潛能。在MTB耐藥性分析方面，mNGS需在檢測出病原微生物后才能進行細菌耐藥性的檢測[41]，分子耐藥基因診斷缺乏足夠的耐藥基因和耐藥表型的臨床研究數據，目前尚無標準化且全面的耐藥基因位點及突變信息。此外，mNGS不能確定耐藥基因來自于致病病原體或非致病致病菌[42-43]，在耐藥基因的檢測方面仍需要不斷進行技術以及流程優化[9]。
綜上所述，mNGS在結核病的快速診斷方面顯示出了良好的臨床價值，但在臨床應用過程中，仍然面對較多挑戰。首先，mNGS采集、運輸及檢測過程中可能存在定植菌的污染，導致結果的假陽性[44]。其次，缺乏結果判讀的統一標準，包括閾值的設定等，在解釋和分析數據方面較為困難[45]。此外，MTB的基因序列內部同源性較高，物種特異性序列較少，很難鑒定MTB菌株，必要時需聯合聚合酶鏈反應來進一步鑒定結核菌株[46]，mNGS的應用規范需要在臨床實踐中不斷驗證與完善。在病原微生物檢測方面，mNGS在某些方面具有獨特的優勢，但是其同時也存在一定的局限性，因此，臨床醫生需要根據患者實際情況在合適的時機選擇合適的樣本進行mNGS檢測，通過合理的結果解釋及分析，提高結核的診斷效率和準確性[47]。隨著宏基因組學三代測序和靶向測序等分子檢測方法的發展，結核病診斷的準確性將得到了進一步的提升，有望更好地輔助結核病的臨床診斷和治療。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。
結核病是一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，2020年，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）指出全球新發結核病患者約為996萬，其中結核病死亡人數約141萬。中國是結核病的高發國家之一，約占全球結核病總數的8.5%[1]。近年來，耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的出現，給結核患者的治療帶來了新的難題[2]。MDR-TB患者治療總周期長，藥物不良反應多，治愈率較低，嚴重影響患者的生活質量[3]。早期的診斷和治療是改善結核病患者預后的關鍵環節。結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）復合群的病原微生物檢測方法主要包括培養、涂片鏡檢、Xpert MTB/RIF檢測等[4-7]。MTB培養是診斷結核病的金標準，但其敏感性低、耗時長，不能滿足快速臨床診斷的需求[8]。WHO推薦Xpert MTB/RIF檢測法作為一線診斷技術并協助MDR-TB的管理[2]，但在不同類型的標本中，Xpert MTB/RIF的特異性及敏感性差異較大，雖然在肺外樣本MTB的檢測中具有較高的特異性，但其敏感性有限[9]。
由于傳統微生物學診斷方法具有較大的局限性，及時、準確地診斷MTB感染較為困難。近年來，隨著分子生物技術的發展，宏基因組學二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）在臨床中得到了廣泛的應用。mNGS直接對樣本中的核酸序列進行高通量測序，不依賴于傳統病原微生物的培養，可以快速提供大量的病原學信息，包括病原微生物種屬、菌株、耐藥信息等，是一種高效靈敏的病原微生物診斷方法[10]，在結核病的快速診斷方面顯示出良好的臨床應用價值[5-6]。與傳統培養和Xpert MTB/RIF方法相比，mNGS在提高MTB檢測的敏感性和提供混合感染病原學信息方面具有優勢[7]。此外，mNGS與培養或Xpert MTB/RIF相結合可進一步提高MTB的檢測潛力[8]。
1 mNGS在肺結核診斷中的應用現狀
肺結核占結核病病例的80%，早期診斷肺結核對于預防疾病進展和改善預后至關重要。mNGS在肺結核診斷中，總體敏感性為44%～59.9%，特異性為88.9%～100%，優于傳統的病原學檢查方法[9]。對于肺結核患者，常見的樣本類型包括痰液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、肺組織和血液等[10]。痰液mNGS檢測的敏感性高于痰培養[11]，并且可以快速識別MDR-TB [12]。但是，在痰液標本中易混入上呼吸道定植菌，因此僅通過痰液mNGS結果區分感染與定植較為困難[13]。下呼吸道是一個相對無菌的解剖位置，BALF mNGS可提高病原體檢測的敏感性，為臨床診斷和治療提供指導[14]。mNGS在BALF與肺組織樣本中的診斷準確性差異無統計學意義，因此當BALF在特殊部位獲取病原學價值有限或者存在纖維支氣管鏡操作禁忌證的患者，可選擇肺組織作為mNGS的檢測樣本[15]。由于肺結核患者血液中可檢測到的MTB序列數量較少，血液mNGS的敏感性較低，故通常不采用血液作為肺結核患者mNGS的首選樣本[16]。綜上，mNGS可以作為疑似肺結核患者MTB的有效檢測方法，并推薦選擇BALF或肺組織作為首選的樣本類型[17]。mNGS的檢測目標為核酸序列，抗結核治療時間小于3個月不影響mNGS對MTB檢出的敏感性；但長期抗結核治療后，樣本的MTB負荷便會減少，從而使mNGS敏感性降低[18]。因此，在抗生素治療前進行收集樣本和診斷檢測具有重要意義。
臨床上，肺結核患者通常合并真菌感染，如煙曲霉、白色念珠菌、肺炎隱球菌等[19]。合并感染患者臨床表現多不典型，推薦將mNGS與血清學檢測相結合以提高合并感染診斷的準確性[9]。此外，全面評估結核病患者微生物群特征，探究患者微生態特征與臨床特征之間的關聯，對于結核病的診斷和治療十分重要。遺憾的是目前關于結核病患者整體病原微生態的研究較少，探索結核病患者病原微生態具有重要的臨床意義，可以為疾病精確診斷和治療提供新的思路[20]。
MTB是一種細胞內細菌，其特點是向細胞外釋放的核酸序列較少，因此mNGS只需檢測到1條屬水平的MTB核酸序列，即判斷為陽性[21]。mNGS使用單一的檢測方法識別多種病原體的能力顯示了其發現混合感染的潛力，然而呼吸道樣本的定植微生物會使mNGS結果的解釋復雜化[11]。因此，mNGS陽性結果的臨床解釋必須與患者臨床特征、影像學資料、實驗室檢查相結合[22]。
2 mNGS在肺外結核診斷中的應用
結核包括肺結核和肺外結核[23]，肺外結核的比例在全球范圍內逐漸升高[24]。結核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）患者每年約占所有新發結核病例的1%～5%[25]，是肺外結核最嚴重的類型，診斷和治療的延誤可能導致25%的患者預后較差[26]。mNGS在TBM的診斷中敏感性、特異性較高[27]，可以作為TBM的一線檢測手段。首次腰穿獲得的腦脊液，其mNGS檢測敏感性最高[28]。腦脊液中白細胞和蛋白水平升高或葡萄糖比值降低的患者，其mNGS出現陽性結果的可能性更大[29]。雖然mNGS提高了TBM的診斷效能，由于腦脊液中MTB負荷較低，mNGS不能作為TBM排除性診斷的檢測手段[30]，因此mNGS聯合其他診斷手段對臨床工作的指導意義更大[31]。除了MTB外，mNGS還可以檢測其他病原微生物，有助于腦膜炎的鑒別診斷[32]。盡管如此，mNGS在臨床應用中也面臨著巨大挑戰，包括信息解讀、樣本選擇等。目前關于mNGS在TBM中的應用研究較少，且部分結果存在爭議[27]，因此需要更多的研究來明確mNGS在中樞神經系統感染中的應用規范和臨床價值[29]。
此外，有部分研究也揭示了mNGS在其他類型肺外結核病診斷中的臨床價值。mNGS在漿液病原體檢測方面優于Xpert MTB/RIF[33]，結核性胸膜炎和結核性心包炎患者的胸水及心包積液中可檢測出MTB[28]。同時，mNGS在骨關節結核的診斷和合并感染的診斷等方面具有較大的應用前景 [34]。
3 mNGS對耐藥MTB的鑒定
隨著耐藥結核的日益增多，結核病的治療難度不斷增大，對MTB致病及耐藥機制的研究十分重要[35]。當前有多種方法可以檢測MTB的藥物敏感性，如表型分析、基因分型分析等，但其在臨床應用過程中存在一定的局限性，不能滿足臨床工作的需求[36]。隨著分子診斷技術的不斷發展，mNGS可以快速識別多個耐藥相關的基因靶點，提高耐藥結核的檢測效率和準確性[37]。目前的臨床研究主要集中在mNGS對于病原微生物的鑒定，mNGS耐藥基因檢測的報道較少，已有的報道指出可以使用mNGS技術來進行MTB的耐藥性分析[38-39]，進行MTB耐藥性的監測，指導抗結核藥物的選擇[40]，具有臨床應用潛能。在MTB耐藥性分析方面，mNGS需在檢測出病原微生物后才能進行細菌耐藥性的檢測[41]，分子耐藥基因診斷缺乏足夠的耐藥基因和耐藥表型的臨床研究數據，目前尚無標準化且全面的耐藥基因位點及突變信息。此外，mNGS不能確定耐藥基因來自于致病病原體或非致病致病菌[42-43]，在耐藥基因的檢測方面仍需要不斷進行技術以及流程優化[9]。
綜上所述，mNGS在結核病的快速診斷方面顯示出了良好的臨床價值，但在臨床應用過程中，仍然面對較多挑戰。首先，mNGS采集、運輸及檢測過程中可能存在定植菌的污染，導致結果的假陽性[44]。其次，缺乏結果判讀的統一標準，包括閾值的設定等，在解釋和分析數據方面較為困難[45]。此外，MTB的基因序列內部同源性較高，物種特異性序列較少，很難鑒定MTB菌株，必要時需聯合聚合酶鏈反應來進一步鑒定結核菌株[46]，mNGS的應用規范需要在臨床實踐中不斷驗證與完善。在病原微生物檢測方面，mNGS在某些方面具有獨特的優勢，但是其同時也存在一定的局限性，因此，臨床醫生需要根據患者實際情況在合適的時機選擇合適的樣本進行mNGS檢測，通過合理的結果解釋及分析，提高結核的診斷效率和準確性[47]。隨著宏基因組學三代測序和靶向測序等分子檢測方法的發展，結核病診斷的準確性將得到了進一步的提升，有望更好地輔助結核病的臨床診斷和治療。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。