引用本文： 馮凈凈, 邵川, 李俊卿, 施天昀, 都勇, 揭志軍, 施勁東. 抑制p38絲裂素活化蛋白激酶途徑調控Th17和Treg失衡減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(1): 44-51. doi: 10.7507/1671-6205.202205020 復制
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）以肺泡–毛細血管膜炎癥損傷、多形核中性粒細胞黏附、活化和浸潤為特征，嚴重ALI可導致肺水腫、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最終出現呼吸衰竭[1]。促炎細胞因子參與的全身和局部炎癥反應在ALI病理生理學中起著重要作用，過度炎癥反應導致器官功能障礙，進而發展為ARDS[2]。盡管目前對ALI/ARDS的治療研究較多，但仍然缺乏有效的治療措施。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）被廣泛用來建立ALI/ARDS小鼠模型，氣道內注射LPS已被證明會損傷上皮細胞層，誘導上皮細胞凋亡，并導致活性氧、促炎細胞因子和趨化因子的釋放，導致中性粒細胞聚集及肺組織損傷[3]。p38絲裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是MAPK家族成員之一。多種細胞外刺激可激活p38 MAPK，包括滲透和熱應激、生長因子、炎癥細胞因子和紫外線輻射，p38 MAPK影響各種細胞過程，包括增殖、分化、凋亡和炎癥[4]。LPS刺激可激活MAPKs信號通路參與炎癥反應的形成，亦有研究證實MAPKs信號轉導通路參與了LPS誘導的ALI肺組織內炎性細胞的浸潤，并發揮著重要作用[5]。研究顯示通過抑制MAPKs和白細胞介素（interleukin，IL）-6/STAT3信號通路可改善LPS誘導的ALI[6]。SB203580已被鑒定是p38 MAPK抑制劑的分子靶點，更有效果且毒性更低，它的抗炎作用已被許多研究證實[7]。調節性T細胞（regulatory cells，Treg）和Th17細胞是CD4+ T細胞的兩個亞群，在功能上具有相反的作用。Treg表達表面標志物CD25，并參與抑制過度的T細胞對自身和非自身抗原的反應，叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）是Treg發育和功能的關鍵轉錄因子，Treg細胞在ALI發病過程種起到了重要作用[8]。白細胞介素（interleukin，IL）-17A是Th17細胞釋放的主要細胞因子，可誘導呼吸道上皮產生有利于中性粒細胞浸潤的趨化因子，作為促炎介質參與ARDS的發生[9]。Treg和Th17之間的平衡對于避免肺損傷期間的組織炎癥至關重要。研究顯示阻斷IL-2誘導的T細胞激酶信號可以通過調節Th17/Treg減弱ALI所致的氧化應激反應[10]。本研究擬通過腹腔注射LPS建立ALI小鼠模型，觀察p38 MAPK信號通路在其中的作用，并通過抑制劑SB203580的作用阻斷p38 MAPK信號通路的作用，觀察Th17和Treg細胞平衡的變化，探討該信號通路是否可以通過調控Th17和Treg平衡發揮肺保護作用。
1 材料與方法
1.1 實驗分組和動物模型制備
健康雄性Balb/c小鼠由中國上海實驗動物研究所提供，小鼠體重在18～20 g，所有實驗均經復旦大學上海醫學院動物保護與使用委員會批準后實施。將小鼠隨機分為對照組（n=8）、ALI組（n=8）和干預組（n=32）。對照組小鼠注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），ALI組小鼠腹腔注射40 mg/kg體重的LPS（Sigma，大腸桿菌O55∶B5），而干預組小鼠分別在LPS給藥前1 h腹腔注射濃度為0.5、1、2、5 mg/kg體重的SB203580（Sigma）。各組小鼠均于腹腔注射LPS 12 h后，通過心包穿刺取血并處死小鼠。
1.2 方法
1.2.1 肺組織病理學檢測
肺組織正常固定、脫水、包埋、切片獲得蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片。每個HE染色切片隨機選擇4個高倍視野，采用盲法選取兩位觀察者對肺組織病理變化程度進行評分，炎癥評分采用5分制[11]，比較肺組織和炎性細胞的變化。
1.2.2 肺泡灌洗液中總蛋白的表達及細胞計數
氣管內插管進行2次1 mL PBS清洗，獲取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。300 g離心10 min，PBS重懸細胞，采用貝克曼庫爾特（Beckman Coulter）計數。用Bradford蛋白測定試劑盒（BioRad，Hercules，CA）在595 nm讀取上清蛋白含量，使用MAXline Kinetic microplate閱讀器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA），以牛血清白蛋白為標準。
1.2.3 實時聚合酶鏈反應檢測RORγt和Foxp3 mRNA表達
將新鮮采集的肺左下葉快速冷凍，并在80 ℃保存。使用RNeasy Mini Kit試劑（Qiagen，美國）從冷凍組織中提取總RNA。采用實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測組織中視黃酸受體相關孤兒受體γt（retinoic acid receptor-related orphan receptor-γt，RORγt）和叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）mRNA表達量，β-肌動蛋白（β-actin）為管家基因。反應體系共25 μL，其中RNA模板（2.5 μL）、正向引物（10 μmol/L 0.75 μL），反向引物（10 μmol/L 0.75 μL）；20×Eva Green （12.5 μL），ddH2O （6.25 μL）。在Eppendorf擴增儀上進行擴增，反應條件為：42 ℃反轉錄30 min，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸40 s，40個循環，退火延伸溫度時收集熒光，加溶解曲線。根據CT值計算對照組與實驗組目的基因的相對表達量。基因特異性引物序列見表1。
表1
PCR引物
1.2.4 酶聯免疫吸附試驗檢測肺組織及血清中細胞因子的表達
提取新鮮肺組織細胞總蛋白，4 ℃離心，12000 g 30 min。收集上清液，利用酶聯免疫吸附試驗試劑盒測量細胞因子IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-17、IL-10、IL-23和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β。R&D，Minneapolis，MN，美國）。每個樣本做復孔。
1.2.5 流式細胞術檢測脾臟組織中Th17和Treg細胞的表達
取脾臟組織，將組織解剖成小塊、研磨，然后通過無菌網過濾提取單細胞懸浮液。紅細胞溶解后進行流式細胞分析。利用CD4+CD25+ Foxp3+標記Treg細胞，淋巴細胞懸液中染色熒光標記的表面抗體，CD4（FITC標記。GK1.5；eBioscience，San Diego，CA，美國）和CD25（PerCP-Cy5.5標記。PC61.5；eBioscience），4 ℃避光環境中孵育30 min，再用Foxp3（PE標記）染色，在1×Fix/Perm緩沖液（eBioscience）中固定和滲透破膜30 min。CD3+CD4+IL-17A+標記Th17淋巴細胞，將細胞與CD3（PB標記）CD4（FITC標記）孵育表面染色，固定通透后，再用IL-17A （PE標記。eBio17B7；eBioscience）染色。PBS洗滌3次后，重懸細胞并接受流式細胞儀（BD Bioscience，San Jose，CA，美國）檢測。使用FlowJo 7.6版軟件（TreeStar，Ashland，OR）對數據進行分析。
1.3 統計學方法
使用GraphPad Prism 5軟件（GraphPad software，La Jolla，CA，美國）進行統計學分析。呈正態分布的計量數據以均數±標準差（
±s）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 p38 MAPK抑制劑能減輕LPS引起的肺組織損傷
HE染色光鏡下觀察評價小鼠肺組織病理變化（圖1）。結果可見ALI組小鼠較對照組肺組織內可見明炎性細胞浸潤，肺泡間質增厚，經SB203580干預組間質增厚較ALI組減輕，炎性細胞浸潤減少。在5 mg/kg SB203580干預組，小鼠的組織學基本恢復正常。ALI組小鼠肺組織炎性評分較對照組明顯升高（P<0.05），SB203580干預后肺組織炎性評分減低，且與用藥濃度呈一定相關性，用藥濃度越高，炎癥評分越低。結果見圖2。
圖1
各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a. 對照組；b. ALI組；c. 0.5 mg/kg藥物干預組；d. 1 mg/kg藥物干預組；e. 2 mg/kg藥物干預組；f. 5 mg/kg藥物干預組。ALI組小鼠較對照組肺組織內可見明炎性細胞浸潤，肺泡間質增厚，經SB203580干預組間質增厚較ALI組減輕，炎性細胞浸潤減少。在5 mg/kg SB203580干預組，小鼠的組織學基本恢復正常。
圖2
各組小鼠肺組織病理評分
與對照組比較，#
2.2 p38 MAPK抑制劑減輕肺泡灌洗液中炎性細胞浸潤及蛋白分泌
與肺組織病理變化結果一致，LPS刺激后的小鼠BALF中的細胞總數和蛋白較對照組增加（P<0.05）。SB203580干預組細胞數量和蛋白均明顯減少。與對照組比較，BALF中單核細胞和中性粒細胞在ALI組明顯升高。SB203580干預組總細胞數較ALI組有所下降，且隨著用藥濃度的增加，下降程度越明顯，其中單核細胞和中性粒細胞在ALI組均有明顯升高，藥物干預后有所下降。結果見圖3。
圖3
SB203508對LPS誘導的ALI小鼠BALF中細胞數量和蛋白的影響
a. 細胞總數；b. 蛋白；c. 中性粒細胞計數；d. 巨噬細胞計數。與對照組比較，#
2.3 p38MAPK抑制劑能減輕Th17相關細胞因子的分泌，促進IL-10的表達
ALI組肺組織中IL-17、IL-23、TGF-β和IL-10細胞因子的表達較對照組均有明顯的升高，SB203580干預后，血清中IL-6、TNF-α以及肺組織中IL-17、IL-23和TGF-β的表達受到抑制，其中TGF-β的表達的降低與SB203580呈濃度依賴性，IL-6、IL-23和IL-17在1 mg/kg的SB203580的濃度下抑制作用最明顯。IL-10的表達呈相反趨勢，SB203580干預組小鼠肺組織IL-10水平明顯高于ALI組，經SB203580干預后能明顯促進IL-10的表達，與濃度呈正相關。結果見圖4。
圖4
SB203508對LPS誘導的ALI小鼠血清及肺組織中炎性細胞因子的影響
a. 血清IL-6；b. 血清TNF-α；c. 肺組織IL-10；d. 肺組織IL-6；e. 肺組織IL-23；f. 肺組織IL-17；g. 肺組織TGF-β。與對照組比較，#
2.4 p38MAPK抑制劑可抑制Th17相關轉錄因子RORγt mRNA的表達，而促進Treg相關轉錄因子Foxp3 mRNA的表達
ALI組RORγt mRNA表達明顯高于對照組，而SB203508組RORγt mRNA表達明顯低于對照組。LPS也能誘導Foxp3 mRNA的表達，經SB203580干預后，小鼠肺組織中Foxp3 mRNA的表達水平進一步升高，明顯高于ALI組。經SB203580干預后，轉錄水平RORγt/Foxp3比值降低，肺組織內更傾向于Foxp3的表達。結果見圖5。
圖5
SB203508對LPS誘導的ALI小鼠肺組織RORγt和Foxp3 mRNA表達的影響
a. 肺組織RORγt；b. 肺組織Foxp3；c. 肺組織RORγt與Foxp3的比值。與對照組比較，#
2.5 p38MAPK抑制劑可以糾正LPS導致的Th17/Treg細胞表達失衡
與正常小鼠比較，LPS所致的ALI小鼠脾臟淋巴細胞中Treg和Th17細胞數量均有明顯增加。Th17/Treg平衡狀態中傾向于Th17細胞的增多。SB203580干預后增加了Treg細胞的數量，降低了Th17細胞的比例。5 mg/kg SB203580干預組Th17/Treg比值降低，接近于對照組小鼠。結果見圖6。
圖6
SB203508對LPS誘導的ALI小鼠脾臟Th17和Treg細胞表達的影響
a. Th17細胞亞群流式細胞檢測像；b. Treg細胞流式細胞檢測像；c. Th17細胞亞群流式細胞檢測結果；d. Treg細胞流式細胞檢測結果；e. Th17細胞亞群與Treg細胞的比值。A. 對照組；B. ALI組；C. 0.5 mg/kg藥物干預組；D. 1 mg/kg藥物干預組；E. 2 mg/kg藥物干預組；F. 5 mg/kg藥物干預組。與對照組比較，#
3 討論
肺內中性粒細胞等炎癥細胞的浸潤和炎癥介質的釋放是ALI的主要特征之一[12]。當肺部受到病原微生物攻擊時，中性粒細胞在肺微血管、間質和支氣管肺泡間隙聚集，并分泌蛋白酶，陽離子化合物和活性氧化劑等有效抗菌分子。然而，中性粒細胞的遷移及炎癥過度反應也會導致肺泡腔的機械性損傷及加重肺泡腔內的滲出，從而發生ALI/ARDS[13]。本研究通過腹腔注射LPS建立ALI動物模型，LPS誘導肺組織出現炎癥反應和BALF中炎癥細胞及總蛋白水平的增加。SB203508干預后，LPS誘導的ALI小鼠肺泡灌洗液中各類細胞數和蛋白減少，HE染色提示肺部炎癥有所減輕，提示SB203508可抑制炎癥反應和炎性細胞的聚集，減輕LPS誘導的小鼠肺損傷，這種保護作用與劑量呈正相關。
LPS刺激導致的炎癥反應是一個復雜的細胞因子網絡，TNF-α、IL-6和其他促炎化合物的釋放可引發、放大和延續炎癥級聯反應。IL-1β、IL-6和TNF-α被認為是ALI嚴重程度的預測指標[14]。研究發現車前草苷可以抑制p38MAPK信號通路的激活，減少IL-6和TNF-α等促炎性細胞因子的釋放，減輕ALI小鼠的肺組織炎癥反應[15]。IL-6細胞因子水平的下降，可以通過影響Th17和Treg細胞平衡減輕大鼠模型中宮內感染誘導早產兒的ARDS[16]。通過以上的研究結果推測p38MAPK信號通路的抑制使得IL-6等促炎性細胞因子分泌減少，IL-6可以通過影響Th17/Treg平衡影響ARDS的疾病進程。本研究發現經ALI小鼠體內存在IL-6細胞因子的過表達，干預組小鼠經SB203580干預后IL-6的表達明顯下降，在1 mg/kg的劑量時抑制效果最明顯，更多的藥物濃度并沒有帶來更明顯的IL-6水平的下降。Th17細胞的分化與IL-1、IL-6及轉化生長因子相關聯[17]。本研究還發現ALI組小鼠Th17細胞及相關細胞因子的表達明顯升高，而干預組小鼠Th17細胞表達及相關細胞因子的分泌明顯下降，這與IL-6的表達水平相一致，推測p38 MAPK信號通路被抑制后引起IL-6分泌的減少，進而減少了Th17細胞的生成。
Th17細胞在防御細胞外病原體中發揮關鍵作用，并參與許多自身免疫性炎癥的形成。Treg細胞的主要功能是調節免疫應答的平衡，控制T細胞對病原體、嚴重炎癥和組織破壞的適度應答。已有多項研究發現Th17和Treg細胞參與ALI/ARDS的病理過程。Yu等[18]研究發現ARDS患者外周血單核細胞中能檢測到Th17細胞和相關的細胞因子IL-17的升高，ALI/ARDS的發病過程中會打破Th17細胞和Treg細胞平衡，該失衡狀態進一步導致ALI/ARDS的進展。Treg細胞主要通過細胞與細胞之間的接觸和分泌抑制性細胞因子IL-10和TGF-β1調節肺組織內免疫應答，對ALI/ARDS起保護作用[19]。Treg細胞的免疫調節功能通過一系列的細胞因子實現，主要有IL-10和TGF-β1，D'Alessio等[20]研究發現ALI小鼠和患者BALF中增多的Treg細胞可通過誘導TGF-β1和中性粒細胞的凋亡來減輕ALI的病理反應。既往研究發現Treg細胞分泌的IL-10是Treg細胞產生的保護性免疫調節細胞因子，IL-10可通過抑制TNF-α的產生在ALI/ARDS病理過程中起保護作用[21]，IL-10的作用被抑制將加重ARDS的病理反應[22]。本研究也發現ALI組小鼠體內IL-10表達明顯升高，干預組小鼠IL-10的表達進一步升高。我們推測，抑制p38 MAPK信號通路可以通過調控如IL-10細胞因子的分泌，刺激Foxp3 mRNA的表達和Treg細胞的生成，從而發揮了對ALI的肺保護作用。TGF-β主要通過p38 MAPK和SMAD3信號通路參與炎癥反應作用過程[23]。本研究也證實在抑制p38MAPK信號通路后，TGF-β的表達明顯被抑制。我們的前期研究提示阻斷p38 MAPK能抑制Th17細胞分泌相關細胞因子[24]。本實驗結果也顯示ALI小鼠中Th17和Treg細胞及其分泌的細胞因子均有升高，抑制p38 MAPK信號通路能調控Th17和Treg細胞分化過程中的關鍵細胞因子而調控Th17/Treg平衡，最終減輕肺組織損傷。
綜上所述，LPS誘導ALI小鼠模型中，存在Th17/Treg細胞功能失衡現象。應用p38 MAPK抑制劑可抑制Th17相關轉錄因子RORγt mRNA的表達，進而減少IL-6、IL-23和TNF-α促炎因子的分泌，且促進Treg相關轉錄因子Foxp3 mRNA的表達，進而增加抑炎因子IL-10的分泌，最終在BALF炎癥指標和組織病理學層面觀察到ALI的減輕，且這種作用在一定范圍內劑量與療效呈正相關。因此，我們推測p38 MAPK抑制劑可能通過改變Th17/Treg失衡狀態減輕LPS所致的小鼠肺損傷程度，提示p38 MAPK可能是ALI/ARDS治療的一個潛在靶點。本研究還存在一定的局限性，首先，僅開展了小鼠動物模型實驗，需要進一步通過ALI/ARDS患者血液樣本及BALF樣本進行驗證；其次，造模使用的方法為腹腔注射LPS，僅代表革蘭陰性桿菌感染所致ALI；最后，沒有對p38 MAPK抑制劑調控Th17和Treg細胞的具體信號通路各環節進行研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）以肺泡–毛細血管膜炎癥損傷、多形核中性粒細胞黏附、活化和浸潤為特征，嚴重ALI可導致肺水腫、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最終出現呼吸衰竭[1]。促炎細胞因子參與的全身和局部炎癥反應在ALI病理生理學中起著重要作用，過度炎癥反應導致器官功能障礙，進而發展為ARDS[2]。盡管目前對ALI/ARDS的治療研究較多，但仍然缺乏有效的治療措施。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）被廣泛用來建立ALI/ARDS小鼠模型，氣道內注射LPS已被證明會損傷上皮細胞層，誘導上皮細胞凋亡，并導致活性氧、促炎細胞因子和趨化因子的釋放，導致中性粒細胞聚集及肺組織損傷[3]。p38絲裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是MAPK家族成員之一。多種細胞外刺激可激活p38 MAPK，包括滲透和熱應激、生長因子、炎癥細胞因子和紫外線輻射，p38 MAPK影響各種細胞過程，包括增殖、分化、凋亡和炎癥[4]。LPS刺激可激活MAPKs信號通路參與炎癥反應的形成，亦有研究證實MAPKs信號轉導通路參與了LPS誘導的ALI肺組織內炎性細胞的浸潤，并發揮著重要作用[5]。研究顯示通過抑制MAPKs和白細胞介素（interleukin，IL）-6/STAT3信號通路可改善LPS誘導的ALI[6]。SB203580已被鑒定是p38 MAPK抑制劑的分子靶點，更有效果且毒性更低，它的抗炎作用已被許多研究證實[7]。調節性T細胞（regulatory cells，Treg）和Th17細胞是CD4+ T細胞的兩個亞群，在功能上具有相反的作用。Treg表達表面標志物CD25，并參與抑制過度的T細胞對自身和非自身抗原的反應，叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）是Treg發育和功能的關鍵轉錄因子，Treg細胞在ALI發病過程種起到了重要作用[8]。白細胞介素（interleukin，IL）-17A是Th17細胞釋放的主要細胞因子，可誘導呼吸道上皮產生有利于中性粒細胞浸潤的趨化因子，作為促炎介質參與ARDS的發生[9]。Treg和Th17之間的平衡對于避免肺損傷期間的組織炎癥至關重要。研究顯示阻斷IL-2誘導的T細胞激酶信號可以通過調節Th17/Treg減弱ALI所致的氧化應激反應[10]。本研究擬通過腹腔注射LPS建立ALI小鼠模型，觀察p38 MAPK信號通路在其中的作用，并通過抑制劑SB203580的作用阻斷p38 MAPK信號通路的作用，觀察Th17和Treg細胞平衡的變化，探討該信號通路是否可以通過調控Th17和Treg平衡發揮肺保護作用。
1 材料與方法
1.1 實驗分組和動物模型制備
健康雄性Balb/c小鼠由中國上海實驗動物研究所提供，小鼠體重在18～20 g，所有實驗均經復旦大學上海醫學院動物保護與使用委員會批準后實施。將小鼠隨機分為對照組（n=8）、ALI組（n=8）和干預組（n=32）。對照組小鼠注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），ALI組小鼠腹腔注射40 mg/kg體重的LPS（Sigma，大腸桿菌O55∶B5），而干預組小鼠分別在LPS給藥前1 h腹腔注射濃度為0.5、1、2、5 mg/kg體重的SB203580（Sigma）。各組小鼠均于腹腔注射LPS 12 h后，通過心包穿刺取血并處死小鼠。
1.2 方法
1.2.1 肺組織病理學檢測
肺組織正常固定、脫水、包埋、切片獲得蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片。每個HE染色切片隨機選擇4個高倍視野，采用盲法選取兩位觀察者對肺組織病理變化程度進行評分，炎癥評分采用5分制[11]，比較肺組織和炎性細胞的變化。
1.2.2 肺泡灌洗液中總蛋白的表達及細胞計數
氣管內插管進行2次1 mL PBS清洗，獲取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。300 g離心10 min，PBS重懸細胞，采用貝克曼庫爾特（Beckman Coulter）計數。用Bradford蛋白測定試劑盒（BioRad，Hercules，CA）在595 nm讀取上清蛋白含量，使用MAXline Kinetic microplate閱讀器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA），以牛血清白蛋白為標準。
1.2.3 實時聚合酶鏈反應檢測RORγt和Foxp3 mRNA表達
將新鮮采集的肺左下葉快速冷凍，并在80 ℃保存。使用RNeasy Mini Kit試劑（Qiagen，美國）從冷凍組織中提取總RNA。采用實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測組織中視黃酸受體相關孤兒受體γt（retinoic acid receptor-related orphan receptor-γt，RORγt）和叉頭框蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）mRNA表達量，β-肌動蛋白（β-actin）為管家基因。反應體系共25 μL，其中RNA模板（2.5 μL）、正向引物（10 μmol/L 0.75 μL），反向引物（10 μmol/L 0.75 μL）；20×Eva Green （12.5 μL），ddH2O （6.25 μL）。在Eppendorf擴增儀上進行擴增，反應條件為：42 ℃反轉錄30 min，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸40 s，40個循環，退火延伸溫度時收集熒光，加溶解曲線。根據CT值計算對照組與實驗組目的基因的相對表達量。基因特異性引物序列見表1。
表1
PCR引物
1.2.4 酶聯免疫吸附試驗檢測肺組織及血清中細胞因子的表達
提取新鮮肺組織細胞總蛋白，4 ℃離心，12000 g 30 min。收集上清液，利用酶聯免疫吸附試驗試劑盒測量細胞因子IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-17、IL-10、IL-23和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β。R&D，Minneapolis，MN，美國）。每個樣本做復孔。
1.2.5 流式細胞術檢測脾臟組織中Th17和Treg細胞的表達
取脾臟組織，將組織解剖成小塊、研磨，然后通過無菌網過濾提取單細胞懸浮液。紅細胞溶解后進行流式細胞分析。利用CD4+CD25+ Foxp3+標記Treg細胞，淋巴細胞懸液中染色熒光標記的表面抗體，CD4（FITC標記。GK1.5；eBioscience，San Diego，CA，美國）和CD25（PerCP-Cy5.5標記。PC61.5；eBioscience），4 ℃避光環境中孵育30 min，再用Foxp3（PE標記）染色，在1×Fix/Perm緩沖液（eBioscience）中固定和滲透破膜30 min。CD3+CD4+IL-17A+標記Th17淋巴細胞，將細胞與CD3（PB標記）CD4（FITC標記）孵育表面染色，固定通透后，再用IL-17A （PE標記。eBio17B7；eBioscience）染色。PBS洗滌3次后，重懸細胞并接受流式細胞儀（BD Bioscience，San Jose，CA，美國）檢測。使用FlowJo 7.6版軟件（TreeStar，Ashland，OR）對數據進行分析。
1.3 統計學方法
使用GraphPad Prism 5軟件（GraphPad software，La Jolla，CA，美國）進行統計學分析。呈正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 p38 MAPK抑制劑能減輕LPS引起的肺組織損傷
HE染色光鏡下觀察評價小鼠肺組織病理變化（圖1）。結果可見ALI組小鼠較對照組肺組織內可見明炎性細胞浸潤，肺泡間質增厚，經SB203580干預組間質增厚較ALI組減輕，炎性細胞浸潤減少。在5 mg/kg SB203580干預組，小鼠的組織學基本恢復正常。ALI組小鼠肺組織炎性評分較對照組明顯升高（P<0.05），SB203580干預后肺組織炎性評分減低，且與用藥濃度呈一定相關性，用藥濃度越高，炎癥評分越低。結果見圖2。
圖1
各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a. 對照組；b. ALI組；c. 0.5 mg/kg藥物干預組；d. 1 mg/kg藥物干預組；e. 2 mg/kg藥物干預組；f. 5 mg/kg藥物干預組。ALI組小鼠較對照組肺組織內可見明炎性細胞浸潤，肺泡間質增厚，經SB203580干預組間質增厚較ALI組減輕，炎性細胞浸潤減少。在5 mg/kg SB203580干預組，小鼠的組織學基本恢復正常。
圖2
各組小鼠肺組織病理評分
與對照組比較，#
2.2 p38 MAPK抑制劑減輕肺泡灌洗液中炎性細胞浸潤及蛋白分泌
與肺組織病理變化結果一致，LPS刺激后的小鼠BALF中的細胞總數和蛋白較對照組增加（P<0.05）。SB203580干預組細胞數量和蛋白均明顯減少。與對照組比較，BALF中單核細胞和中性粒細胞在ALI組明顯升高。SB203580干預組總細胞數較ALI組有所下降，且隨著用藥濃度的增加，下降程度越明顯，其中單核細胞和中性粒細胞在ALI組均有明顯升高，藥物干預后有所下降。結果見圖3。
圖3
SB203508對LPS誘導的ALI小鼠BALF中細胞數量和蛋白的影響
a. 細胞總數；b. 蛋白；c. 中性粒細胞計數；d. 巨噬細胞計數。與對照組比較，#
2.3 p38MAPK抑制劑能減輕Th17相關細胞因子的分泌，促進IL-10的表達
ALI組肺組織中IL-17、IL-23、TGF-β和IL-10細胞因子的表達較對照組均有明顯的升高，SB203580干預后，血清中IL-6、TNF-α以及肺組織中IL-17、IL-23和TGF-β的表達受到抑制，其中TGF-β的表達的降低與SB203580呈濃度依賴性，IL-6、IL-23和IL-17在1 mg/kg的SB203580的濃度下抑制作用最明顯。IL-10的表達呈相反趨勢，SB203580干預組小鼠肺組織IL-10水平明顯高于ALI組，經SB203580干預后能明顯促進IL-10的表達，與濃度呈正相關。結果見圖4。
圖4
SB203508對LPS誘導的ALI小鼠血清及肺組織中炎性細胞因子的影響
a. 血清IL-6；b. 血清TNF-α；c. 肺組織IL-10；d. 肺組織IL-6；e. 肺組織IL-23；f. 肺組織IL-17；g. 肺組織TGF-β。與對照組比較，#
2.4 p38MAPK抑制劑可抑制Th17相關轉錄因子RORγt mRNA的表達，而促進Treg相關轉錄因子Foxp3 mRNA的表達
ALI組RORγt mRNA表達明顯高于對照組，而SB203508組RORγt mRNA表達明顯低于對照組。LPS也能誘導Foxp3 mRNA的表達，經SB203580干預后，小鼠肺組織中Foxp3 mRNA的表達水平進一步升高，明顯高于ALI組。經SB203580干預后，轉錄水平RORγt/Foxp3比值降低，肺組織內更傾向于Foxp3的表達。結果見圖5。
圖5
SB203508對LPS誘導的ALI小鼠肺組織RORγt和Foxp3 mRNA表達的影響
a. 肺組織RORγt；b. 肺組織Foxp3；c. 肺組織RORγt與Foxp3的比值。與對照組比較，#
2.5 p38MAPK抑制劑可以糾正LPS導致的Th17/Treg細胞表達失衡
與正常小鼠比較，LPS所致的ALI小鼠脾臟淋巴細胞中Treg和Th17細胞數量均有明顯增加。Th17/Treg平衡狀態中傾向于Th17細胞的增多。SB203580干預后增加了Treg細胞的數量，降低了Th17細胞的比例。5 mg/kg SB203580干預組Th17/Treg比值降低，接近于對照組小鼠。結果見圖6。
圖6
SB203508對LPS誘導的ALI小鼠脾臟Th17和Treg細胞表達的影響
a. Th17細胞亞群流式細胞檢測像；b. Treg細胞流式細胞檢測像；c. Th17細胞亞群流式細胞檢測結果；d. Treg細胞流式細胞檢測結果；e. Th17細胞亞群與Treg細胞的比值。A. 對照組；B. ALI組；C. 0.5 mg/kg藥物干預組；D. 1 mg/kg藥物干預組；E. 2 mg/kg藥物干預組；F. 5 mg/kg藥物干預組。與對照組比較，#
3 討論
肺內中性粒細胞等炎癥細胞的浸潤和炎癥介質的釋放是ALI的主要特征之一[12]。當肺部受到病原微生物攻擊時，中性粒細胞在肺微血管、間質和支氣管肺泡間隙聚集，并分泌蛋白酶，陽離子化合物和活性氧化劑等有效抗菌分子。然而，中性粒細胞的遷移及炎癥過度反應也會導致肺泡腔的機械性損傷及加重肺泡腔內的滲出，從而發生ALI/ARDS[13]。本研究通過腹腔注射LPS建立ALI動物模型，LPS誘導肺組織出現炎癥反應和BALF中炎癥細胞及總蛋白水平的增加。SB203508干預后，LPS誘導的ALI小鼠肺泡灌洗液中各類細胞數和蛋白減少，HE染色提示肺部炎癥有所減輕，提示SB203508可抑制炎癥反應和炎性細胞的聚集，減輕LPS誘導的小鼠肺損傷，這種保護作用與劑量呈正相關。
LPS刺激導致的炎癥反應是一個復雜的細胞因子網絡，TNF-α、IL-6和其他促炎化合物的釋放可引發、放大和延續炎癥級聯反應。IL-1β、IL-6和TNF-α被認為是ALI嚴重程度的預測指標[14]。研究發現車前草苷可以抑制p38MAPK信號通路的激活，減少IL-6和TNF-α等促炎性細胞因子的釋放，減輕ALI小鼠的肺組織炎癥反應[15]。IL-6細胞因子水平的下降，可以通過影響Th17和Treg細胞平衡減輕大鼠模型中宮內感染誘導早產兒的ARDS[16]。通過以上的研究結果推測p38MAPK信號通路的抑制使得IL-6等促炎性細胞因子分泌減少，IL-6可以通過影響Th17/Treg平衡影響ARDS的疾病進程。本研究發現經ALI小鼠體內存在IL-6細胞因子的過表達，干預組小鼠經SB203580干預后IL-6的表達明顯下降，在1 mg/kg的劑量時抑制效果最明顯，更多的藥物濃度并沒有帶來更明顯的IL-6水平的下降。Th17細胞的分化與IL-1、IL-6及轉化生長因子相關聯[17]。本研究還發現ALI組小鼠Th17細胞及相關細胞因子的表達明顯升高，而干預組小鼠Th17細胞表達及相關細胞因子的分泌明顯下降，這與IL-6的表達水平相一致，推測p38 MAPK信號通路被抑制后引起IL-6分泌的減少，進而減少了Th17細胞的生成。
Th17細胞在防御細胞外病原體中發揮關鍵作用，并參與許多自身免疫性炎癥的形成。Treg細胞的主要功能是調節免疫應答的平衡，控制T細胞對病原體、嚴重炎癥和組織破壞的適度應答。已有多項研究發現Th17和Treg細胞參與ALI/ARDS的病理過程。Yu等[18]研究發現ARDS患者外周血單核細胞中能檢測到Th17細胞和相關的細胞因子IL-17的升高，ALI/ARDS的發病過程中會打破Th17細胞和Treg細胞平衡，該失衡狀態進一步導致ALI/ARDS的進展。Treg細胞主要通過細胞與細胞之間的接觸和分泌抑制性細胞因子IL-10和TGF-β1調節肺組織內免疫應答，對ALI/ARDS起保護作用[19]。Treg細胞的免疫調節功能通過一系列的細胞因子實現，主要有IL-10和TGF-β1，D'Alessio等[20]研究發現ALI小鼠和患者BALF中增多的Treg細胞可通過誘導TGF-β1和中性粒細胞的凋亡來減輕ALI的病理反應。既往研究發現Treg細胞分泌的IL-10是Treg細胞產生的保護性免疫調節細胞因子，IL-10可通過抑制TNF-α的產生在ALI/ARDS病理過程中起保護作用[21]，IL-10的作用被抑制將加重ARDS的病理反應[22]。本研究也發現ALI組小鼠體內IL-10表達明顯升高，干預組小鼠IL-10的表達進一步升高。我們推測，抑制p38 MAPK信號通路可以通過調控如IL-10細胞因子的分泌，刺激Foxp3 mRNA的表達和Treg細胞的生成，從而發揮了對ALI的肺保護作用。TGF-β主要通過p38 MAPK和SMAD3信號通路參與炎癥反應作用過程[23]。本研究也證實在抑制p38MAPK信號通路后，TGF-β的表達明顯被抑制。我們的前期研究提示阻斷p38 MAPK能抑制Th17細胞分泌相關細胞因子[24]。本實驗結果也顯示ALI小鼠中Th17和Treg細胞及其分泌的細胞因子均有升高，抑制p38 MAPK信號通路能調控Th17和Treg細胞分化過程中的關鍵細胞因子而調控Th17/Treg平衡，最終減輕肺組織損傷。
綜上所述，LPS誘導ALI小鼠模型中，存在Th17/Treg細胞功能失衡現象。應用p38 MAPK抑制劑可抑制Th17相關轉錄因子RORγt mRNA的表達，進而減少IL-6、IL-23和TNF-α促炎因子的分泌，且促進Treg相關轉錄因子Foxp3 mRNA的表達，進而增加抑炎因子IL-10的分泌，最終在BALF炎癥指標和組織病理學層面觀察到ALI的減輕，且這種作用在一定范圍內劑量與療效呈正相關。因此，我們推測p38 MAPK抑制劑可能通過改變Th17/Treg失衡狀態減輕LPS所致的小鼠肺損傷程度，提示p38 MAPK可能是ALI/ARDS治療的一個潛在靶點。本研究還存在一定的局限性，首先，僅開展了小鼠動物模型實驗，需要進一步通過ALI/ARDS患者血液樣本及BALF樣本進行驗證；其次，造模使用的方法為腹腔注射LPS，僅代表革蘭陰性桿菌感染所致ALI；最后，沒有對p38 MAPK抑制劑調控Th17和Treg細胞的具體信號通路各環節進行研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
