引用本文： 周潔君, 李東, 李朵, 任若通, 孫紅云, 陳明偉, 陽甜. 宏基因組二代測序技術輔助肺部腫瘤診斷的臨床病例分析. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(12): 855-860. doi: 10.7507/1671-6205.202204021 復制
肺癌是最常見的惡性腫瘤，是全球癌癥相關死亡的主要原因[1]。計算機斷層掃描（computed tomography，CT）是腫瘤影像學的主要診斷工具，被廣泛用于腫瘤檢測、分期和隨訪[2-5]。目前的指南建議使用低劑量螺旋CT作為肺癌篩查手段[6]，但CT診斷特異性方面還存在很多問題[7]，且病情危重患者有時僅能行床旁胸部X線檢查。臨床上肺癌診斷“金標準”通常是具有侵入性的活體組織病理檢查，一般需要3～7 d，且部分患者因身體原因無法進行活檢操作。
染色體片段拷貝數變異（Copy number variations，CNV）是指一個或多個基因拷貝數發生變化，是遺傳變異的重要組成部分，對基因組的影響比單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）更大；基因組不穩定性是癌癥的重要標志，癌基因的激活通常由于染色體拷貝數增加，而抑癌基因的失活通常是因與突變相關的缺失引起的，因此CNV是癌癥中最重要的基因組變異之一，也被認為是腫瘤的重要標志物[8-10]。CNV與癌癥患者的預后存在一定的關聯，基于CNV的風險評分可以預測癌癥患者的總生存期[11]，CNV異質性增加與肺癌復發或死亡風險升高有關，體現了染色體不穩定性作為預后預測因子的潛在價值[12]。CNV的檢測技術手段包括細胞遺傳學、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、比較基因組雜交（computer-generated holograms，CGH）和染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA），以及基于二代測序技術的全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）等[13-14]。染色體核型分析是染色體畸變的“金標準”，但該方法僅適用于外周血和骨髓，檢測周期長（4～7 d），分辨率低，且無法檢出5 Mb以下的CNV。FISH分辨率相對較高，但是檢測周期需要3～5 d，并且作為一種靶向檢測，需要指定特異性的探針。CMA技術成本高、通量低，且所使用芯片探針覆蓋范圍有限，可能導致部分CNV無法被檢出。
宏基因組二代測序技術（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）分析過程中獲得的人源基因組序列可用于檢測染色體CNV，有助于診斷隱源性腫瘤[15]。基于鳥槍法宏基因組測序的CNV測序具有高靈敏度和高特異度，可為染色體畸變提供可靠和準確的診斷[16]。mNGS可以針對獲得的人源序列進行深入分析，結合機器學習形成的人工智能（artificial intelligence，AI）識別系統，對患者是否存在染色體CNV進行識別，從而實現對CNV引起的腫瘤的早期診斷。近期有1例利用mNGS輔助診斷下頜骨彌漫性大B細胞淋巴瘤的病例，該患者反復發熱1個月，抗菌和抗病毒治療均無效，臨床實驗室病原微生物檢測與mNGS送檢結果均未發現感染微生物，提示患者可能為非感染性疾病，進一步對mNGS獲得的人源序列進行分析，發現多條染色體發生明顯CNV，經AI數據處理及人工判讀后，提示可能為腫瘤，臨床即刻調整診斷方向，最終經病理活檢明確診斷[17]。mNGS對疑似感染的患者鑒別診斷具有重要意義，同時，也為疑似腫瘤患者的診斷帶來一定的幫助。本研究回顧性收集4例疑似肺部感染患者送檢的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）進行病原學診斷和腫瘤預測分析的mNGS結果，分析mNGS在檢測責任病原體的同時，是否能提供一定的腫瘤信號預警，從而輔助臨床進行肺部腫瘤診斷。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
回顧性分析2021年8月26日—12月18日期間西安交通大學第一附屬醫院的4例疑似肺部感染住院并送檢BALF樣本行mNGS檢測患者的基本臨床資料，關注其肺部影像學（胸部X線或胸部CT）、mNGS結果及病理活檢結果。
1.2 mNGS的應用方法
1.2.1 病原學診斷技術
患者均行床旁支氣管鏡檢查，進行支氣管肺泡灌洗，留取BALF樣本送至基因測序儀平臺進行mNGS檢測，將檢測結果與微生物數據庫比對，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數，根據序列數的高低以及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。
1.2.2 mNGS檢測樣本用于人源序列分析
1.2.2.1 BALF樣本前處理
BALF樣本滅活：56 ℃ 30 min于干燥箱，取1.2 mL轉入裝有破壁珠的均質管中，利用均質儀進行均質。
1.2.2.2 核酸提取和文庫構建
選用文庫構建小體積卡盒MDO13，在1號孔加入40 μL純化磁珠，2號孔加入400 μL前處理后的BALF樣本、600 μL已加異丙醇的裂解液、20 μL蛋白酶K和4 μL質控樣本ICL，6號孔加入1600 μL無水乙醇，10號孔加入5 μL連接酶，11號孔加入30 μL接頭，12號孔加入5 μL補平片段化酶、10 μL補平片段化緩沖液，待樣本和試劑加好后，將卡盒送入NGS-master進行核酸提取和文庫構建。
1.2.2.3 定量
將文庫稀釋29倍，取4 μL加入實時熒光定量核酸擴增檢測（Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR）反應體系中。反應體系：qPCR mix 4.8 μL，Primer mix 1 μL，ROX 0.2 μL，模板（S1-S5）4 μL，進行qPCR反應，qPCR反應程序為95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，25個循環。qPCR完成后將qPCR濃度輸入pooling表中，進行pooling，將pooling液進行qPCR定量（定量程序同文庫定量）。
1.2.2.4 測序
取稀釋好的pooling液加入計算好的變性液，計時5 min，并測定pH值，最后加入計算好后的HT1準備測序，測序完成后，將下機的微生物數據和公司微生物數據庫進行比對，將人源序列與公司人源大數據進行比對，最終得出報告。
2 結果
2.1 患者基本信息
患者1：男，68歲，因“咳嗽、咳痰30余年，再發加重伴氣短20 d”入院。查體：體溫（temperature，T）36 ℃，脈搏（pulse，P）83次/min，呼吸頻率（respiratory rate，R）26次/min，血壓（blood pressure，BP）118/67 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），右肺呼吸音低，雙肺可聞及干濕性啰音。
患者2：男，73歲，因“咳嗽、咳痰2年，氣短半年，加重3個月”入院。查體：T 36.5 ℃，P 76次/min，R 20次/min，BP 160/82 mm Hg。雙肺呼吸音粗，可聞及多量濕性啰音，雙下肢輕度水腫。
患者3：女，85歲，因“咳嗽、咳痰、氣短1個月，加重半個月”入院。查體：T 36.4 ℃，P 88次/min，R 25次/min，BP 100/52 mm Hg，雙肺聞及濕啰音及Velcro啰音。
患者4：男，81歲，因“咳嗽、咳痰45 d，痰中帶血15 d”入院。查體：T 36.6 ℃，P 99次/min，R 20次/min，BP 125/75 mm Hg，雙肺呼吸音清，未聞及明顯干濕性啰音，無胸膜摩擦音。
2.2 患者影像學、病理學及mNGS檢測結果
2.2.1 患者1
入院時胸部CT檢查結果如圖1所示，影像診斷：右肺中央型肺癌伴阻塞性肺炎，縱隔多發淋巴結轉移；右側少量胸腔積液。
圖1
2021年11月17日患者1胸部CT檢查像
示右肺軟組織腫塊影（白箭），呈分葉狀改變，考慮中央型肺癌伴阻塞性肺炎；縱隔多發淋巴結轉移；右側少量胸腔積液，右側胸腔引流管影。診斷為肺部腫瘤可疑并肺部感染。
該患者疑似伴有肺部感染，BALF送檢病原學培養無果，其后為了進一步明確肺部感染取BALF樣本送檢mNGS檢測。約13 h后得到mNGS結果，結果未提示患者存在肺部微生物感染。將mNGS結果與人源序列比對后，提示1號染色體短臂缺失，3號染色體短臂缺失、長臂重復。5號染色體短臂重復，8、10、11、12、13、15、17、19號染色體短臂缺失，9號染色體長臂缺失，20號染色體短臂重復，21、22號染色體長臂重復（圖2a），AI腫瘤預測模型結合人工判讀給出腫瘤陽性預警，與CT結果一致。為了明確腫瘤類型，于超聲支氣管鏡下于右中間支氣管口黏膜處取活組織送檢病理檢查，并行超聲支氣管鏡引導下縱隔淋巴結針吸活檢，結果提示小細胞肺癌（圖3）。
圖2
各患者Onco-mNGS-CNV圖
a. 患者1，示1、3、5、8、9、10、11、12、13、15、17、19、20、21、22號染色體CNV。b. 患者2，示3、4、17、18、19號染色體CNV。c. 患者3，示5、8、11、12、16號染色體CNV。d. 患者4，示1、2、4、6、8、9、12、19、20、21、22號染色體CNV。
圖3
2021年11月24日患者1右中間支氣管黏膜活檢組織病理檢查像（蘇木精–伊紅×40）
示小細胞癌伴機械性擠壓。
2.2.2 患者2
入院時胸部X線檢查如圖4所示，提示雙肺多發斑片影。
圖4
2021年9月6日患者2 胸部X線檢查像
可見雙側中下肺野多發斑片滲出影（紅箭），考慮為肺部感染。
該患者為重癥監護患者，病情較重，無法外出行CT檢查，臨床根據胸部X線與血液檢查指標初步診斷為肺部感染，BALF病原學培養無果，遂后BALF樣本送檢mNGS檢測以明確責任病原體。mNGS結果表明該患者未合并肺部感染，但提示3號染色體短臂缺失，長臂重復，4、17、19號染色體長臂重復，18號染色體短臂和長臂的缺失（圖2b），AI結合人工判讀給出腫瘤陽性預警。隨即臨床醫生根據上訴預警結果，及時調整診斷方向，進行腫瘤學相關檢查。為進一步確認腫瘤情況，送檢患者的痰標本進行了痰脫落細胞學檢查，檢查結果提示查見可疑腺癌細胞（圖5）。
圖5
2021年9月8日患者2痰細胞學病理檢查像（巴氏×40）
痰涂片查見少量可疑腺癌細胞，建議“活檢”進一步檢查。
2.2.3 患者3
入院后行胸部X線檢查，結果顯示：左肺下葉腫塊影，雙肺廣泛分布磨玻璃影、網格影、片絮狀密度增高影（圖6）。
圖6
2021年10月16日患者3胸部X線檢查像
示左肺腫塊影（紅箭），雙肺廣泛分布磨玻璃影、網格影、片絮狀密度增高影。
該患者高齡，肺部感染范圍大，且合并呼吸衰竭，盡快明確肺部感染的責任病原體進行針對性的抗感染治療尤為迫切，故行支氣管鏡取BALF樣本送檢mNGS檢測，同時送檢BALF標本檢驗科進行微生物培養。mNGS結果于13 h后提示白色假絲酵母菌感染，臨床立刻進行針對性抗感染治療，其后肺部感染情況明顯好轉。且后期檢驗科回報的責任病原體與mNGS結果一致。另外，與人源序列比對后，mNGS結果示患者5、8、11號染色體短臂重復，12、16號染色體短臂缺失（圖2c），AI腫瘤預測模型結合人工判讀給出腫瘤陽性預警。考慮到患者年齡大，同家屬充分溝通后家屬拒絕行病理活檢，同意行全身正電子發射計算機斷層顯像（positron emission computed tomography/X-ray computed tomography，PET/CT）檢查，檢查結果如圖7所示：左肺下葉背段周圍型肺癌，縱隔、兩肺門淋巴結轉移。
圖7
2021年10月21日患者3 PET/CT檢查像
全身PET/CT提示左肺下葉背段周圍型肺癌（紅箭），縱隔、兩肺門淋巴結轉移。
2.2.4 患者4
入院后行胸部CT檢查，結果顯示：上腔靜脈旁團塊狀影，縱隔多發小淋巴結影；兩側多發肋骨骨質不完整；慢性支氣管炎，肺氣腫（圖8）。
圖8
2021年11月16日患者4胸部CT檢查像
示上腔靜脈旁團塊狀影（紅箭），縱隔多發小淋巴結影，兩側多發肋骨骨質不完整，慢性支氣管炎，肺氣腫。
臨床懷疑合并肺部感染，BALF標本培養無果后取BALF樣本送檢mNGS檢測，結果檢出A型鼻病毒感染，同時mNGS提示患者1、2、4、6、9、12號染色體短臂重復，8號、19號染色體短臂缺失，20、21、22號染色體長臂重復（圖2d），AI腫瘤預測模型結合人工判讀給出腫瘤陽性預警。為進一步確認患者腫瘤情況，行超聲支氣管鏡引導下經4R組針吸縱隔淋巴結活檢，結果如圖9，可見分化差的癌細胞，傾向腺癌細胞。經抗病毒治療后患者咳嗽、咳痰、咯血較前明顯好轉。
圖9
2021年11月22日患者4淋巴結病理檢查像（蘇木精–伊紅×40）
4R淋巴結針吸液涂片查見異型細胞，傾向腺癌細胞。
3 討論
染色體不穩定性是腫瘤的重要標志，肺癌有其獨特的CNV模式[18-19]。Li等[20]使用 Illumina HumanHap 550K 基因分型芯片檢測系統地分析了CNV在肺癌病因學環境和遺傳學數據庫的1945例病例和1992例對照以及前列腺癌、肺癌、結直腸癌和卵巢癌癌癥篩查試驗數據集的803個病例和848個對照，確定了22個CNV（5q、8q、9q、10q、11q、13q、16p、17q、18p、18q、19p、20q、21q、22q）與肺癌相關。另一項研究使用SNP芯片篩選肺癌相關的CNV，發現這些CNV大部分分布在1、3、7、11、15、17和21號染色體上[21]。盡管早已發現肺癌有其相對固定的CNV模式，但是由于檢測技術的限制，并沒有較好的被應用于臨床。本研究中患者的CNV模式也基本處于上訴研究的CNV范圍中，說明mNGS對腫瘤相關CNV的靈敏度較強。后續所有患者均經病理活檢或全身PET/CT證實了存在肺部腫瘤。本研究在運用mNGS的基礎上，結合生物信息學大數據和AI的使用，使得CNV變化對肺部腫瘤的提示作用被充分顯現。
肺部感染在臨床上極為常見，但很多患者在常規行病原學檢查時卻無法檢出責任病原體，故在有條件的情況下，會選擇送檢mNGS進行感染病原的明確。此前有研究證實mNGS對于感染性疾病的診斷可以取得良好的診斷效能，如鸚鵡熱臨床表現缺乏特異性，應用BALF的mNGS可查見鸚鵡熱衣原體[22]。但是除了檢測感染外，mNGS還可以通過識別人源序列中的腫瘤特有CNV改變，來檢測腫瘤信號。此前研究證實，與傳統實驗室檢測方法相比，mNGS預測腫瘤的靈敏度和特異性均更高，可分別達到83.7%和97.6%[23]。本研究中，4例患者均存在胸部X線或CT異常，且均疑似合并肺部感染，但進行病原學培養卻未檢出責任病原體。在此基礎上，送檢了患者的BALF樣本行mNGS檢測，并使用人源序列比對進行腫瘤信號檢測，以輔助臨床明確患者胸部X線和CT異常的原因。mNGS結果顯示，患者3檢出與臨床實驗室培養結果一致的白色念珠菌，患者4檢出A型鼻病毒，且患者3和患者4后續根據此結果給予對應的抗感染治療，預后良好。更重要的是，mNGS結果還顯示，4例患者均存在腫瘤相關的CNV異常信號，提示這些患者均有存在腫瘤的可能，其中患者1臨床已通過胸部CT初步診斷其罹患肺癌，mNGS結果再次確證了這一結果，另外3例患者的mNGS腫瘤信號預警提示了腫瘤診斷，值得一提的是，患者2的mNGS結果所提供的腫瘤信號預警使臨床醫生及時調整了診斷方向，由肺部感染向肺癌轉變。最終，患者2、3和4通過病理學或PET/CT等方法進一步驗證了mNGS的腫瘤提示。由此可見，mNGS的檢測結果不僅能找到感染的責任病原體，同時能為腫瘤患者提供了較為可靠的生物信息學依據，為臨床診斷提供了一定的建設性的指導意義。
我們的研究是少有的嘗試使用mNGS進行腫瘤信號預警的研究之一，為mNGS是否能輔助臨床肺部腫瘤診斷提供一定的參考。當然，本研究有一定的局限性。首先，雖然本研究應用mNGS結合了大型生物信息學平臺信息，并依據AI提供腫瘤輔助診斷信息，但是病例少，要想驗證mNGS在腫瘤診斷領域的價值，還需進一步開展更大樣本量研究；另外，mNGS在肺部腫瘤診斷中應用時，在報告解讀、文獻分析策略等方面都需要更加精細化，才能更好為臨床診療服務。
綜上所述，本研究基于mNGS技術對病原學診斷和腫瘤預測的雙重分析，針對4例肺部疾病患者的BALF樣本進行檢查，結果均提示了腫瘤相關的CNV異常信號，后續4例患者的組織病理活檢結果均證實其存在肺部腫瘤，這與mNGS結果完全一致。另外，mNGS極為快速，其協助臨床對腫瘤進行早期診斷可能具有重要價值。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺癌是最常見的惡性腫瘤，是全球癌癥相關死亡的主要原因[1]。計算機斷層掃描（computed tomography，CT）是腫瘤影像學的主要診斷工具，被廣泛用于腫瘤檢測、分期和隨訪[2-5]。目前的指南建議使用低劑量螺旋CT作為肺癌篩查手段[6]，但CT診斷特異性方面還存在很多問題[7]，且病情危重患者有時僅能行床旁胸部X線檢查。臨床上肺癌診斷“金標準”通常是具有侵入性的活體組織病理檢查，一般需要3～7 d，且部分患者因身體原因無法進行活檢操作。
染色體片段拷貝數變異（Copy number variations，CNV）是指一個或多個基因拷貝數發生變化，是遺傳變異的重要組成部分，對基因組的影響比單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）更大；基因組不穩定性是癌癥的重要標志，癌基因的激活通常由于染色體拷貝數增加，而抑癌基因的失活通常是因與突變相關的缺失引起的，因此CNV是癌癥中最重要的基因組變異之一，也被認為是腫瘤的重要標志物[8-10]。CNV與癌癥患者的預后存在一定的關聯，基于CNV的風險評分可以預測癌癥患者的總生存期[11]，CNV異質性增加與肺癌復發或死亡風險升高有關，體現了染色體不穩定性作為預后預測因子的潛在價值[12]。CNV的檢測技術手段包括細胞遺傳學、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、比較基因組雜交（computer-generated holograms，CGH）和染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA），以及基于二代測序技術的全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）等[13-14]。染色體核型分析是染色體畸變的“金標準”，但該方法僅適用于外周血和骨髓，檢測周期長（4～7 d），分辨率低，且無法檢出5 Mb以下的CNV。FISH分辨率相對較高，但是檢測周期需要3～5 d，并且作為一種靶向檢測，需要指定特異性的探針。CMA技術成本高、通量低，且所使用芯片探針覆蓋范圍有限，可能導致部分CNV無法被檢出。
宏基因組二代測序技術（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）分析過程中獲得的人源基因組序列可用于檢測染色體CNV，有助于診斷隱源性腫瘤[15]。基于鳥槍法宏基因組測序的CNV測序具有高靈敏度和高特異度，可為染色體畸變提供可靠和準確的診斷[16]。mNGS可以針對獲得的人源序列進行深入分析，結合機器學習形成的人工智能（artificial intelligence，AI）識別系統，對患者是否存在染色體CNV進行識別，從而實現對CNV引起的腫瘤的早期診斷。近期有1例利用mNGS輔助診斷下頜骨彌漫性大B細胞淋巴瘤的病例，該患者反復發熱1個月，抗菌和抗病毒治療均無效，臨床實驗室病原微生物檢測與mNGS送檢結果均未發現感染微生物，提示患者可能為非感染性疾病，進一步對mNGS獲得的人源序列進行分析，發現多條染色體發生明顯CNV，經AI數據處理及人工判讀后，提示可能為腫瘤，臨床即刻調整診斷方向，最終經病理活檢明確診斷[17]。mNGS對疑似感染的患者鑒別診斷具有重要意義，同時，也為疑似腫瘤患者的診斷帶來一定的幫助。本研究回顧性收集4例疑似肺部感染患者送檢的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）進行病原學診斷和腫瘤預測分析的mNGS結果，分析mNGS在檢測責任病原體的同時，是否能提供一定的腫瘤信號預警，從而輔助臨床進行肺部腫瘤診斷。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
回顧性分析2021年8月26日—12月18日期間西安交通大學第一附屬醫院的4例疑似肺部感染住院并送檢BALF樣本行mNGS檢測患者的基本臨床資料，關注其肺部影像學（胸部X線或胸部CT）、mNGS結果及病理活檢結果。
1.2 mNGS的應用方法
1.2.1 病原學診斷技術
患者均行床旁支氣管鏡檢查，進行支氣管肺泡灌洗，留取BALF樣本送至基因測序儀平臺進行mNGS檢測，將檢測結果與微生物數據庫比對，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數，根據序列數的高低以及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。
1.2.2 mNGS檢測樣本用于人源序列分析
1.2.2.1 BALF樣本前處理
BALF樣本滅活：56 ℃ 30 min于干燥箱，取1.2 mL轉入裝有破壁珠的均質管中，利用均質儀進行均質。
1.2.2.2 核酸提取和文庫構建
選用文庫構建小體積卡盒MDO13，在1號孔加入40 μL純化磁珠，2號孔加入400 μL前處理后的BALF樣本、600 μL已加異丙醇的裂解液、20 μL蛋白酶K和4 μL質控樣本ICL，6號孔加入1600 μL無水乙醇，10號孔加入5 μL連接酶，11號孔加入30 μL接頭，12號孔加入5 μL補平片段化酶、10 μL補平片段化緩沖液，待樣本和試劑加好后，將卡盒送入NGS-master進行核酸提取和文庫構建。
1.2.2.3 定量
將文庫稀釋29倍，取4 μL加入實時熒光定量核酸擴增檢測（Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR）反應體系中。反應體系：qPCR mix 4.8 μL，Primer mix 1 μL，ROX 0.2 μL，模板（S1-S5）4 μL，進行qPCR反應，qPCR反應程序為95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，25個循環。qPCR完成后將qPCR濃度輸入pooling表中，進行pooling，將pooling液進行qPCR定量（定量程序同文庫定量）。
1.2.2.4 測序
取稀釋好的pooling液加入計算好的變性液，計時5 min，并測定pH值，最后加入計算好后的HT1準備測序，測序完成后，將下機的微生物數據和公司微生物數據庫進行比對，將人源序列與公司人源大數據進行比對，最終得出報告。
2 結果
2.1 患者基本信息
患者1：男，68歲，因“咳嗽、咳痰30余年，再發加重伴氣短20 d”入院。查體：體溫（temperature，T）36 ℃，脈搏（pulse，P）83次/min，呼吸頻率（respiratory rate，R）26次/min，血壓（blood pressure，BP）118/67 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），右肺呼吸音低，雙肺可聞及干濕性啰音。
患者2：男，73歲，因“咳嗽、咳痰2年，氣短半年，加重3個月”入院。查體：T 36.5 ℃，P 76次/min，R 20次/min，BP 160/82 mm Hg。雙肺呼吸音粗，可聞及多量濕性啰音，雙下肢輕度水腫。
患者3：女，85歲，因“咳嗽、咳痰、氣短1個月，加重半個月”入院。查體：T 36.4 ℃，P 88次/min，R 25次/min，BP 100/52 mm Hg，雙肺聞及濕啰音及Velcro啰音。
患者4：男，81歲，因“咳嗽、咳痰45 d，痰中帶血15 d”入院。查體：T 36.6 ℃，P 99次/min，R 20次/min，BP 125/75 mm Hg，雙肺呼吸音清，未聞及明顯干濕性啰音，無胸膜摩擦音。
2.2 患者影像學、病理學及mNGS檢測結果
2.2.1 患者1
入院時胸部CT檢查結果如圖1所示，影像診斷：右肺中央型肺癌伴阻塞性肺炎，縱隔多發淋巴結轉移；右側少量胸腔積液。
圖1
2021年11月17日患者1胸部CT檢查像
示右肺軟組織腫塊影（白箭），呈分葉狀改變，考慮中央型肺癌伴阻塞性肺炎；縱隔多發淋巴結轉移；右側少量胸腔積液，右側胸腔引流管影。診斷為肺部腫瘤可疑并肺部感染。
該患者疑似伴有肺部感染，BALF送檢病原學培養無果，其后為了進一步明確肺部感染取BALF樣本送檢mNGS檢測。約13 h后得到mNGS結果，結果未提示患者存在肺部微生物感染。將mNGS結果與人源序列比對后，提示1號染色體短臂缺失，3號染色體短臂缺失、長臂重復。5號染色體短臂重復，8、10、11、12、13、15、17、19號染色體短臂缺失，9號染色體長臂缺失，20號染色體短臂重復，21、22號染色體長臂重復（圖2a），AI腫瘤預測模型結合人工判讀給出腫瘤陽性預警，與CT結果一致。為了明確腫瘤類型，于超聲支氣管鏡下于右中間支氣管口黏膜處取活組織送檢病理檢查，并行超聲支氣管鏡引導下縱隔淋巴結針吸活檢，結果提示小細胞肺癌（圖3）。
圖2
各患者Onco-mNGS-CNV圖
a. 患者1，示1、3、5、8、9、10、11、12、13、15、17、19、20、21、22號染色體CNV。b. 患者2，示3、4、17、18、19號染色體CNV。c. 患者3，示5、8、11、12、16號染色體CNV。d. 患者4，示1、2、4、6、8、9、12、19、20、21、22號染色體CNV。
圖3
2021年11月24日患者1右中間支氣管黏膜活檢組織病理檢查像（蘇木精–伊紅×40）
示小細胞癌伴機械性擠壓。
2.2.2 患者2
入院時胸部X線檢查如圖4所示，提示雙肺多發斑片影。
圖4
2021年9月6日患者2 胸部X線檢查像
可見雙側中下肺野多發斑片滲出影（紅箭），考慮為肺部感染。
該患者為重癥監護患者，病情較重，無法外出行CT檢查，臨床根據胸部X線與血液檢查指標初步診斷為肺部感染，BALF病原學培養無果，遂后BALF樣本送檢mNGS檢測以明確責任病原體。mNGS結果表明該患者未合并肺部感染，但提示3號染色體短臂缺失，長臂重復，4、17、19號染色體長臂重復，18號染色體短臂和長臂的缺失（圖2b），AI結合人工判讀給出腫瘤陽性預警。隨即臨床醫生根據上訴預警結果，及時調整診斷方向，進行腫瘤學相關檢查。為進一步確認腫瘤情況，送檢患者的痰標本進行了痰脫落細胞學檢查，檢查結果提示查見可疑腺癌細胞（圖5）。
圖5
2021年9月8日患者2痰細胞學病理檢查像（巴氏×40）
痰涂片查見少量可疑腺癌細胞，建議“活檢”進一步檢查。
2.2.3 患者3
入院后行胸部X線檢查，結果顯示：左肺下葉腫塊影，雙肺廣泛分布磨玻璃影、網格影、片絮狀密度增高影（圖6）。
圖6
2021年10月16日患者3胸部X線檢查像
示左肺腫塊影（紅箭），雙肺廣泛分布磨玻璃影、網格影、片絮狀密度增高影。
該患者高齡，肺部感染范圍大，且合并呼吸衰竭，盡快明確肺部感染的責任病原體進行針對性的抗感染治療尤為迫切，故行支氣管鏡取BALF樣本送檢mNGS檢測，同時送檢BALF標本檢驗科進行微生物培養。mNGS結果于13 h后提示白色假絲酵母菌感染，臨床立刻進行針對性抗感染治療，其后肺部感染情況明顯好轉。且后期檢驗科回報的責任病原體與mNGS結果一致。另外，與人源序列比對后，mNGS結果示患者5、8、11號染色體短臂重復，12、16號染色體短臂缺失（圖2c），AI腫瘤預測模型結合人工判讀給出腫瘤陽性預警。考慮到患者年齡大，同家屬充分溝通后家屬拒絕行病理活檢，同意行全身正電子發射計算機斷層顯像（positron emission computed tomography/X-ray computed tomography，PET/CT）檢查，檢查結果如圖7所示：左肺下葉背段周圍型肺癌，縱隔、兩肺門淋巴結轉移。
圖7
2021年10月21日患者3 PET/CT檢查像
全身PET/CT提示左肺下葉背段周圍型肺癌（紅箭），縱隔、兩肺門淋巴結轉移。
2.2.4 患者4
入院后行胸部CT檢查，結果顯示：上腔靜脈旁團塊狀影，縱隔多發小淋巴結影；兩側多發肋骨骨質不完整；慢性支氣管炎，肺氣腫（圖8）。
圖8
2021年11月16日患者4胸部CT檢查像
示上腔靜脈旁團塊狀影（紅箭），縱隔多發小淋巴結影，兩側多發肋骨骨質不完整，慢性支氣管炎，肺氣腫。
臨床懷疑合并肺部感染，BALF標本培養無果后取BALF樣本送檢mNGS檢測，結果檢出A型鼻病毒感染，同時mNGS提示患者1、2、4、6、9、12號染色體短臂重復，8號、19號染色體短臂缺失，20、21、22號染色體長臂重復（圖2d），AI腫瘤預測模型結合人工判讀給出腫瘤陽性預警。為進一步確認患者腫瘤情況，行超聲支氣管鏡引導下經4R組針吸縱隔淋巴結活檢，結果如圖9，可見分化差的癌細胞，傾向腺癌細胞。經抗病毒治療后患者咳嗽、咳痰、咯血較前明顯好轉。
圖9
2021年11月22日患者4淋巴結病理檢查像（蘇木精–伊紅×40）
4R淋巴結針吸液涂片查見異型細胞，傾向腺癌細胞。
3 討論
染色體不穩定性是腫瘤的重要標志，肺癌有其獨特的CNV模式[18-19]。Li等[20]使用 Illumina HumanHap 550K 基因分型芯片檢測系統地分析了CNV在肺癌病因學環境和遺傳學數據庫的1945例病例和1992例對照以及前列腺癌、肺癌、結直腸癌和卵巢癌癌癥篩查試驗數據集的803個病例和848個對照，確定了22個CNV（5q、8q、9q、10q、11q、13q、16p、17q、18p、18q、19p、20q、21q、22q）與肺癌相關。另一項研究使用SNP芯片篩選肺癌相關的CNV，發現這些CNV大部分分布在1、3、7、11、15、17和21號染色體上[21]。盡管早已發現肺癌有其相對固定的CNV模式，但是由于檢測技術的限制，并沒有較好的被應用于臨床。本研究中患者的CNV模式也基本處于上訴研究的CNV范圍中，說明mNGS對腫瘤相關CNV的靈敏度較強。后續所有患者均經病理活檢或全身PET/CT證實了存在肺部腫瘤。本研究在運用mNGS的基礎上，結合生物信息學大數據和AI的使用，使得CNV變化對肺部腫瘤的提示作用被充分顯現。
肺部感染在臨床上極為常見，但很多患者在常規行病原學檢查時卻無法檢出責任病原體，故在有條件的情況下，會選擇送檢mNGS進行感染病原的明確。此前有研究證實mNGS對于感染性疾病的診斷可以取得良好的診斷效能，如鸚鵡熱臨床表現缺乏特異性，應用BALF的mNGS可查見鸚鵡熱衣原體[22]。但是除了檢測感染外，mNGS還可以通過識別人源序列中的腫瘤特有CNV改變，來檢測腫瘤信號。此前研究證實，與傳統實驗室檢測方法相比，mNGS預測腫瘤的靈敏度和特異性均更高，可分別達到83.7%和97.6%[23]。本研究中，4例患者均存在胸部X線或CT異常，且均疑似合并肺部感染，但進行病原學培養卻未檢出責任病原體。在此基礎上，送檢了患者的BALF樣本行mNGS檢測，并使用人源序列比對進行腫瘤信號檢測，以輔助臨床明確患者胸部X線和CT異常的原因。mNGS結果顯示，患者3檢出與臨床實驗室培養結果一致的白色念珠菌，患者4檢出A型鼻病毒，且患者3和患者4后續根據此結果給予對應的抗感染治療，預后良好。更重要的是，mNGS結果還顯示，4例患者均存在腫瘤相關的CNV異常信號，提示這些患者均有存在腫瘤的可能，其中患者1臨床已通過胸部CT初步診斷其罹患肺癌，mNGS結果再次確證了這一結果，另外3例患者的mNGS腫瘤信號預警提示了腫瘤診斷，值得一提的是，患者2的mNGS結果所提供的腫瘤信號預警使臨床醫生及時調整了診斷方向，由肺部感染向肺癌轉變。最終，患者2、3和4通過病理學或PET/CT等方法進一步驗證了mNGS的腫瘤提示。由此可見，mNGS的檢測結果不僅能找到感染的責任病原體，同時能為腫瘤患者提供了較為可靠的生物信息學依據，為臨床診斷提供了一定的建設性的指導意義。
我們的研究是少有的嘗試使用mNGS進行腫瘤信號預警的研究之一，為mNGS是否能輔助臨床肺部腫瘤診斷提供一定的參考。當然，本研究有一定的局限性。首先，雖然本研究應用mNGS結合了大型生物信息學平臺信息，并依據AI提供腫瘤輔助診斷信息，但是病例少，要想驗證mNGS在腫瘤診斷領域的價值，還需進一步開展更大樣本量研究；另外，mNGS在肺部腫瘤診斷中應用時，在報告解讀、文獻分析策略等方面都需要更加精細化，才能更好為臨床診療服務。
綜上所述，本研究基于mNGS技術對病原學診斷和腫瘤預測的雙重分析，針對4例肺部疾病患者的BALF樣本進行檢查，結果均提示了腫瘤相關的CNV異常信號，后續4例患者的組織病理活檢結果均證實其存在肺部腫瘤，這與mNGS結果完全一致。另外，mNGS極為快速，其協助臨床對腫瘤進行早期診斷可能具有重要價值。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
