引用本文： 石丹丹, 朱黎明. KLF2調控S1P1～S1P5對類中性粒細胞遷移的作用機制. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(2): 124-128. doi: 10.7507/1671-6205.202202009 復制
肺KLF（lung Krüppel-like factor，LKLF）/KLF2（Krüppel-like factor 2）屬于鋅指轉錄因子Krüppel-like因子（KLF）家族，參與多種生理病理過程，在細胞的生長、分化、凋亡，肺與血管的發育等過程中，都起到重要作用。本室前期研究發現，在哮喘患者中存在中性粒細胞的KLF2表達下調，延遲中性粒細胞凋亡 [1]。
1-磷酸鞘氨醇（ sphingosine-1-phosphate，S1P）是一種多效脂質介質，通過與高親和力G蛋白偶聯受體S1P1～S1P5結合，調節細胞的多種功能，如增殖、遷移、細胞骨架重排、黏附和炎癥。研究發現，S1P與S1P1～S1P5受體信號系統在淋巴細胞運輸中起著重要作用 [2]。S1P在血管和淋巴管中富集，而在細胞內或間質液中保持較低水平，形成陡峭的S1P梯度，從而促進淋巴細胞遷移至血管和淋巴管中 [3] 。Odumade等[4]發現KLF2通過直接激活S1P1的啟動子，促進T細胞從胸腺移出，歸巢到淋巴結 [5] 。中性粒細胞表面表達S1P1～S1P5 [6]，是否也存在KLF2調控S1P1～S1P5引起中性粒細胞遷移？
中性粒細胞來源于骨髓造血干細胞，釋放入血后在血管內停留時間約6～8 h，它們很快穿過血管內皮細胞進入組織，發揮各種生理作用，然后凋亡或死亡。因此中性粒細胞的壽命短，且其為終末分化的細胞，不能進行遺傳操縱，不適合用于科研。HL-60細胞是人早幼粒白血病細胞，當用含1.3%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的培養基培養HL-60細胞時，HL-60細胞體積會變小，核漿比變小，出現腎型核，此類細胞稱為類中性粒細胞，類中性粒細胞內黏附分子LFA-1（CD11a/CD18）和Mac-1（CD11b/CD18）表達增加，使其具有遷移能力[7]。因此類中性粒細胞被廣泛用于替代中性粒細胞用于科研[8-9] 。本研究通過干擾類中性粒細胞KLF2的表達，研究KLF2是否通過調控S1P1～S1P5表達，影響類中性粒細胞遷移。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
HL-60細胞（南京凱基生物科技發展有限公司）；無支原體胎牛血清（杭州四季青公司）；1640培養基（美國 Hyclone公司）；青霉素–鏈霉素雙抗（江蘇碧云天生物有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco生物公司）；迪夫快速細胞染色液（珠海貝索生物技術有限公司）；DMSO（德國Sigma公司）；人KLF2基因RNA干擾慢病毒載體、感染增強劑（Enhanced Infection Solution）、感染添加劑Polybrene（上海吉凱基因公司）；十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺、苯甲磺酰氟、細胞組織快速裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液（江蘇碧云天生物有限公司）；蛋白質標志物（Thermo Scientific Fermentas公司）；KLF2抗體（Santa Cruz公司）；S1P1抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（武漢博士德生物公司）；辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG（Jackson ImmunoRearch公司）；總RNA提取試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒（Invitrogen life technologies）；PCR預混液、DMarker Ⅰ（康為世紀生物科技有限公司）；96孔培養板、細胞培養瓶、細胞遷移實驗小室（Corning公司）、S1P（德國Sigma公司）。引物合成由上海英濰捷基公司完成。
1.2 方法
1.2.1 類中性粒細胞構建
用含1.3% DMSO的培養基培養HL-60細胞5 d，即為類中性粒細胞[10-11]。
1.2.2 慢病毒轉染與定位
① 用細胞計數板計算細胞數目；② 6 孔板上選取3孔，分為空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組，每孔加入5×104個類中性粒細胞，按復感染指數（multiplicity of infection，MOI。計算公式：MOI=病毒數/細胞數）為 60 的比例，空白組加入1 mL不含雙抗培養基、polybrene（終濃度為5 μg/mL），空載病毒組加入空載病毒、1 mL不含雙抗培養基、polybrene（終濃度為 5 μg/mL），KLF2病毒干擾組加入KLF2干擾病毒、1 mL不含雙抗培養基、polybrene（終濃度為 5 μg/mL），充分混勻后，放置CO2培養箱中培養； ③ 感染4 d后，熒光顯微鏡下觀察感染效率達到 90%以上，收集細胞。
1.2.3 細胞遷移實驗
① 取96孔板作為細胞遷移實驗下室，取18個小孔，每孔加入600 μL培養基，18個孔分為空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組三組，每組設置0 μmol/L，0.025 μmol/L，0.05 μmol/L，0.1 μmol/L，0.2 μmol/L，0.4 μmol/L 6個不同梯度濃度的S1P，按不同濃度，分別加入S1P。② 上室中每組加入200 μL培養基，空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組三組都加入5×103個類中性粒細胞，細胞遷移實驗小室放入37 ℃培養箱培養60 min。③ 收集下室的細胞，計數板計數細胞，將下室細胞除以5×103，即為各組遷移率。
1.2.4 實時PCR檢測各組KLF2、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5 mRNA表達情況
類中性粒細胞通過總RNA提取試劑進行總RNA提取，取2 μg總RNA進行反轉錄。反轉錄得到的cDNA進行實時定量PCR反應，檢測KLF2、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5 mRNA表達情況。
1.2.5 蛋白印跡法檢測各組KLF2、S1P1表達
類中性粒細胞通過細胞組織快速裂解液進行總蛋白提取。從總蛋白中取50 μg蛋白通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離并電轉移到聚偏氟乙烯膜上，1∶200稀釋的抗KLF2和S1P1抗體分別進行蛋白印跡分析，ECL化學發光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統分析各蛋白條帶灰度值，并以β-actin為內參標化各樣品蛋白電泳條帶的灰度數值。
1.3 統計學方法
所得計量資料用均數±標準差（
±s）表示，應用GraphPad Prism18.0統計軟件分析，Bartlett檢驗判斷4組計量資料兩兩之間方差齊性（P>0.1，認為滿足方差齊性）后，多組間比較采用單因素方差分析比較，滿足方差齊性時采用SNK-q檢驗，方差不齊時采用Dunnett T3檢驗。P<0.05認為有統計學意義。
2 結果
2.1 空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組KLF2 蛋白和 mRNA表達變化
慢病毒轉染成功后，通過蛋白印跡法檢測KLF2病毒干擾組、空載病毒組中KLF2的相對表達量，將KLF2病毒干擾組蛋白相對表達量/空載病毒組蛋白相對表達量×100%，為敲減率，當敲減率>70%，則基因敲減成功，可以繼續后續試驗。
2.1.1 KLF2蛋白相對表達量
蛋白印跡法檢測結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的KLF2相對表達量分別為0.212±0.326、1.152±0.111、1.206±0.316，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2蛋白相對表達量減少（P<0.05），空白組、空載病毒組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。其敲減率約為81%，空載病毒和KLF2病毒轉染成功，滿足實驗需要。結果見圖1。
圖1
各組類中性粒細胞KLF2蛋白相對表達量
與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2蛋白相對表達量顯著減少（
2.1.2 KLF2 mRNA表達量
實時PCR檢測結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的KLF2 mRNA表達量分別為0.203±0.015、1.033±0.085、0.987±0.123，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2 mRNA表達量較少（P<0.05），空白組、空載病毒組比較，表達基本相同（P>0.05）。結果見表1。
表1
各組類中性粒細胞KLF2、S1P1～S1P5 mRNA表達變化比較［n=3，（
）］
2.1.3 KLF2蛋白平均光密度
免疫熒光檢測KLF2在類中性粒細胞內的表達，結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的KLF2平均光密度值分別為0.017±0.003、0.046±0.004、0.049±0.006，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2平均光密度值減少（P<0.01），空白組、空載病毒組比較，表達基本相同。結果見圖2。
圖2
各組類中性粒細胞KLF2免疫熒光檢查像
與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2平均光密度值顯著減少（
2.2 細胞遷移實驗
KLF2病毒干擾組較空白組、空載病毒組，遷移率明顯減少（P<0.05），空載病毒組和空白組遷移率基本相同（P>0.05）。從0 μmol/L至0.1 μmol/L，隨著濃度的增加，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組遷移率明顯增加（P<0.05），從0.1 μmol/L至0.4 μmol/L ，隨著濃度的增加，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組遷移率基本相同（P>0.05）。結果見表2。
表2
不同S1P濃度下各組類中性粒細胞遷移率［n=3，（
）］
2.3 空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組S1P1～S1P5 mRNA表達變化
實時PCR檢測結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的S1P1 mRNA表達量分別為0.383±0.035、1.080±0.121、0.923±0.075，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的S1P1 mRNA表達量較少（P<0.05），空白組、空載病毒組比較，表達基本相同（P>0.05）。實時PCR檢測結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的S1P2～S1P5 mRNA在各組的表達差異均沒有統計學意義（P>0.05）。結果見表1。類中性粒細胞中KLF2不調控S1P2～S1P5表達。
2.4 空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組S1P1 蛋白表達變化
蛋白印跡法檢測結果表明，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的S1P1蛋白相對表達量分別為0.474±0.136、2.739±0.115、2.935±0.103，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的S1P1蛋白相對表達量減少（P<0.05），空白組與空載病毒組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖3。
圖3
空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組的S1P1蛋白表達變化
與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的S1P1蛋白相對表達量減少
3 討論
KLF2做為一種轉錄因子，參與細胞的遷移，在不同的細胞中，KLF2的作用不同。在成熟T細胞中，KLF2促進T細胞遷移[12]，而在腎透明細胞癌中，KLF2通過促進細胞鐵死亡，抑制癌細胞轉移[13]。我們的實驗通過干擾類中性粒細胞KLF2基因，證明KLF2促進類中性粒細胞遷移。
S1P是鞘氨醇的一種代謝產物，血液中S1P為0.1～1 μmol/L，淋巴結為0.030～0.3 μmol/L，哮喘患者誘導痰中S1P為0.1～10 μmol/L[14]。我們的實驗證明從0 μmol/L至0.1 μmol/L，隨著濃度的增加，類中性細胞的遷移增加，從0.1 μmol/L至0.4 μmol/L，隨著濃度的增加，遷移率無改變，提示已達到S1P的飽和濃度。S1P通過與其受體S1P1～S1P5結合而發揮作用，肺組織中廣泛表達S1P1～S1P5，而在中性粒細胞中僅廣泛表達S1P1、S1P4和S1P5，S1P2、S1P3表達具有個體差異性。我們的結果顯示類中性粒細胞中，S1P1～S1P5都有表達，但KLF2主要調控S1P1，促進類中性粒細胞遷移，我們的研究結果與Odumade等[4]的結果一致。
HL-60細胞表達bak、bik、bax、bad、bcl-2、bcl-w、bcl-xL、bfl-1、fas，以及caspases 1～4和7-10等因子。當DMSO誘導HL-60細胞為類中性粒細胞以后，細胞的凋亡基因bak、bax、bad、fas上調，而抗凋亡基因bik表達下調，達到中性粒細胞的水平[15]。類中性粒細胞也具有黏附遷移能力，能在趨化因子N-甲酰–蛋氨酸–亮氨酸–苯丙氨酸 （N-Formyl-Met-Leu-Phe，fMLP ）和白細胞介素-8的作用下，像中性粒細胞一樣形成收縮的尾巴和皺褶的前端的極化外形，也伴隨有肌動蛋白絲的重組，然后細胞遷移，在fMLP作用下，類中性粒細胞的遷移能力與中性粒細胞相同[16]。因此類中性粒細胞被廣泛用于替代中性粒細胞用于科研[8-9] 。支氣管哮喘作為呼吸系統的常見病多發病，近年來發病率呈上升趨勢，以致越來越引起人們重視。研究發現哮喘患者氣道中性粒細胞較健康人增多，并且和哮喘嚴重程度成正相關[17]。因此，我們的實驗為下一步支氣管哮喘患者中性粒細胞向肺部遷移黏附實驗提供了相關理論依據，促進了中性粒細胞哮喘的機制發展。此外，由于本研究中KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組之間比較，S1P2～S1P5 mRNA表達量基本相同，提示KLF2不調控S1P2～S1P5表達，因此只檢測了S1P1蛋白的表達情況，沒有檢測S1P2～S1P5蛋白的表達，此為本研究的不足。因此，是否存在其他多個層面機制去共同調控中性粒細胞的黏附遷移，還需進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺KLF（lung Krüppel-like factor，LKLF）/KLF2（Krüppel-like factor 2）屬于鋅指轉錄因子Krüppel-like因子（KLF）家族，參與多種生理病理過程，在細胞的生長、分化、凋亡，肺與血管的發育等過程中，都起到重要作用。本室前期研究發現，在哮喘患者中存在中性粒細胞的KLF2表達下調，延遲中性粒細胞凋亡 [1]。
1-磷酸鞘氨醇（ sphingosine-1-phosphate，S1P）是一種多效脂質介質，通過與高親和力G蛋白偶聯受體S1P1～S1P5結合，調節細胞的多種功能，如增殖、遷移、細胞骨架重排、黏附和炎癥。研究發現，S1P與S1P1～S1P5受體信號系統在淋巴細胞運輸中起著重要作用 [2]。S1P在血管和淋巴管中富集，而在細胞內或間質液中保持較低水平，形成陡峭的S1P梯度，從而促進淋巴細胞遷移至血管和淋巴管中 [3] 。Odumade等[4]發現KLF2通過直接激活S1P1的啟動子，促進T細胞從胸腺移出，歸巢到淋巴結 [5] 。中性粒細胞表面表達S1P1～S1P5 [6]，是否也存在KLF2調控S1P1～S1P5引起中性粒細胞遷移？
中性粒細胞來源于骨髓造血干細胞，釋放入血后在血管內停留時間約6～8 h，它們很快穿過血管內皮細胞進入組織，發揮各種生理作用，然后凋亡或死亡。因此中性粒細胞的壽命短，且其為終末分化的細胞，不能進行遺傳操縱，不適合用于科研。HL-60細胞是人早幼粒白血病細胞，當用含1.3%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的培養基培養HL-60細胞時，HL-60細胞體積會變小，核漿比變小，出現腎型核，此類細胞稱為類中性粒細胞，類中性粒細胞內黏附分子LFA-1（CD11a/CD18）和Mac-1（CD11b/CD18）表達增加，使其具有遷移能力[7]。因此類中性粒細胞被廣泛用于替代中性粒細胞用于科研[8-9] 。本研究通過干擾類中性粒細胞KLF2的表達，研究KLF2是否通過調控S1P1～S1P5表達，影響類中性粒細胞遷移。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
HL-60細胞（南京凱基生物科技發展有限公司）；無支原體胎牛血清（杭州四季青公司）；1640培養基（美國 Hyclone公司）；青霉素–鏈霉素雙抗（江蘇碧云天生物有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco生物公司）；迪夫快速細胞染色液（珠海貝索生物技術有限公司）；DMSO（德國Sigma公司）；人KLF2基因RNA干擾慢病毒載體、感染增強劑（Enhanced Infection Solution）、感染添加劑Polybrene（上海吉凱基因公司）；十二烷基硫酸鈉、四甲基乙二胺、苯甲磺酰氟、細胞組織快速裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液（江蘇碧云天生物有限公司）；蛋白質標志物（Thermo Scientific Fermentas公司）；KLF2抗體（Santa Cruz公司）；S1P1抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（武漢博士德生物公司）；辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG（Jackson ImmunoRearch公司）；總RNA提取試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒（Invitrogen life technologies）；PCR預混液、DMarker Ⅰ（康為世紀生物科技有限公司）；96孔培養板、細胞培養瓶、細胞遷移實驗小室（Corning公司）、S1P（德國Sigma公司）。引物合成由上海英濰捷基公司完成。
1.2 方法
1.2.1 類中性粒細胞構建
用含1.3% DMSO的培養基培養HL-60細胞5 d，即為類中性粒細胞[10-11]。
1.2.2 慢病毒轉染與定位
① 用細胞計數板計算細胞數目；② 6 孔板上選取3孔，分為空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組，每孔加入5×104個類中性粒細胞，按復感染指數（multiplicity of infection，MOI。計算公式：MOI=病毒數/細胞數）為 60 的比例，空白組加入1 mL不含雙抗培養基、polybrene（終濃度為5 μg/mL），空載病毒組加入空載病毒、1 mL不含雙抗培養基、polybrene（終濃度為 5 μg/mL），KLF2病毒干擾組加入KLF2干擾病毒、1 mL不含雙抗培養基、polybrene（終濃度為 5 μg/mL），充分混勻后，放置CO2培養箱中培養； ③ 感染4 d后，熒光顯微鏡下觀察感染效率達到 90%以上，收集細胞。
1.2.3 細胞遷移實驗
① 取96孔板作為細胞遷移實驗下室，取18個小孔，每孔加入600 μL培養基，18個孔分為空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組三組，每組設置0 μmol/L，0.025 μmol/L，0.05 μmol/L，0.1 μmol/L，0.2 μmol/L，0.4 μmol/L 6個不同梯度濃度的S1P，按不同濃度，分別加入S1P。② 上室中每組加入200 μL培養基，空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組三組都加入5×103個類中性粒細胞，細胞遷移實驗小室放入37 ℃培養箱培養60 min。③ 收集下室的細胞，計數板計數細胞，將下室細胞除以5×103，即為各組遷移率。
1.2.4 實時PCR檢測各組KLF2、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5 mRNA表達情況
類中性粒細胞通過總RNA提取試劑進行總RNA提取，取2 μg總RNA進行反轉錄。反轉錄得到的cDNA進行實時定量PCR反應，檢測KLF2、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5 mRNA表達情況。
1.2.5 蛋白印跡法檢測各組KLF2、S1P1表達
類中性粒細胞通過細胞組織快速裂解液進行總蛋白提取。從總蛋白中取50 μg蛋白通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離并電轉移到聚偏氟乙烯膜上，1∶200稀釋的抗KLF2和S1P1抗體分別進行蛋白印跡分析，ECL化學發光試劑盒顯像，凝膠圖像分析系統分析各蛋白條帶灰度值，并以β-actin為內參標化各樣品蛋白電泳條帶的灰度數值。
1.3 統計學方法
所得計量資料用均數±標準差（±s）表示，應用GraphPad Prism18.0統計軟件分析，Bartlett檢驗判斷4組計量資料兩兩之間方差齊性（P>0.1，認為滿足方差齊性）后，多組間比較采用單因素方差分析比較，滿足方差齊性時采用SNK-q檢驗，方差不齊時采用Dunnett T3檢驗。P<0.05認為有統計學意義。
2 結果
2.1 空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組KLF2 蛋白和 mRNA表達變化
慢病毒轉染成功后，通過蛋白印跡法檢測KLF2病毒干擾組、空載病毒組中KLF2的相對表達量，將KLF2病毒干擾組蛋白相對表達量/空載病毒組蛋白相對表達量×100%，為敲減率，當敲減率>70%，則基因敲減成功，可以繼續后續試驗。
2.1.1 KLF2蛋白相對表達量
蛋白印跡法檢測結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的KLF2相對表達量分別為0.212±0.326、1.152±0.111、1.206±0.316，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2蛋白相對表達量減少（P<0.05），空白組、空載病毒組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。其敲減率約為81%，空載病毒和KLF2病毒轉染成功，滿足實驗需要。結果見圖1。
圖1
各組類中性粒細胞KLF2蛋白相對表達量
與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2蛋白相對表達量顯著減少（
2.1.2 KLF2 mRNA表達量
實時PCR檢測結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的KLF2 mRNA表達量分別為0.203±0.015、1.033±0.085、0.987±0.123，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2 mRNA表達量較少（P<0.05），空白組、空載病毒組比較，表達基本相同（P>0.05）。結果見表1。
表1
各組類中性粒細胞KLF2、S1P1～S1P5 mRNA表達變化比較［n=3，（）］
2.1.3 KLF2蛋白平均光密度
免疫熒光檢測KLF2在類中性粒細胞內的表達，結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的KLF2平均光密度值分別為0.017±0.003、0.046±0.004、0.049±0.006，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2平均光密度值減少（P<0.01），空白組、空載病毒組比較，表達基本相同。結果見圖2。
圖2
各組類中性粒細胞KLF2免疫熒光檢查像
與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的KLF2平均光密度值顯著減少（
2.2 細胞遷移實驗
KLF2病毒干擾組較空白組、空載病毒組，遷移率明顯減少（P<0.05），空載病毒組和空白組遷移率基本相同（P>0.05）。從0 μmol/L至0.1 μmol/L，隨著濃度的增加，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組遷移率明顯增加（P<0.05），從0.1 μmol/L至0.4 μmol/L ，隨著濃度的增加，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組遷移率基本相同（P>0.05）。結果見表2。
表2
不同S1P濃度下各組類中性粒細胞遷移率［n=3，（）］
2.3 空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組S1P1～S1P5 mRNA表達變化
實時PCR檢測結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的S1P1 mRNA表達量分別為0.383±0.035、1.080±0.121、0.923±0.075，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的S1P1 mRNA表達量較少（P<0.05），空白組、空載病毒組比較，表達基本相同（P>0.05）。實時PCR檢測結果顯示，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的S1P2～S1P5 mRNA在各組的表達差異均沒有統計學意義（P>0.05）。結果見表1。類中性粒細胞中KLF2不調控S1P2～S1P5表達。
2.4 空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組S1P1 蛋白表達變化
蛋白印跡法檢測結果表明，KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組的S1P1蛋白相對表達量分別為0.474±0.136、2.739±0.115、2.935±0.103，與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的S1P1蛋白相對表達量減少（P<0.05），空白組與空載病毒組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖3。
圖3
空白組、空載病毒組、KLF2病毒干擾組的S1P1蛋白表達變化
與空白組、空載病毒組比較，KLF2病毒干擾組的S1P1蛋白相對表達量減少
3 討論
KLF2做為一種轉錄因子，參與細胞的遷移，在不同的細胞中，KLF2的作用不同。在成熟T細胞中，KLF2促進T細胞遷移[12]，而在腎透明細胞癌中，KLF2通過促進細胞鐵死亡，抑制癌細胞轉移[13]。我們的實驗通過干擾類中性粒細胞KLF2基因，證明KLF2促進類中性粒細胞遷移。
S1P是鞘氨醇的一種代謝產物，血液中S1P為0.1～1 μmol/L，淋巴結為0.030～0.3 μmol/L，哮喘患者誘導痰中S1P為0.1～10 μmol/L[14]。我們的實驗證明從0 μmol/L至0.1 μmol/L，隨著濃度的增加，類中性細胞的遷移增加，從0.1 μmol/L至0.4 μmol/L，隨著濃度的增加，遷移率無改變，提示已達到S1P的飽和濃度。S1P通過與其受體S1P1～S1P5結合而發揮作用，肺組織中廣泛表達S1P1～S1P5，而在中性粒細胞中僅廣泛表達S1P1、S1P4和S1P5，S1P2、S1P3表達具有個體差異性。我們的結果顯示類中性粒細胞中，S1P1～S1P5都有表達，但KLF2主要調控S1P1，促進類中性粒細胞遷移，我們的研究結果與Odumade等[4]的結果一致。
HL-60細胞表達bak、bik、bax、bad、bcl-2、bcl-w、bcl-xL、bfl-1、fas，以及caspases 1～4和7-10等因子。當DMSO誘導HL-60細胞為類中性粒細胞以后，細胞的凋亡基因bak、bax、bad、fas上調，而抗凋亡基因bik表達下調，達到中性粒細胞的水平[15]。類中性粒細胞也具有黏附遷移能力，能在趨化因子N-甲酰–蛋氨酸–亮氨酸–苯丙氨酸 （N-Formyl-Met-Leu-Phe，fMLP ）和白細胞介素-8的作用下，像中性粒細胞一樣形成收縮的尾巴和皺褶的前端的極化外形，也伴隨有肌動蛋白絲的重組，然后細胞遷移，在fMLP作用下，類中性粒細胞的遷移能力與中性粒細胞相同[16]。因此類中性粒細胞被廣泛用于替代中性粒細胞用于科研[8-9] 。支氣管哮喘作為呼吸系統的常見病多發病，近年來發病率呈上升趨勢，以致越來越引起人們重視。研究發現哮喘患者氣道中性粒細胞較健康人增多，并且和哮喘嚴重程度成正相關[17]。因此，我們的實驗為下一步支氣管哮喘患者中性粒細胞向肺部遷移黏附實驗提供了相關理論依據，促進了中性粒細胞哮喘的機制發展。此外，由于本研究中KLF2病毒干擾組、空白組、空載病毒組之間比較，S1P2～S1P5 mRNA表達量基本相同，提示KLF2不調控S1P2～S1P5表達，因此只檢測了S1P1蛋白的表達情況，沒有檢測S1P2～S1P5蛋白的表達，此為本研究的不足。因此，是否存在其他多個層面機制去共同調控中性粒細胞的黏附遷移，還需進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
