引用本文： 吳吉榮, 何真, 曾曉麗, 包海榮, 劉曉菊. 細顆粒物對哮喘小鼠氣道重塑及 Notch 信號通路的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(4): 274-281. doi: 10.7507/1671-6205.202202004 復制
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種常見的慢性異質性氣道疾病。氣道炎癥是哮喘發生發展的關鍵因素，長期反復炎癥刺激可引起氣道重塑，是哮喘重要的病理特征[1]。研究發現細顆粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）濃度升高和哮喘患者門診就診及住院率增加密切相關[2-3]。PM2.5 可影響哮喘氣道炎癥和氣道重塑[4-5]，但確切機制不清。Notch 信號通路是一條高度保守的信號轉導途徑，在調節細胞炎癥、免疫失衡及上皮下纖維化等方面發揮重要作用[6]。Notch 信號調節的缺失，特別是 Notch1 的缺失，最近被認為與一些重要的肺部疾病的發病有關，特別是慢阻肺、哮喘、肺纖維化等[7]。研究發現轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和 Ⅰ 型膠原蛋白（type Ⅰ collagen，Col-Ⅰ）是早期氣道重塑的重要標志[8-9]。PM2.5 對哮喘氣道重塑的影響，其機制是否與Notch 信號通路有關尚不清楚。本研究以哮喘小鼠為研究對象，觀察 PM2.5 對哮喘小鼠氣道重塑及 TGF-β1、α-SMA和 Col-Ⅰ 表達的影響，并進一步探討 PM2.5 對哮喘小鼠肺組織 Notch1 受體及其下游 Hes1 表達的影響，旨在初步明確 PM2.5 影響哮喘氣道重塑的分子機制，為預防和治療哮喘氣道重塑奠定理論基礎。
1 材料和方法
1.1 實驗動物和主要材料
40 只 8 周齡無特定病原級雌性 BALB/c 小鼠，體重（20±2）g，購自蘭州大學醫學院實驗動物中心［批號：SCXK（甘）2018-0002］。主要材料：雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA，美國 Sigma 公司）、10% 氫氧化鋁佐劑（天津市恒興化學試劑制造有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒和羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）試劑盒（北京索萊寶生物公司），兔抗鼠 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 多克隆抗體（美國 Immunoway 公司）。2050 型空氣智能總懸浮顆粒物綜合采樣器（青島嶗山應用技術研究所），霧化器（PARI BOY N型，德國百瑞公司），圖像采集系統（日本尼康株式會社），Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件（美國 Media Cybernetics 公司），EMMS 動物肺功能測量系統（英國 EMMS 公司），BIO-RAD ChemiDocTM XRS 凝膠成像系統（美國 Bio-Rad 公司）。
1.2 方法
1.2.1 分組
40 只小鼠采用隨機數字表法分為健康對照組、健康 PM2.5 組、哮喘組、哮喘 PM2.5 組，共 4 組，每組各 10 只。
1.2.2 PM2.5 的采集與制備
沿用 Chu 等[10]的 PM2.5 采集和制備方法，采集蘭州市天水南路交通主干線旁 PM2.5。采樣完畢后，將含有 PM2.5 的玻璃纖維濾膜剪成 1 cm ×1 cm 的小方塊浸于雙蒸水中，超聲波震蕩器（28 ℃、40 Hz、500 W）洗脫，再洗脫 1 次。將兩次所得洗脫液混合，用 6 層紗布過濾，所得濾液即為 PM2.5 的混懸液。低溫（–4 ℃）離心 12000 r/min，20 min，將下層 PM2.5 懸液冷凍干燥 48 h，即為 PM2.5，PM2.5 置于 4 ℃ 冰箱保存，實驗時配置成所需濃度的混懸液，現配現用。
1.2.3 哮喘模型建立及 PM2.5 干預
參照雷澤林等[11]、Temelkovski 等[12]建模方法，采用 OVA 致敏和激發建立哮喘小鼠模型。哮喘組及哮喘 PM2.5 組分別于第 1、7、14 天腹腔注射致敏液（45 mL 磷酸鹽緩沖液+ 5 mL 10% 氫氧化鋁+5 mg OVA）200 μL致敏，第 21～28 天于自制霧化箱（20 cm×15 cm×10 cm）內以 2.5% OVA 霧化激發 30 min，每日 1 次。第 29～70 天，隔日 1 次上述霧化激發，每次霧化激發見小鼠出現呼吸急促、煩躁不安、腹肌痙攣等表現時判斷為陽性反應；健康對照組及健康 PM2.5 組在致敏和霧化激發階段給予等劑量生理鹽水。參照 Chu 等[10]、Gu 等[13]的方法并加以改良，健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組將小鼠置于 20 cm×15 cm×10 cm 的玻璃熏箱內，于每次激發后給予霧化吸入 PM2.5（510 μg/m3）氣溶膠，暴露 4次/d，15 min/次，間隔 0.5 h；健康對照組及哮喘組給予同等體積的生理鹽水霧化吸入。
1.2.4 肺功能測定
末次激發及 PM2.5 干預 24 h 后，參照藍凰齊等[14]方法，給予小鼠 1% 戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離組織，暴露氣管，插入插管連接 EMMS 動物肺功能測量系統測定第 0.1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.1 second，FEV0. 1）、第 0.2 秒用力呼氣末容積（FEV0. 2）、呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）、呼出 50% 潮氣量時的流速（EF50）和增強呼吸間歇（enhanced pause，Penh）。
1.2.5 標本收集及保存
肺功能檢測結束后，脫頸椎處死各組小鼠，置于冰臺上，結扎右總支氣管，于氣管遠端切下右肺，用 4% 的多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片；取左肺組織，迅速置于液氮中，然后保存于–80 ℃ 冰箱中行蛋白免疫印跡法檢測。
1.2.6 肺組織病理學切片蘇木精–伊紅染色
取包埋石蠟塊，常規石蠟及梯度乙醇脫水，蘇木素染液染 5 min 后自來水沖洗，鹽酸酒精分化 5 min 后再次用自來水沖洗，靜置返藍 10 min，再次梯度乙醇脫水，二甲苯透明 5 min，自然干燥后中性樹膠封片。每只小鼠選取 3 張肺組織蘇木精–伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色切片，每張切片以單盲法選取橫斷面較圓、直徑 100 μm 的細支氣管，至少觀察 3 支。應用 Image-Pro Plus6.0 圖像分析軟件測定氣道管壁總面積（wall area of bronchial tube，WAt）、平滑肌面積（wall area of bronchial smooth muscle，WAm）、支氣管基底膜周徑（perimeter of basement membrane，Pbm），用 Pbm 標準化，以 WAt/Pbm、WAm/Pbm 表示，分別代表支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度[15]。
1.2.7 肺組織病理學切片馬松三色染色
石蠟切片脫蠟至水，馬松（Masson）復合染液染 5 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，5% 磷鉬酸溶液洗 1～2 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，苯胺藍染色液染色 1～2 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，梯度酒精快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每只小鼠選取 3 張肺組織 Masson 染色切片，每張切片以單盲法選取橫斷面較圓、直徑 100 μm 的細支氣管，至少觀察 3 支。應用 Image-Pro Plus6.0 圖像分析軟件測定氣道基底膜膠原面積（wall area of collagen，WAc），同樣用 Pbm 標準化，以 WAc/Pbm 表示，代表膠原沉積面積[15]。
1.2.8 免疫組織化學法觀察肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表達
石蠟切片進行免疫組織化學分析。即經脫蠟固定后，加入抗 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 抗體和二抗孵育之后染色封片，顯微鏡觀察。
1.2.9 蛋白印跡法檢測肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表達
提取總蛋白后，BCA 蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白含量，取 50 μg 蛋白樣品，10% 十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至聚偏氟乙烯膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h，兔抗鼠 Notchl 多克隆抗體（1∶750）、兔抗鼠 Hesl 多克隆抗體（1∶200）、兔抗鼠 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 多克隆抗體（1∶1000）及內參照物 β-肌動蛋白（1∶200）4 ℃ 過夜，兔抗羊 IgG（1∶2000）、羊抗兔 IgG（1∶2000）室溫 2 h，顯影，檢測蛋白條帶。蛋白相對表達為目的基因灰度值/內參基因灰度值。
1.2.10 肺組織 HYP 含量測定
采用堿水法檢測肺組織 HYP 含量。操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件。呈正態分布的計量資料數據以均數±標準差（
±s）表示，各組計量資料數據先進行正態檢驗和方差齊性檢驗，凡符合正態分布和方差齊性的數據，采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用 LSD-t 檢驗，Pearson 法進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 哮喘模型的建立
（1）小鼠行為學的改變：哮喘組小鼠每次霧化激發后小鼠出現抓耳撓腮、煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣、大小便失禁等反應；而健康對照組小鼠霧化后行為正常，呼吸平穩。（2）肺功能改變：哮喘組 FEV0.1、FEV0.2、PEF、EF50 值均顯著低于健康對照組，Penh 顯著高于健康對照組；PM2.5 干預后健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組小鼠 FEV0.1、FEV0.2、PEF 和 EF50 均顯著降低，Penh 顯著升高（均 P<0.01，表1）。（3）肺組織病理形態學改變：哮喘組小鼠管腔狹窄，氣道黏膜褶皺增多、延長，氣管及肺血管周圍存在大量聚集成團的炎癥細胞，平滑肌增厚，管壁周圍膠原沉積明顯增加；健康對照組無此類改變。PM2.5 干預后，與各自的對照組比較，健康 PM2.5 組氣管及血管周圍可見炎癥細胞浸潤；哮喘 PM2.5 組氣道管腔明顯狹窄，氣管血管周圍藍色膠原沉積進一步加重，上皮下纖維化進一步加重，以上改變表明哮喘造模成功，且伴隨氣道炎癥，出現氣道重塑；PM2.5 加重哮喘肺功能及組織病理學改變。結果見圖1 和圖2。
表1
各組小鼠肺功能有關指標的比較（n=10，
）
圖1
小鼠肺組織病理像（HE×200）
a. 健康對照組：氣道上皮細胞排列整齊，氣管及肺血管周圍無或少量炎癥細胞浸潤；b. 健康 PM2.5 組：氣管及血管周圍可見炎癥細胞浸潤；c. 哮喘組：氣道黏膜褶皺增多、延長，氣管及血管周圍大量炎癥細胞聚集成團，平滑肌增厚；d. 哮喘 PM2.5 組：氣道管腔明顯狹窄，管腔內大量粘液滲出，周圍大量炎性細胞浸潤。
圖2
小鼠肺組織病理像（Masson×200）
a. 健康對照組：氣管血管周圍僅見少量藍色膠原沉積；b. 健康 PM2.5 組：氣管血管周圍藍色膠原沉積增加；c. 哮喘組：氣管血管周圍大量藍色膠原沉積，上皮下纖維化明顯；d. 哮喘 PM2.5 組：氣管血管周圍藍色膠原沉積進一步加重，上皮下纖維化進一步加重。
2.2 小鼠氣道重塑指標比較
哮喘組氣道管壁總面積、氣道平滑肌面積及膠原沉積面積均顯著高于健康對照組（均 P<0.01）；健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組均分別高于各自對照組，結果顯示 PM2.5 對氣道重塑有明顯的促進作用（P<0.05 或 P<0.01）。結果見表2、圖1 和圖2。
表2
各組小鼠氣道重塑指標比較［n=10，μm2/μm，（
）］
2.3 小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的免疫組織化學結果
哮喘組小鼠肺組織中 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表達呈強陽性，健康對照組表達較弱；PM2.5 干預后，與各自對照組比較，上述分子的表達強度進一步增加。結果見圖3。
圖3
小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 免疫組織化學染色結果（×200）
哮喘組小鼠肺組織中 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表達呈強陽性，健康對照組表達較弱；PM2.5 干預后，上述分子的表達強度進一步增加。
2.4 小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白測定結果
哮喘組 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ蛋白較健康對照組明顯增加，健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組均分別高于各自對照組。結果見表3和圖4。
表3
各組小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表達水平比較（n=10，
）
圖4
小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表達
A：健康對照組；B：健康 PM2.5 組；C：哮喘組；D：哮喘 PM2.5 組
2.5 小鼠肺組織 HYP 含量
健康對照組、健康 PM2.5 組、哮喘組、哮喘 PM2.5 組小鼠肺組織 HYP 含量分別為（40.53±5.73）、（53.92±6.82）、（57.71±7.60）、（70.96±4.44）μg/100 mg，組內比較，差異有統計學意義（F=39.948，P<0.01）。其中，哮喘組肺組織中 HYP 含量較健康對照組明顯升高；健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組均分別高于各自對照組（均 P<0.01）。
2.6 相關性分析
哮喘組及哮喘 PM2.5 組，Notch1、Hes1 蛋白和氣道管壁總面積、氣道平滑肌面積、膠原沉積面積及α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表達及 HYP 含量均呈正相關（P<0.01 或 P<0.05），結果見表4。
表4
各組小鼠 Notch1、Hes1 蛋白與氣道重塑的相關性
3 討論
哮喘是由包括氣道炎癥細胞和結構細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、樹突狀細胞、T 淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等）多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[16]。哮喘炎癥細胞可以通過釋放促炎細胞因子和生長因子等促進氣道平滑肌細胞的遷移和增殖，氣道慢性炎癥得不到有效控制會導致氣道的損傷，損傷后氣道不完全或不恰當修復可導致氣道壁結構的改變，即氣道重塑[11, 17]。近年來研究表明哮喘的氣道重塑可以和氣道炎癥同時存在，也可以不依賴于氣道炎癥而存在[18]。哮喘反復發作，對氣道壁結構改變的影響逐漸明顯，進而出現不完全可逆或不可逆的氣流受限和肺功能下降，嚴重影響患者的生活質量。目前尚無有效的治療方法可以逆轉氣道重塑。因此重視哮喘的早期氣道重塑就顯得尤為重要。
哮喘氣道重塑的主要特征有平滑肌細胞增生和肥大、氣道壁增厚、支氣管管腔狹窄、氣道纖維化等病理改變[19-20]。Zhu 等[21]研究顯示，哮喘小鼠氣管及細支氣管周圍存在大量炎癥細胞浸潤并伴隨黏膜下水腫，嗜酸性粒細胞計數明顯增高；存在氣道平滑肌、基底膜增厚，杯狀細胞增生，黏液高分泌及上皮損傷；同時，哮喘小鼠氣道上皮厚度明顯增加。TGF-β1 屬于 TGF-β 超家族，主要參與調控哮喘氣道重塑，直接影響氣道壁膠原沉積，促進纖維化的形成等[22]。Shen 等[23]研究發現，哮喘小鼠肺組織 TGF-β1 的表達明顯升高。α-SMA 可反映平滑肌細胞的數量及其收縮能力，是平滑肌的主要標志物，α-SMA 和 Col-Ⅰ 被認為是早期氣道重塑的重要指標[24]。常琴等[25]研究發現哮喘大鼠肺組織 α-SMA 的表達明顯升高，Huang 等[26]研究也表明哮喘小鼠肺組織 α-SMA、Col-Ⅰ 的表達量增高。HYP 是膠原蛋白的一種特有氨基酸，其含量可代表膠原的合成量[27]。本研究組織病理學觀察到哮喘對照組小鼠氣道及血管平滑肌增生肥大、氣管管壁和基底膜增厚等氣道重塑的表現，膠原沉積增加，哮喘小鼠肺組織 HYP 含量亦明顯增加；同時哮喘組小鼠肺組織中 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表達呈強陽性；哮喘組 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白亦明顯增加。這些有表明哮喘小鼠存在明顯的氣道重塑現象。
大氣中的 PM2.5 組分復雜，是構成大氣污染物的主要組份，包括有機成分（多環芳烴，長鏈烴）、無機成分（NH4+、SO42－、NO3－等）、重金屬元素、病原微生物等[28]。研究表明 PM2.5 可以隨細菌、病毒、花粉等物質在下呼吸道和肺泡沉積，引起或加重已有的肺部炎癥[29]。也有研究發現在氣道內顆粒物趨向于從大向小的氣道位置沉積；顆粒物越小，其沉積在離氣道口越遠的區域，PM2.5 主要沉積在遠端小氣道[30]。本研究發現 PM2.5 干預后健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組小鼠小氣道功能指標 EF50 顯著降低，Penh 顯著升高。Liu 等[31]研究發現 PM2.5 可顯著增加哮喘小鼠肺組織炎癥細胞浸潤及支氣管、血管周圍炎癥細胞評分，炎癥細胞浸潤以嗜酸性粒細胞為主；同時 PM2.5 亦可顯著增加哮喘小鼠的支氣管壁厚度。Xu 等[4]研究發現 PM2.5 可使哮喘大鼠支氣管上皮和肺泡壁充血水腫更明顯，且顯著增加哮喘大鼠支氣管壁厚度和平滑肌厚度。本研究結果顯示 PM2.5 可增加哮喘小鼠氣道壁總面積，氣道平滑肌及氣道、血管旁膠原沉積面積，同時，α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白及 HYP 含量也顯著增加。這表明 PM2.5 可加劇哮喘及健康小鼠氣道重塑。
完整的 Notch 信號通路由 Notch 受體、Notch 配體和細胞效應器分子組成。研究發現哺乳動物體內有 4 種同源 Notch 受體（Notch1/2/3/4）和 5 種同源配體（Jagged1/2、Delta1/3/4），通過細胞間的相互接觸，活化下游靶基因 Hes 和 Hey 家族，共同調節細胞炎癥、免疫失衡及上皮下纖維化等[6]。近年研究發現 Notch 信號通路抑制劑 GSI 可減輕哮喘小鼠氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤，氣道杯狀細胞化生及粘液高分泌，同時也可以減輕氣道平滑肌增生[32]。Hu 等[33]研究發現，使用 Notch 信號通路抑制劑 KyoT2 可通過 Hes1 依賴的機制減輕哮喘小鼠氣道上皮纖維化這一氣道重塑現象。Liu 等[34]發現 PM2.5 可以劑量依賴的方式激活 Notch 信號通路，上調 Hes1 的表達參與人支氣管上皮細胞 Muc5ac 的表達。Xia 等[35]發現環境超細顆粒物可通過激活哮喘小鼠 Notch4 的表達，促進 T 細胞亞群的失衡，進而加劇哮喘小鼠氣道炎癥。本研究結果顯示，哮喘組小鼠肺組織 Notch1 及 Hes1 蛋白明顯增加，哮喘小鼠肺組織 Notch 信號通路活化，PM2.5 加劇此改變，相關性分析提示哮喘組和哮喘 PM2.5 組小鼠 Notch1、Hes1 蛋白表達與氣道重塑相關指標 α-SMA、TGF-β1、Col-Ⅰ 和 HYP 呈正相關，表明 PM2.5 引起的哮喘小鼠肺組織 Notch1、Hes1 蛋白表達升高和氣道重塑密切相關。
綜上所述，PM2.5 能夠促進哮喘的早期氣道重塑，Notch 信號通路的活化可能參與了 PM2.5 對早期氣道重塑的促進作用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種常見的慢性異質性氣道疾病。氣道炎癥是哮喘發生發展的關鍵因素，長期反復炎癥刺激可引起氣道重塑，是哮喘重要的病理特征[1]。研究發現細顆粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）濃度升高和哮喘患者門診就診及住院率增加密切相關[2-3]。PM2.5 可影響哮喘氣道炎癥和氣道重塑[4-5]，但確切機制不清。Notch 信號通路是一條高度保守的信號轉導途徑，在調節細胞炎癥、免疫失衡及上皮下纖維化等方面發揮重要作用[6]。Notch 信號調節的缺失，特別是 Notch1 的缺失，最近被認為與一些重要的肺部疾病的發病有關，特別是慢阻肺、哮喘、肺纖維化等[7]。研究發現轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和 Ⅰ 型膠原蛋白（type Ⅰ collagen，Col-Ⅰ）是早期氣道重塑的重要標志[8-9]。PM2.5 對哮喘氣道重塑的影響，其機制是否與Notch 信號通路有關尚不清楚。本研究以哮喘小鼠為研究對象，觀察 PM2.5 對哮喘小鼠氣道重塑及 TGF-β1、α-SMA和 Col-Ⅰ 表達的影響，并進一步探討 PM2.5 對哮喘小鼠肺組織 Notch1 受體及其下游 Hes1 表達的影響，旨在初步明確 PM2.5 影響哮喘氣道重塑的分子機制，為預防和治療哮喘氣道重塑奠定理論基礎。
1 材料和方法
1.1 實驗動物和主要材料
40 只 8 周齡無特定病原級雌性 BALB/c 小鼠，體重（20±2）g，購自蘭州大學醫學院實驗動物中心［批號：SCXK（甘）2018-0002］。主要材料：雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA，美國 Sigma 公司）、10% 氫氧化鋁佐劑（天津市恒興化學試劑制造有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒和羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）試劑盒（北京索萊寶生物公司），兔抗鼠 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 多克隆抗體（美國 Immunoway 公司）。2050 型空氣智能總懸浮顆粒物綜合采樣器（青島嶗山應用技術研究所），霧化器（PARI BOY N型，德國百瑞公司），圖像采集系統（日本尼康株式會社），Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件（美國 Media Cybernetics 公司），EMMS 動物肺功能測量系統（英國 EMMS 公司），BIO-RAD ChemiDocTM XRS 凝膠成像系統（美國 Bio-Rad 公司）。
1.2 方法
1.2.1 分組
40 只小鼠采用隨機數字表法分為健康對照組、健康 PM2.5 組、哮喘組、哮喘 PM2.5 組，共 4 組，每組各 10 只。
1.2.2 PM2.5 的采集與制備
沿用 Chu 等[10]的 PM2.5 采集和制備方法，采集蘭州市天水南路交通主干線旁 PM2.5。采樣完畢后，將含有 PM2.5 的玻璃纖維濾膜剪成 1 cm ×1 cm 的小方塊浸于雙蒸水中，超聲波震蕩器（28 ℃、40 Hz、500 W）洗脫，再洗脫 1 次。將兩次所得洗脫液混合，用 6 層紗布過濾，所得濾液即為 PM2.5 的混懸液。低溫（–4 ℃）離心 12000 r/min，20 min，將下層 PM2.5 懸液冷凍干燥 48 h，即為 PM2.5，PM2.5 置于 4 ℃ 冰箱保存，實驗時配置成所需濃度的混懸液，現配現用。
1.2.3 哮喘模型建立及 PM2.5 干預
參照雷澤林等[11]、Temelkovski 等[12]建模方法，采用 OVA 致敏和激發建立哮喘小鼠模型。哮喘組及哮喘 PM2.5 組分別于第 1、7、14 天腹腔注射致敏液（45 mL 磷酸鹽緩沖液+ 5 mL 10% 氫氧化鋁+5 mg OVA）200 μL致敏，第 21～28 天于自制霧化箱（20 cm×15 cm×10 cm）內以 2.5% OVA 霧化激發 30 min，每日 1 次。第 29～70 天，隔日 1 次上述霧化激發，每次霧化激發見小鼠出現呼吸急促、煩躁不安、腹肌痙攣等表現時判斷為陽性反應；健康對照組及健康 PM2.5 組在致敏和霧化激發階段給予等劑量生理鹽水。參照 Chu 等[10]、Gu 等[13]的方法并加以改良，健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組將小鼠置于 20 cm×15 cm×10 cm 的玻璃熏箱內，于每次激發后給予霧化吸入 PM2.5（510 μg/m3）氣溶膠，暴露 4次/d，15 min/次，間隔 0.5 h；健康對照組及哮喘組給予同等體積的生理鹽水霧化吸入。
1.2.4 肺功能測定
末次激發及 PM2.5 干預 24 h 后，參照藍凰齊等[14]方法，給予小鼠 1% 戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離組織，暴露氣管，插入插管連接 EMMS 動物肺功能測量系統測定第 0.1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.1 second，FEV0. 1）、第 0.2 秒用力呼氣末容積（FEV0. 2）、呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）、呼出 50% 潮氣量時的流速（EF50）和增強呼吸間歇（enhanced pause，Penh）。
1.2.5 標本收集及保存
肺功能檢測結束后，脫頸椎處死各組小鼠，置于冰臺上，結扎右總支氣管，于氣管遠端切下右肺，用 4% 的多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片；取左肺組織，迅速置于液氮中，然后保存于–80 ℃ 冰箱中行蛋白免疫印跡法檢測。
1.2.6 肺組織病理學切片蘇木精–伊紅染色
取包埋石蠟塊，常規石蠟及梯度乙醇脫水，蘇木素染液染 5 min 后自來水沖洗，鹽酸酒精分化 5 min 后再次用自來水沖洗，靜置返藍 10 min，再次梯度乙醇脫水，二甲苯透明 5 min，自然干燥后中性樹膠封片。每只小鼠選取 3 張肺組織蘇木精–伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色切片，每張切片以單盲法選取橫斷面較圓、直徑 100 μm 的細支氣管，至少觀察 3 支。應用 Image-Pro Plus6.0 圖像分析軟件測定氣道管壁總面積（wall area of bronchial tube，WAt）、平滑肌面積（wall area of bronchial smooth muscle，WAm）、支氣管基底膜周徑（perimeter of basement membrane，Pbm），用 Pbm 標準化，以 WAt/Pbm、WAm/Pbm 表示，分別代表支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度[15]。
1.2.7 肺組織病理學切片馬松三色染色
石蠟切片脫蠟至水，馬松（Masson）復合染液染 5 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，5% 磷鉬酸溶液洗 1～2 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，苯胺藍染色液染色 1～2 min，0.2% 醋酸水溶液洗 1 min，梯度酒精快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每只小鼠選取 3 張肺組織 Masson 染色切片，每張切片以單盲法選取橫斷面較圓、直徑 100 μm 的細支氣管，至少觀察 3 支。應用 Image-Pro Plus6.0 圖像分析軟件測定氣道基底膜膠原面積（wall area of collagen，WAc），同樣用 Pbm 標準化，以 WAc/Pbm 表示，代表膠原沉積面積[15]。
1.2.8 免疫組織化學法觀察肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表達
石蠟切片進行免疫組織化學分析。即經脫蠟固定后，加入抗 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 抗體和二抗孵育之后染色封片，顯微鏡觀察。
1.2.9 蛋白印跡法檢測肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表達
提取總蛋白后，BCA 蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白含量，取 50 μg 蛋白樣品，10% 十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至聚偏氟乙烯膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h，兔抗鼠 Notchl 多克隆抗體（1∶750）、兔抗鼠 Hesl 多克隆抗體（1∶200）、兔抗鼠 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 多克隆抗體（1∶1000）及內參照物 β-肌動蛋白（1∶200）4 ℃ 過夜，兔抗羊 IgG（1∶2000）、羊抗兔 IgG（1∶2000）室溫 2 h，顯影，檢測蛋白條帶。蛋白相對表達為目的基因灰度值/內參基因灰度值。
1.2.10 肺組織 HYP 含量測定
采用堿水法檢測肺組織 HYP 含量。操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件。呈正態分布的計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，各組計量資料數據先進行正態檢驗和方差齊性檢驗，凡符合正態分布和方差齊性的數據，采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用 LSD-t 檢驗，Pearson 法進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 哮喘模型的建立
（1）小鼠行為學的改變：哮喘組小鼠每次霧化激發后小鼠出現抓耳撓腮、煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣、大小便失禁等反應；而健康對照組小鼠霧化后行為正常，呼吸平穩。（2）肺功能改變：哮喘組 FEV0.1、FEV0.2、PEF、EF50 值均顯著低于健康對照組，Penh 顯著高于健康對照組；PM2.5 干預后健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組小鼠 FEV0.1、FEV0.2、PEF 和 EF50 均顯著降低，Penh 顯著升高（均 P<0.01，表1）。（3）肺組織病理形態學改變：哮喘組小鼠管腔狹窄，氣道黏膜褶皺增多、延長，氣管及肺血管周圍存在大量聚集成團的炎癥細胞，平滑肌增厚，管壁周圍膠原沉積明顯增加；健康對照組無此類改變。PM2.5 干預后，與各自的對照組比較，健康 PM2.5 組氣管及血管周圍可見炎癥細胞浸潤；哮喘 PM2.5 組氣道管腔明顯狹窄，氣管血管周圍藍色膠原沉積進一步加重，上皮下纖維化進一步加重，以上改變表明哮喘造模成功，且伴隨氣道炎癥，出現氣道重塑；PM2.5 加重哮喘肺功能及組織病理學改變。結果見圖1 和圖2。
表1
各組小鼠肺功能有關指標的比較（n=10，）
圖1
小鼠肺組織病理像（HE×200）
a. 健康對照組：氣道上皮細胞排列整齊，氣管及肺血管周圍無或少量炎癥細胞浸潤；b. 健康 PM2.5 組：氣管及血管周圍可見炎癥細胞浸潤；c. 哮喘組：氣道黏膜褶皺增多、延長，氣管及血管周圍大量炎癥細胞聚集成團，平滑肌增厚；d. 哮喘 PM2.5 組：氣道管腔明顯狹窄，管腔內大量粘液滲出，周圍大量炎性細胞浸潤。
圖2
小鼠肺組織病理像（Masson×200）
a. 健康對照組：氣管血管周圍僅見少量藍色膠原沉積；b. 健康 PM2.5 組：氣管血管周圍藍色膠原沉積增加；c. 哮喘組：氣管血管周圍大量藍色膠原沉積，上皮下纖維化明顯；d. 哮喘 PM2.5 組：氣管血管周圍藍色膠原沉積進一步加重，上皮下纖維化進一步加重。
2.2 小鼠氣道重塑指標比較
哮喘組氣道管壁總面積、氣道平滑肌面積及膠原沉積面積均顯著高于健康對照組（均 P<0.01）；健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組均分別高于各自對照組，結果顯示 PM2.5 對氣道重塑有明顯的促進作用（P<0.05 或 P<0.01）。結果見表2、圖1 和圖2。
表2
各組小鼠氣道重塑指標比較［n=10，μm2/μm，（）］
2.3 小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的免疫組織化學結果
哮喘組小鼠肺組織中 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表達呈強陽性，健康對照組表達較弱；PM2.5 干預后，與各自對照組比較，上述分子的表達強度進一步增加。結果見圖3。
圖3
小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 免疫組織化學染色結果（×200）
哮喘組小鼠肺組織中 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表達呈強陽性，健康對照組表達較弱；PM2.5 干預后，上述分子的表達強度進一步增加。
2.4 小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白測定結果
哮喘組 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ蛋白較健康對照組明顯增加，健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組均分別高于各自對照組。結果見表3和圖4。
表3
各組小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表達水平比較（n=10，）
圖4
小鼠肺組織 Notch1、Hes1、α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白表達
A：健康對照組；B：健康 PM2.5 組；C：哮喘組；D：哮喘 PM2.5 組
2.5 小鼠肺組織 HYP 含量
健康對照組、健康 PM2.5 組、哮喘組、哮喘 PM2.5 組小鼠肺組織 HYP 含量分別為（40.53±5.73）、（53.92±6.82）、（57.71±7.60）、（70.96±4.44）μg/100 mg，組內比較，差異有統計學意義（F=39.948，P<0.01）。其中，哮喘組肺組織中 HYP 含量較健康對照組明顯升高；健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組均分別高于各自對照組（均 P<0.01）。
2.6 相關性分析
哮喘組及哮喘 PM2.5 組，Notch1、Hes1 蛋白和氣道管壁總面積、氣道平滑肌面積、膠原沉積面積及α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表達及 HYP 含量均呈正相關（P<0.01 或 P<0.05），結果見表4。
表4
各組小鼠 Notch1、Hes1 蛋白與氣道重塑的相關性
3 討論
哮喘是由包括氣道炎癥細胞和結構細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、樹突狀細胞、T 淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等）多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[16]。哮喘炎癥細胞可以通過釋放促炎細胞因子和生長因子等促進氣道平滑肌細胞的遷移和增殖，氣道慢性炎癥得不到有效控制會導致氣道的損傷，損傷后氣道不完全或不恰當修復可導致氣道壁結構的改變，即氣道重塑[11, 17]。近年來研究表明哮喘的氣道重塑可以和氣道炎癥同時存在，也可以不依賴于氣道炎癥而存在[18]。哮喘反復發作，對氣道壁結構改變的影響逐漸明顯，進而出現不完全可逆或不可逆的氣流受限和肺功能下降，嚴重影響患者的生活質量。目前尚無有效的治療方法可以逆轉氣道重塑。因此重視哮喘的早期氣道重塑就顯得尤為重要。
哮喘氣道重塑的主要特征有平滑肌細胞增生和肥大、氣道壁增厚、支氣管管腔狹窄、氣道纖維化等病理改變[19-20]。Zhu 等[21]研究顯示，哮喘小鼠氣管及細支氣管周圍存在大量炎癥細胞浸潤并伴隨黏膜下水腫，嗜酸性粒細胞計數明顯增高；存在氣道平滑肌、基底膜增厚，杯狀細胞增生，黏液高分泌及上皮損傷；同時，哮喘小鼠氣道上皮厚度明顯增加。TGF-β1 屬于 TGF-β 超家族，主要參與調控哮喘氣道重塑，直接影響氣道壁膠原沉積，促進纖維化的形成等[22]。Shen 等[23]研究發現，哮喘小鼠肺組織 TGF-β1 的表達明顯升高。α-SMA 可反映平滑肌細胞的數量及其收縮能力，是平滑肌的主要標志物，α-SMA 和 Col-Ⅰ 被認為是早期氣道重塑的重要指標[24]。常琴等[25]研究發現哮喘大鼠肺組織 α-SMA 的表達明顯升高，Huang 等[26]研究也表明哮喘小鼠肺組織 α-SMA、Col-Ⅰ 的表達量增高。HYP 是膠原蛋白的一種特有氨基酸，其含量可代表膠原的合成量[27]。本研究組織病理學觀察到哮喘對照組小鼠氣道及血管平滑肌增生肥大、氣管管壁和基底膜增厚等氣道重塑的表現，膠原沉積增加，哮喘小鼠肺組織 HYP 含量亦明顯增加；同時哮喘組小鼠肺組織中 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 的表達呈強陽性；哮喘組 α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白亦明顯增加。這些有表明哮喘小鼠存在明顯的氣道重塑現象。
大氣中的 PM2.5 組分復雜，是構成大氣污染物的主要組份，包括有機成分（多環芳烴，長鏈烴）、無機成分（NH4+、SO42－、NO3－等）、重金屬元素、病原微生物等[28]。研究表明 PM2.5 可以隨細菌、病毒、花粉等物質在下呼吸道和肺泡沉積，引起或加重已有的肺部炎癥[29]。也有研究發現在氣道內顆粒物趨向于從大向小的氣道位置沉積；顆粒物越小，其沉積在離氣道口越遠的區域，PM2.5 主要沉積在遠端小氣道[30]。本研究發現 PM2.5 干預后健康 PM2.5 組和哮喘 PM2.5 組小鼠小氣道功能指標 EF50 顯著降低，Penh 顯著升高。Liu 等[31]研究發現 PM2.5 可顯著增加哮喘小鼠肺組織炎癥細胞浸潤及支氣管、血管周圍炎癥細胞評分，炎癥細胞浸潤以嗜酸性粒細胞為主；同時 PM2.5 亦可顯著增加哮喘小鼠的支氣管壁厚度。Xu 等[4]研究發現 PM2.5 可使哮喘大鼠支氣管上皮和肺泡壁充血水腫更明顯，且顯著增加哮喘大鼠支氣管壁厚度和平滑肌厚度。本研究結果顯示 PM2.5 可增加哮喘小鼠氣道壁總面積，氣道平滑肌及氣道、血管旁膠原沉積面積，同時，α-SMA、TGF-β1 和 Col-Ⅰ 蛋白及 HYP 含量也顯著增加。這表明 PM2.5 可加劇哮喘及健康小鼠氣道重塑。
完整的 Notch 信號通路由 Notch 受體、Notch 配體和細胞效應器分子組成。研究發現哺乳動物體內有 4 種同源 Notch 受體（Notch1/2/3/4）和 5 種同源配體（Jagged1/2、Delta1/3/4），通過細胞間的相互接觸，活化下游靶基因 Hes 和 Hey 家族，共同調節細胞炎癥、免疫失衡及上皮下纖維化等[6]。近年研究發現 Notch 信號通路抑制劑 GSI 可減輕哮喘小鼠氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤，氣道杯狀細胞化生及粘液高分泌，同時也可以減輕氣道平滑肌增生[32]。Hu 等[33]研究發現，使用 Notch 信號通路抑制劑 KyoT2 可通過 Hes1 依賴的機制減輕哮喘小鼠氣道上皮纖維化這一氣道重塑現象。Liu 等[34]發現 PM2.5 可以劑量依賴的方式激活 Notch 信號通路，上調 Hes1 的表達參與人支氣管上皮細胞 Muc5ac 的表達。Xia 等[35]發現環境超細顆粒物可通過激活哮喘小鼠 Notch4 的表達，促進 T 細胞亞群的失衡，進而加劇哮喘小鼠氣道炎癥。本研究結果顯示，哮喘組小鼠肺組織 Notch1 及 Hes1 蛋白明顯增加，哮喘小鼠肺組織 Notch 信號通路活化，PM2.5 加劇此改變，相關性分析提示哮喘組和哮喘 PM2.5 組小鼠 Notch1、Hes1 蛋白表達與氣道重塑相關指標 α-SMA、TGF-β1、Col-Ⅰ 和 HYP 呈正相關，表明 PM2.5 引起的哮喘小鼠肺組織 Notch1、Hes1 蛋白表達升高和氣道重塑密切相關。
綜上所述，PM2.5 能夠促進哮喘的早期氣道重塑，Notch 信號通路的活化可能參與了 PM2.5 對早期氣道重塑的促進作用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
