引用本文： 陸思芬, 周永召, 王剛, 王婧, 江娟, 鄧竹君, 張文庚, 李為民. 基于宏基因組二代測序技術的840例疑似肺部感染患者下呼吸道微生物特征分析. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(6): 403-411. doi: 10.7507/1671-6205.202112019 復制
呼吸系統感染是最常見的感染性疾病類型，眾所周知，新冠肺炎是很嚴重的呼吸系統感染性疾病，因此防控呼吸系統感染性疾病意義重大[1]。因傳統的檢測方法在敏感性、特異性、時效性、信息量等方面存在局限，而且對于未知或者罕見的病原微生物，無法快速識別[2-4]。隨著基因組學技術的發展，基于宏基因組二代測序技術（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）直接針對樣本中所有核酸進行無偏性測序，結合病原微生物數據庫及特定算法，快速檢測樣本中含有的可能病原微生物（包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲），且無需特異性擴增，尤其適用于像新冠肺炎這種急危重癥呼吸系統感染性疾病的診斷[5-6]。本研究回顧性地分析了四川大學華西醫院2020年8月—2021年10月采用mNGS技術診斷的840例疑似肺部感染患者的肺泡灌洗液標本中的病原微生物數據，旨在分析肺部感染患者的臨床感染微生物特征，為此類患者的早期診斷提供參考依據。
1 資料與方法
1.1 樣本的基本信息
本研究納入2020年8月—2021年10月四川大學華西醫院采用mNGS技術診斷的840例疑似肺部感染患者。其中，43例為門診患者，797例住院患者；年齡14～95歲，235例大于65歲；男542例，女298例。鑒于收集的數據覆蓋了一年多的時間段，對不同季節的微生物分布也進行了分析。根據成都的氣候，定義秋冬季為9月—次年2月，春夏季為3月—8月。
1.2 病原學mNGS檢測及臨床解讀
840例患者均采集肺泡灌洗液標本進行病原微生物檢測，采樣步驟遵循以下標準[7]。（1）樣本處理和DNA提取：肺泡灌洗液經玻璃珠混合震蕩后取 0.5～3 mL, 后加入7.2 μL溶壁酶（RT410-TA, TIANGEN BIOTECH，北京）進行酶破壁反應，混合震蕩后取300 μL樣本，并按照TIANamp Micro DNAKit試劑盒（DP316, TIANGENBIOTECH，北京）說明書提取DNA（用作DNA文庫構建）。（2）文庫構建和測序：對提取好的核酸進行酶切片段化、末端修復、接頭連接及聚合酶鏈反應進行文庫構建，使用 Agilent2100 Bioanalyzer質控文庫，質控文庫片段大小為200~300 bp左右，使用QubitdsDNAHS AssayKit（Thermo Fisher Scientific Inc.）質控DNA文庫濃度，按照檢測后的濃度將構建好的文庫按照等質量進行pooling，將pooling混合后的文庫經環化形成單鏈環形結構。再經滾環復制形成DNA納米球，然后加載至測序芯片，采用MGI2000進行高通量mNGS測序[8]。（3）數據分析：測序所得原始結果首選去除質量低和接頭污染的數據，過濾后的數據通過對比BWA（http://bio-bwasourceforgenet/）去除人參考基因組序列。剩下的數據除去低復雜度序列，然后比對BGI微生物參考數據庫PMDB（包括6350種細菌、1064種真菌、4945種病毒、234種寄生蟲），將比對后的數據按照細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體/衣原體等進行分類，得到初步的結果。（4）數據解讀：結合陰控對照樣本的檢出排除污染和不可信的結果，所有物種的通用排除標準如下：① 該物種的每百萬有效測序序列數（reads per million，RPM）<3倍陰控樣本中該物種的RPM；② 常見的已知污染物種；③ 種水平序列數<3；④ 該物種比對到參考基因組的分布不均勻，因為分布太集中，可能只是某個區域的隨機片段，并不是真實序列；⑤ 文獻中報道的呼吸道中常見定植菌；⑥ 同批次中其他樣本存在該物種的強陽檢出（序列數大于10000，或者序列數遠遠大于其他所有樣本），結合樣本提取順序排除；⑦ 常見的環境物種，不致病的物種。排除污染和不可信的結果后，由于細菌檢出物種很多，再按照屬水平的序列數進行排序，一般物種只考慮排名前10的屬，每個屬中只考慮序列數排名前2的種；對于致病性很強的常見物種（比如肺炎克雷伯菌），則不受該排名的限制，只要滿足上述的排除標準就保留；真菌和病毒，只要滿足上述的排除標準就保留；寄生蟲由于基因組序列比較大，而且跟人的參考基因組相似度更高，除了滿足上述的排除標準，還需要滿足序列數>10。并且，結合患者的臨床提示，選擇最可信的物種，出具初步的檢測報告。然后，臨床醫師結合傳統檢測和影像學檢查等結果，出具最終的檢測報告。本研究中納入的數據為最終檢測報告中的微生物數據。
在進行細菌分布特征分析時，由于不同微生物所獲取的片段數差異，相對測序豐度低的細菌通過比對僅能確定至屬，因此，對于結核分枝桿菌復合群中的物種，全部統一到屬水平，而其他物種全部統一到種水平。
需要強調的是，臨床醫生需要依據患者病情、臨床表現、影像學檢查、經驗，甚至多學科會診，全面分析mNGS結果，最終確定致病病原體[9]。
1.3 統計學方法
為了排除測序數據量對結果的影響，本研究中納入的840例樣本的微生物序列數統一采用RPM，然后再進行比較。使用R 4.0.3統計學軟件進行數據分析處理。采用Wilcoxon秩和檢驗分析兩組樣本之間的差異，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 總體微生物分布特征
840例患者的測序結果中，微生物陽性患者有743例（占88.45%）；其中細菌感染陽性比例顯著高于病毒或真菌感染者；其中743例測序陽性患者中檢出頻數最多的20個微生物分布見圖1。鮑曼不動桿菌比例最高，占18.98% （141/743），其次為人類β皰疹病毒5型（17.90%、133/743），人類γ皰疹病毒4型 （17.36%、129/743），人類β皰疹病毒7型（16.15%、120/743），肺炎鏈球菌（14.13%、105/743），人類α皰疹病毒1型（13.59%、101/743），肺炎克雷伯菌（13.46%、100/743），白色念珠菌（12.38%、92/743），屎腸球菌（12.11%、90/743），結核分枝桿菌復合群（11.98%、89/743），微小微單胞菌（9.83%、73/743），銅綠假單胞菌（9.29%、69/743），耶氏肺孢子菌（9.02%、67/743），煙曲霉（7.40%、55/743），嗜麥芽窄食單胞菌（6.33%、47/743），細環病毒（6.06%、45/743），星座鏈球菌（5.52%、41/743），痰液嗜血桿菌（4.58%、34/743），副溶血嗜血桿菌（4.31%、32/743），熱帶念珠菌（4.04%、30/743）。
圖1
743例測序陽性患者中檢出最多的20個物種分布圖
2.2 細菌分布特征
由于細菌的檢出物種比較多，只展示頻數最高的30個細菌分布見表1。結果發現，檢出頻數最多的5個細菌為：鮑曼不動桿菌比例最高，占18.98% （141/743），其次是肺炎鏈球菌（14.13%、105/743），肺炎克雷伯菌（13.46%、100/743），屎腸球菌（12.11%、90/743）和結核分枝桿菌復合群（11.98%、89/743）。其中，鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的平均序列數也是排名最高的，分別為2607.48和250.21。另外，也檢出了一些特殊的病原體，例如檢出9例鸚鵡熱衣原體。
表1
743例測序陽性患者的細菌種類分布
2.3 真菌分布特征
檢出真菌的種類明顯少于細菌，一共檢出28個物種，所有檢出真菌的分布見表2。結果發現，檢出頻數最多的3個真菌為：白色念珠菌（12.38%、92/743），耶氏肺孢子菌（9.02%、67/743）和煙曲霉（7.40%、55/743），這3個真菌的平均序列數也排名靠前，分別為白色念珠菌（63.64），耶氏肺孢子菌（141.86），煙曲霉（45.59）。另外，隱球菌檢出6例，根（毛）霉檢出5例。值得一提的是，也檢出了一些特殊的病原體，例如檢出1例馬爾尼菲籃狀菌，該病例是人類免疫缺陷病毒感染患者。
表2
743例測序陽性患者的真菌種類分布
2.4 病毒分布特征
檢出病毒的種類明顯少于細菌，病毒統一到種水平，一共檢出22個物種，所有檢出病毒的分布見表3。檢出頻數最多的4個病毒為：人類β皰疹病毒5型（17.90%、133/743），人類γ皰疹病毒4型（17.36%、129/743），人類β皰疹病毒7型（16.15%、120/743）和人類α皰疹病毒1型（13.59%、101/743），其中平均序列數最高的是人類α皰疹病毒1型（367.27），其次是人類β皰疹病毒5型（51.43）。另外，也檢出了人類哺乳動物腺病毒D組和人類哺乳動物腺病毒C型各1例。
表3
743例測序陽性患者的病毒種類分布
2.5 寄生蟲分布特征
寄生蟲檢出種類很少，一共只檢出4個物種，所有檢出物種見表4。具體為：檢出2例多房棘球絳蟲，2例廣州管圓線蟲，2例屋塵螨和1例粉塵螨。平均序列數分別為多房棘球絳蟲（540.5），屋塵螨（107），粉塵螨（104）和廣州管圓線蟲（16）。值得一提的是本研究中納入的數據表明寄生蟲并不單獨作為致病病原體，都是以合并細菌或者病毒感染的形式存在。提示臨床，肺部感染患者也要留意寄生蟲導致的合并感染。
表4
743例測序陽性患者的寄生蟲種類分布
2.6 測序陽性患者的感染類型
對743例測序陽性患者的檢出微生物物種，按照細菌，真菌，病毒和寄生蟲這4種進行分類，統計結果見表5。混合感染定義為檢出2種或以上分類的感染。結果發現，非混合感染中，細菌感染的比例最高（35.13%、261/743），混合感染中，細菌+病毒混合感染的比例最高（22.61%、168/743），其次是細菌+真菌+病毒混合感染（16.02%、119/743），細菌+真菌（10.63%、79/743）和真菌+病毒（4.58%、34/743），而細菌+病毒+寄生蟲以及病毒+寄生蟲的檢出率較低（僅占0.81%和0.13%）。
表5
743 例測序陽性患者的感染類型
2.7 不同季節微生物分布特征
不同季節的微生物分布也存在一定的特征。743例陽性樣本包括343例秋冬季樣本和400例春夏季樣本。首先，統計不同季節中檢出最多的20個物種做分布圖（圖2）。結果發現，秋冬季檢出頻數最多的是細菌（鮑曼不動桿菌），春夏季檢出頻數最多的是病毒（人類γ皰疹病毒4型）。其次，為了比較秋冬季和春夏季這些檢出物種的序列數，對以上兩個圖中的物種取并集得到24個物種，統計這24個物種的序列數（表6）。結果發現，有16個物種的平均序列數，春夏季的檢出要高于秋冬季的。并且，肺炎克雷伯菌（P = 0.024）, 流感嗜血桿菌（P = 0.026）, 膿腫分枝桿菌（P < 0.001）, 痰液嗜血桿菌（P = 0.004）, 微小微單胞菌（P < 0.001）, 耶氏肺孢子菌（P = 0.015）, 人類β皰疹病毒5型（P = 0.002），人類β皰疹病毒7型（P = 0.002）和細環病毒（P = 0.001）的平均序列數，在春夏季和秋冬季的比較中，為差異有統計學意義。
圖2
743例測序陽性患者在不同季節中檢出最多的20個物種分布圖
a. 343例秋冬季陽性樣本中檢出最多的20個物種分布圖；b. 400例春夏季陽性樣本中檢出最多的20個物種分布圖。
表6
400例春夏季和343例秋冬季樣本檢出頻率最高的物種的序列數比較
3 討論
肺部感染是發病率和死亡率最高的感染性疾病[10-14]，給社會和個人造成了極其承重的疾病負擔。由于造成該類感染的病原體存在多樣性，多數醫生在無法進行準確的病原學診斷前常采用經驗治療[15]，但是經驗性治療的效果往往不佳。因此，快速且準確地找到該類感染的病原體，給予針對性的治療，是迫切需要解決的問題[16]。mNGS可以進行無偏性測序，無需培養，病原體覆蓋度廣，靈敏度高，有利于鑒定不明病原體和混合感染[5-6]。本研究采用mNGS技術系統性地分析了疑似肺部感染患者的下呼吸道微生物特征，對該類感染患者的病原診斷和精準治療具有重要的臨床意義。
本研究分析了840例疑似肺部感染患者的下呼吸道微生物特征，結果發現840例患者的測序結果中，微生物陽性患者有743例（88.45%）；其中檢出頻數最多的5個細菌為：鮑曼不動桿菌比例最高，占18.98% （141/743），其次是肺炎鏈球菌（14.13%、105/743），肺炎克雷伯菌（13.46%、100/743），屎腸球菌（12.11%、90/743）和結核分枝桿菌復合群（11.98%、89/743）。其中，鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的平均序列數也是排名最高的，分別為2607.48和250.21。即革蘭陰性菌以鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌為主，革蘭陽性菌以肺炎鏈球菌，屎腸球菌和結核分枝桿菌復合群為主；細菌譜特征與之前的結論基本一致[17]；另外，檢出頻數最多的3個真菌為：白色念珠菌（12.38%、92/743），耶氏肺孢子菌（9.02%、67/743），煙曲霉（7.40%、55/743），這3個真菌的平均序列數也排名靠前，分別為白色念珠菌（63.64），耶氏肺孢子菌（141.86），煙曲霉（45.59）。即真菌譜特征以耶氏肺孢子菌、煙曲霉菌和白色念珠菌為主[18]，而隱球菌、毛霉菌和地方性真菌檢出較少但也值得關注。另外，檢出頻數最多的4個病毒為：人類β皰疹病毒5型（17.90%、133/743），人類γ皰疹病毒4型（17.36%、129/743），人類β皰疹病毒7型（16.15%、120/743）和人類α皰疹病毒1型（13.59%、101/743），其中平均序列數最高的是人類α皰疹病毒1型（367.27），其次是人類β皰疹病毒5型（51.43）。即病毒的特征以人類β皰疹病毒5型，人類γ皰疹病毒4型和人類β皰疹病毒7型為主[12-13]，該結果進一步證實，人類β皰疹病毒5型、人類γ皰疹病毒4型、和人類β皰疹病毒7型與肺部感染關系密切[12-13]。同時，也需要關注其他呼吸道病毒，比如人類哺乳動物腺病毒。而由寄生蟲導致的肺部感染病例非常少，沒有明顯的特征；寄生蟲并不單獨作為致病病原體，都是以合并細菌或者病毒感染的形式存在。值得一提的是，非混合感染中，細菌感染的比例最高（35.13%、261/743），而混合感染中，細菌+病毒混合感染的比例最高（22.61%、168/743），其次是細菌+真菌+病毒混合感染（16.02%、119/743），細菌+真菌（10.63%、79/743）和真菌+病毒（4.58%、34/743），而細菌+病毒+寄生蟲以及病毒+寄生蟲的檢出率較低（僅占0.81%和0.13%）；說明mNGS在混合感染的檢測方面有明顯的優勢，因為對于混合感染的檢測是傳統檢測方法難以逾越的障礙。提示臨床醫生，這些特征可以為診斷此類肺部感染患者的病因提供一定的參考依據。
其次，本研究發現不同季節的微生物分布也存在一定的特征。例如，秋冬季檢出頻數最多的是細菌（鮑曼不動桿菌），春夏季檢出頻數最多的是病毒（人類γ皰疹病毒4型），而且有9個物種的平均序列數在兩組的比較中是差異顯著的（P<0.05），表明不同季節的肺部微生物存在不同的特征[19]，提示臨床醫生，不同季節的肺部感染病因可能存在差異，要針對性地治療。
更重要的是，對于未知病原體的檢測也是傳統檢測方法的不足之處。mNGS對于未知或者罕見的病原微生物的快速識別有明顯的優勢，該技術將為感染性疾病的診斷帶來新的突破口[20]，值得進一步推廣和應用。本研究通過mNGS技術，測到了一些不常見的特殊病原體，例如鸚鵡熱衣原體和馬爾尼菲籃狀菌等。鸚鵡熱衣原體肺炎是一種動物源性感染性疾病，具有一定的臨床癥狀、實驗室檢查和影像學特點，采用mNGS技術快速診斷并給予合適的治療能明顯縮短病程并改善預后[10]。據文獻報道，馬爾尼菲籃狀菌感染已經發展成為艾滋病患者常見的機會性感染之一，提示患有艾滋病免疫功能低下的患者，要留意馬爾尼菲籃狀菌的合并感染[11]。提示臨床醫生，在遇到不明原因的肺部感染患者時，不能排除這些非典型的致病病原體，可以考慮采用mNGS技術進行輔助診斷。
但是，因mNGS高度的敏感性，且臨床樣本采集及實驗室測序諸多環節中均存在潛在的污染可能，其結果可能存在一定的假陽性，因此，mNGS的數據解讀是該技術中的一大難點，需要不斷完善相關的標準和共識。另外，mNGS技術在實驗的過程中也有待完善的地方，例如在樣本采集過程中需要嚴格執行無菌化操作，在實驗過程中需要保持實驗室操作流程標準化。只有不斷完善這些要點，才能使mNGS技術在感染性疾病的診斷中發揮更好的作用[21]。同時，臨床醫生也需要以科學嚴謹的態度，采用合理的方式將mNGS應用于臨床實踐。
本研究也存在一定局限性：本研究中納入的數據為mNGS檢測的檢測報告中提示的致病病原體，并不涉及隨訪數據，這些微生物是否全部都被確定為致病病原體，以及根據這些病原體的治療效果，有待進一步確認。我們將在未來的研究中，納入相關的數據，進行更多更深入的研究。
綜上所述, 本研究通過分析840例疑似肺部感染患者的肺泡灌洗液標本中的微生物數據特征，發現肺部感染患者的下呼吸道微生物中，革蘭陰性菌以鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌為主，革蘭陽性菌以肺炎鏈球菌，屎腸球菌和結核分枝桿菌復合群為主；真菌以白色念珠菌，耶氏肺孢子菌和煙曲霉為主；病毒以人類β皰疹病毒5型，人類γ皰疹病毒4型和人類β皰疹病毒7型為主；寄生蟲感染很少，無明顯特征；合并感染以細菌感染和細菌病毒混合感染為主；秋冬季和春夏季的微生物特征不同；另外，存在特殊致病病原體，例如鸚鵡熱衣原體和馬爾尼菲籃狀菌等。這些特征可以為此類肺部感染患者的病因診斷提供一定的參考依據，有助于早期精準地進行臨床干預。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
呼吸系統感染是最常見的感染性疾病類型，眾所周知，新冠肺炎是很嚴重的呼吸系統感染性疾病，因此防控呼吸系統感染性疾病意義重大[1]。因傳統的檢測方法在敏感性、特異性、時效性、信息量等方面存在局限，而且對于未知或者罕見的病原微生物，無法快速識別[2-4]。隨著基因組學技術的發展，基于宏基因組二代測序技術（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）直接針對樣本中所有核酸進行無偏性測序，結合病原微生物數據庫及特定算法，快速檢測樣本中含有的可能病原微生物（包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲），且無需特異性擴增，尤其適用于像新冠肺炎這種急危重癥呼吸系統感染性疾病的診斷[5-6]。本研究回顧性地分析了四川大學華西醫院2020年8月—2021年10月采用mNGS技術診斷的840例疑似肺部感染患者的肺泡灌洗液標本中的病原微生物數據，旨在分析肺部感染患者的臨床感染微生物特征，為此類患者的早期診斷提供參考依據。
1 資料與方法
1.1 樣本的基本信息
本研究納入2020年8月—2021年10月四川大學華西醫院采用mNGS技術診斷的840例疑似肺部感染患者。其中，43例為門診患者，797例住院患者；年齡14～95歲，235例大于65歲；男542例，女298例。鑒于收集的數據覆蓋了一年多的時間段，對不同季節的微生物分布也進行了分析。根據成都的氣候，定義秋冬季為9月—次年2月，春夏季為3月—8月。
1.2 病原學mNGS檢測及臨床解讀
840例患者均采集肺泡灌洗液標本進行病原微生物檢測，采樣步驟遵循以下標準[7]。（1）樣本處理和DNA提取：肺泡灌洗液經玻璃珠混合震蕩后取 0.5～3 mL, 后加入7.2 μL溶壁酶（RT410-TA, TIANGEN BIOTECH，北京）進行酶破壁反應，混合震蕩后取300 μL樣本，并按照TIANamp Micro DNAKit試劑盒（DP316, TIANGENBIOTECH，北京）說明書提取DNA（用作DNA文庫構建）。（2）文庫構建和測序：對提取好的核酸進行酶切片段化、末端修復、接頭連接及聚合酶鏈反應進行文庫構建，使用 Agilent2100 Bioanalyzer質控文庫，質控文庫片段大小為200~300 bp左右，使用QubitdsDNAHS AssayKit（Thermo Fisher Scientific Inc.）質控DNA文庫濃度，按照檢測后的濃度將構建好的文庫按照等質量進行pooling，將pooling混合后的文庫經環化形成單鏈環形結構。再經滾環復制形成DNA納米球，然后加載至測序芯片，采用MGI2000進行高通量mNGS測序[8]。（3）數據分析：測序所得原始結果首選去除質量低和接頭污染的數據，過濾后的數據通過對比BWA（http://bio-bwasourceforgenet/）去除人參考基因組序列。剩下的數據除去低復雜度序列，然后比對BGI微生物參考數據庫PMDB（包括6350種細菌、1064種真菌、4945種病毒、234種寄生蟲），將比對后的數據按照細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體/衣原體等進行分類，得到初步的結果。（4）數據解讀：結合陰控對照樣本的檢出排除污染和不可信的結果，所有物種的通用排除標準如下：① 該物種的每百萬有效測序序列數（reads per million，RPM）<3倍陰控樣本中該物種的RPM；② 常見的已知污染物種；③ 種水平序列數<3；④ 該物種比對到參考基因組的分布不均勻，因為分布太集中，可能只是某個區域的隨機片段，并不是真實序列；⑤ 文獻中報道的呼吸道中常見定植菌；⑥ 同批次中其他樣本存在該物種的強陽檢出（序列數大于10000，或者序列數遠遠大于其他所有樣本），結合樣本提取順序排除；⑦ 常見的環境物種，不致病的物種。排除污染和不可信的結果后，由于細菌檢出物種很多，再按照屬水平的序列數進行排序，一般物種只考慮排名前10的屬，每個屬中只考慮序列數排名前2的種；對于致病性很強的常見物種（比如肺炎克雷伯菌），則不受該排名的限制，只要滿足上述的排除標準就保留；真菌和病毒，只要滿足上述的排除標準就保留；寄生蟲由于基因組序列比較大，而且跟人的參考基因組相似度更高，除了滿足上述的排除標準，還需要滿足序列數>10。并且，結合患者的臨床提示，選擇最可信的物種，出具初步的檢測報告。然后，臨床醫師結合傳統檢測和影像學檢查等結果，出具最終的檢測報告。本研究中納入的數據為最終檢測報告中的微生物數據。
在進行細菌分布特征分析時，由于不同微生物所獲取的片段數差異，相對測序豐度低的細菌通過比對僅能確定至屬，因此，對于結核分枝桿菌復合群中的物種，全部統一到屬水平，而其他物種全部統一到種水平。
需要強調的是，臨床醫生需要依據患者病情、臨床表現、影像學檢查、經驗，甚至多學科會診，全面分析mNGS結果，最終確定致病病原體[9]。
1.3 統計學方法
為了排除測序數據量對結果的影響，本研究中納入的840例樣本的微生物序列數統一采用RPM，然后再進行比較。使用R 4.0.3統計學軟件進行數據分析處理。采用Wilcoxon秩和檢驗分析兩組樣本之間的差異，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 總體微生物分布特征
840例患者的測序結果中，微生物陽性患者有743例（占88.45%）；其中細菌感染陽性比例顯著高于病毒或真菌感染者；其中743例測序陽性患者中檢出頻數最多的20個微生物分布見圖1。鮑曼不動桿菌比例最高，占18.98% （141/743），其次為人類β皰疹病毒5型（17.90%、133/743），人類γ皰疹病毒4型 （17.36%、129/743），人類β皰疹病毒7型（16.15%、120/743），肺炎鏈球菌（14.13%、105/743），人類α皰疹病毒1型（13.59%、101/743），肺炎克雷伯菌（13.46%、100/743），白色念珠菌（12.38%、92/743），屎腸球菌（12.11%、90/743），結核分枝桿菌復合群（11.98%、89/743），微小微單胞菌（9.83%、73/743），銅綠假單胞菌（9.29%、69/743），耶氏肺孢子菌（9.02%、67/743），煙曲霉（7.40%、55/743），嗜麥芽窄食單胞菌（6.33%、47/743），細環病毒（6.06%、45/743），星座鏈球菌（5.52%、41/743），痰液嗜血桿菌（4.58%、34/743），副溶血嗜血桿菌（4.31%、32/743），熱帶念珠菌（4.04%、30/743）。
圖1
743例測序陽性患者中檢出最多的20個物種分布圖
2.2 細菌分布特征
由于細菌的檢出物種比較多，只展示頻數最高的30個細菌分布見表1。結果發現，檢出頻數最多的5個細菌為：鮑曼不動桿菌比例最高，占18.98% （141/743），其次是肺炎鏈球菌（14.13%、105/743），肺炎克雷伯菌（13.46%、100/743），屎腸球菌（12.11%、90/743）和結核分枝桿菌復合群（11.98%、89/743）。其中，鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的平均序列數也是排名最高的，分別為2607.48和250.21。另外，也檢出了一些特殊的病原體，例如檢出9例鸚鵡熱衣原體。
表1
743例測序陽性患者的細菌種類分布
2.3 真菌分布特征
檢出真菌的種類明顯少于細菌，一共檢出28個物種，所有檢出真菌的分布見表2。結果發現，檢出頻數最多的3個真菌為：白色念珠菌（12.38%、92/743），耶氏肺孢子菌（9.02%、67/743）和煙曲霉（7.40%、55/743），這3個真菌的平均序列數也排名靠前，分別為白色念珠菌（63.64），耶氏肺孢子菌（141.86），煙曲霉（45.59）。另外，隱球菌檢出6例，根（毛）霉檢出5例。值得一提的是，也檢出了一些特殊的病原體，例如檢出1例馬爾尼菲籃狀菌，該病例是人類免疫缺陷病毒感染患者。
表2
743例測序陽性患者的真菌種類分布
2.4 病毒分布特征
檢出病毒的種類明顯少于細菌，病毒統一到種水平，一共檢出22個物種，所有檢出病毒的分布見表3。檢出頻數最多的4個病毒為：人類β皰疹病毒5型（17.90%、133/743），人類γ皰疹病毒4型（17.36%、129/743），人類β皰疹病毒7型（16.15%、120/743）和人類α皰疹病毒1型（13.59%、101/743），其中平均序列數最高的是人類α皰疹病毒1型（367.27），其次是人類β皰疹病毒5型（51.43）。另外，也檢出了人類哺乳動物腺病毒D組和人類哺乳動物腺病毒C型各1例。
表3
743例測序陽性患者的病毒種類分布
2.5 寄生蟲分布特征
寄生蟲檢出種類很少，一共只檢出4個物種，所有檢出物種見表4。具體為：檢出2例多房棘球絳蟲，2例廣州管圓線蟲，2例屋塵螨和1例粉塵螨。平均序列數分別為多房棘球絳蟲（540.5），屋塵螨（107），粉塵螨（104）和廣州管圓線蟲（16）。值得一提的是本研究中納入的數據表明寄生蟲并不單獨作為致病病原體，都是以合并細菌或者病毒感染的形式存在。提示臨床，肺部感染患者也要留意寄生蟲導致的合并感染。
表4
743例測序陽性患者的寄生蟲種類分布
2.6 測序陽性患者的感染類型
對743例測序陽性患者的檢出微生物物種，按照細菌，真菌，病毒和寄生蟲這4種進行分類，統計結果見表5。混合感染定義為檢出2種或以上分類的感染。結果發現，非混合感染中，細菌感染的比例最高（35.13%、261/743），混合感染中，細菌+病毒混合感染的比例最高（22.61%、168/743），其次是細菌+真菌+病毒混合感染（16.02%、119/743），細菌+真菌（10.63%、79/743）和真菌+病毒（4.58%、34/743），而細菌+病毒+寄生蟲以及病毒+寄生蟲的檢出率較低（僅占0.81%和0.13%）。
表5
743 例測序陽性患者的感染類型
2.7 不同季節微生物分布特征
不同季節的微生物分布也存在一定的特征。743例陽性樣本包括343例秋冬季樣本和400例春夏季樣本。首先，統計不同季節中檢出最多的20個物種做分布圖（圖2）。結果發現，秋冬季檢出頻數最多的是細菌（鮑曼不動桿菌），春夏季檢出頻數最多的是病毒（人類γ皰疹病毒4型）。其次，為了比較秋冬季和春夏季這些檢出物種的序列數，對以上兩個圖中的物種取并集得到24個物種，統計這24個物種的序列數（表6）。結果發現，有16個物種的平均序列數，春夏季的檢出要高于秋冬季的。并且，肺炎克雷伯菌（P = 0.024）, 流感嗜血桿菌（P = 0.026）, 膿腫分枝桿菌（P < 0.001）, 痰液嗜血桿菌（P = 0.004）, 微小微單胞菌（P < 0.001）, 耶氏肺孢子菌（P = 0.015）, 人類β皰疹病毒5型（P = 0.002），人類β皰疹病毒7型（P = 0.002）和細環病毒（P = 0.001）的平均序列數，在春夏季和秋冬季的比較中，為差異有統計學意義。
圖2
743例測序陽性患者在不同季節中檢出最多的20個物種分布圖
a. 343例秋冬季陽性樣本中檢出最多的20個物種分布圖；b. 400例春夏季陽性樣本中檢出最多的20個物種分布圖。
表6
400例春夏季和343例秋冬季樣本檢出頻率最高的物種的序列數比較
3 討論
肺部感染是發病率和死亡率最高的感染性疾病[10-14]，給社會和個人造成了極其承重的疾病負擔。由于造成該類感染的病原體存在多樣性，多數醫生在無法進行準確的病原學診斷前常采用經驗治療[15]，但是經驗性治療的效果往往不佳。因此，快速且準確地找到該類感染的病原體，給予針對性的治療，是迫切需要解決的問題[16]。mNGS可以進行無偏性測序，無需培養，病原體覆蓋度廣，靈敏度高，有利于鑒定不明病原體和混合感染[5-6]。本研究采用mNGS技術系統性地分析了疑似肺部感染患者的下呼吸道微生物特征，對該類感染患者的病原診斷和精準治療具有重要的臨床意義。
本研究分析了840例疑似肺部感染患者的下呼吸道微生物特征，結果發現840例患者的測序結果中，微生物陽性患者有743例（88.45%）；其中檢出頻數最多的5個細菌為：鮑曼不動桿菌比例最高，占18.98% （141/743），其次是肺炎鏈球菌（14.13%、105/743），肺炎克雷伯菌（13.46%、100/743），屎腸球菌（12.11%、90/743）和結核分枝桿菌復合群（11.98%、89/743）。其中，鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌的平均序列數也是排名最高的，分別為2607.48和250.21。即革蘭陰性菌以鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌為主，革蘭陽性菌以肺炎鏈球菌，屎腸球菌和結核分枝桿菌復合群為主；細菌譜特征與之前的結論基本一致[17]；另外，檢出頻數最多的3個真菌為：白色念珠菌（12.38%、92/743），耶氏肺孢子菌（9.02%、67/743），煙曲霉（7.40%、55/743），這3個真菌的平均序列數也排名靠前，分別為白色念珠菌（63.64），耶氏肺孢子菌（141.86），煙曲霉（45.59）。即真菌譜特征以耶氏肺孢子菌、煙曲霉菌和白色念珠菌為主[18]，而隱球菌、毛霉菌和地方性真菌檢出較少但也值得關注。另外，檢出頻數最多的4個病毒為：人類β皰疹病毒5型（17.90%、133/743），人類γ皰疹病毒4型（17.36%、129/743），人類β皰疹病毒7型（16.15%、120/743）和人類α皰疹病毒1型（13.59%、101/743），其中平均序列數最高的是人類α皰疹病毒1型（367.27），其次是人類β皰疹病毒5型（51.43）。即病毒的特征以人類β皰疹病毒5型，人類γ皰疹病毒4型和人類β皰疹病毒7型為主[12-13]，該結果進一步證實，人類β皰疹病毒5型、人類γ皰疹病毒4型、和人類β皰疹病毒7型與肺部感染關系密切[12-13]。同時，也需要關注其他呼吸道病毒，比如人類哺乳動物腺病毒。而由寄生蟲導致的肺部感染病例非常少，沒有明顯的特征；寄生蟲并不單獨作為致病病原體，都是以合并細菌或者病毒感染的形式存在。值得一提的是，非混合感染中，細菌感染的比例最高（35.13%、261/743），而混合感染中，細菌+病毒混合感染的比例最高（22.61%、168/743），其次是細菌+真菌+病毒混合感染（16.02%、119/743），細菌+真菌（10.63%、79/743）和真菌+病毒（4.58%、34/743），而細菌+病毒+寄生蟲以及病毒+寄生蟲的檢出率較低（僅占0.81%和0.13%）；說明mNGS在混合感染的檢測方面有明顯的優勢，因為對于混合感染的檢測是傳統檢測方法難以逾越的障礙。提示臨床醫生，這些特征可以為診斷此類肺部感染患者的病因提供一定的參考依據。
其次，本研究發現不同季節的微生物分布也存在一定的特征。例如，秋冬季檢出頻數最多的是細菌（鮑曼不動桿菌），春夏季檢出頻數最多的是病毒（人類γ皰疹病毒4型），而且有9個物種的平均序列數在兩組的比較中是差異顯著的（P<0.05），表明不同季節的肺部微生物存在不同的特征[19]，提示臨床醫生，不同季節的肺部感染病因可能存在差異，要針對性地治療。
更重要的是，對于未知病原體的檢測也是傳統檢測方法的不足之處。mNGS對于未知或者罕見的病原微生物的快速識別有明顯的優勢，該技術將為感染性疾病的診斷帶來新的突破口[20]，值得進一步推廣和應用。本研究通過mNGS技術，測到了一些不常見的特殊病原體，例如鸚鵡熱衣原體和馬爾尼菲籃狀菌等。鸚鵡熱衣原體肺炎是一種動物源性感染性疾病，具有一定的臨床癥狀、實驗室檢查和影像學特點，采用mNGS技術快速診斷并給予合適的治療能明顯縮短病程并改善預后[10]。據文獻報道，馬爾尼菲籃狀菌感染已經發展成為艾滋病患者常見的機會性感染之一，提示患有艾滋病免疫功能低下的患者，要留意馬爾尼菲籃狀菌的合并感染[11]。提示臨床醫生，在遇到不明原因的肺部感染患者時，不能排除這些非典型的致病病原體，可以考慮采用mNGS技術進行輔助診斷。
但是，因mNGS高度的敏感性，且臨床樣本采集及實驗室測序諸多環節中均存在潛在的污染可能，其結果可能存在一定的假陽性，因此，mNGS的數據解讀是該技術中的一大難點，需要不斷完善相關的標準和共識。另外，mNGS技術在實驗的過程中也有待完善的地方，例如在樣本采集過程中需要嚴格執行無菌化操作，在實驗過程中需要保持實驗室操作流程標準化。只有不斷完善這些要點，才能使mNGS技術在感染性疾病的診斷中發揮更好的作用[21]。同時，臨床醫生也需要以科學嚴謹的態度，采用合理的方式將mNGS應用于臨床實踐。
本研究也存在一定局限性：本研究中納入的數據為mNGS檢測的檢測報告中提示的致病病原體，并不涉及隨訪數據，這些微生物是否全部都被確定為致病病原體，以及根據這些病原體的治療效果，有待進一步確認。我們將在未來的研究中，納入相關的數據，進行更多更深入的研究。
綜上所述, 本研究通過分析840例疑似肺部感染患者的肺泡灌洗液標本中的微生物數據特征，發現肺部感染患者的下呼吸道微生物中，革蘭陰性菌以鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌為主，革蘭陽性菌以肺炎鏈球菌，屎腸球菌和結核分枝桿菌復合群為主；真菌以白色念珠菌，耶氏肺孢子菌和煙曲霉為主；病毒以人類β皰疹病毒5型，人類γ皰疹病毒4型和人類β皰疹病毒7型為主；寄生蟲感染很少，無明顯特征；合并感染以細菌感染和細菌病毒混合感染為主；秋冬季和春夏季的微生物特征不同；另外，存在特殊致病病原體，例如鸚鵡熱衣原體和馬爾尼菲籃狀菌等。這些特征可以為此類肺部感染患者的病因診斷提供一定的參考依據，有助于早期精準地進行臨床干預。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
