引用本文： 劉軍輝, 吳艷秋, 胡雪茹, 申永春, 陳磊. 隱丹參酮對卷煙誘導小鼠氣道炎癥與氧化應激的作用機制研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(3): 189-194. doi: 10.7507/1671-6205.202111056 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，其主要的特征為持續的氣流受限和不斷加重的慢性氣道炎癥反應[1]。慢阻肺具有較高的發病率及死亡率，國內大規模流行病學調查顯示，我國 20 歲及以上成人的慢阻肺患病率為 8.6%，40 歲以上則達 13.7%，全國總患病人數約為 9990 萬[2]。來自中國疾控中心的數據顯示，2017 年中國慢阻肺的死亡率高達 68/100000，位列死亡率第 3 名，是導致死亡的重要原因[3]。慢阻肺的發病機制復雜，吸煙為重要的病因，其病理機制為卷煙激活中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞，釋放炎癥因子，誘導高氧化應激反應，持續的氣道炎癥與氧化應激導致氣道上皮炎癥損傷、結構的改變，氣道黏液高分泌，進一步導致氣道狹窄，氣流受限，參與慢阻肺的發生與發展[4]。圍繞著卷煙誘導的氣道炎癥反應與氧化應激進行研究，有望為慢阻肺等卷煙誘導的氣道炎癥性疾病的治療尋找新的靶點與干預藥物。
近年來的研究發現，傳統中藥丹參的有效成分之一隱丹參酮具有較好的抗炎和抗氧化應激的作用[5]。隱丹參酮可以通過調節 Ca2+ 信號通路以及線粒體氧化應激進而抑制巨噬細胞中 NLPR3 炎性小體的激活，參與炎癥反應的調節[6]。在妊娠期糖尿病小鼠模型中，隱丹參酮可通過抑制核因子（nuclear factor，NF）-κB 信號通路減輕胎盤的炎癥反應與氧化應激[7]。隱丹參酮可以顯著抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的肺組織中巨噬細胞增殖和中性粒細胞浸潤，減少支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukine，IL）-6 和 IL-1β 的分泌，從而對LPS誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用[8]。新近的研究還發現隱丹參酮可以調節 NF-κB 信號通路減輕卵清蛋白誘導的小鼠過敏性氣道炎癥損傷與炎癥因子 IL-4、IL-5、IL-13 等釋放[9]。從上述這些研究結果發現，隱丹參酮對于炎癥性疾病尤其是肺部炎癥性疾病具有潛在的治療價值。但目前為止，其對卷煙誘導的氣道炎癥反應是否也具有作用尚未見報道，因此本研究旨在探索隱丹參酮是否對卷煙誘導的氣道炎癥與氧化應激具有保護作用，并探索其相關的信號通路。
1 材料與方法
1.1 動物模型及分組
6～8 周雄性 BALB/C 小鼠（齡） 24 只，體重 20～24 g（達碩生物技術公司），飼養于四川大學生物治療國家重點實驗室動物飼養中心無特定病原級環境中。將小鼠隨機分為 4 個組，每組 6 只：空白對照組、單純熏煙模型組、熏煙聯合低劑量隱丹參酮組、熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。
1.2 方法
1.2.1 建模方法
熏煙方案：萬寶路牌（紅萬）卷煙（焦油量：12 mg），2.5 h/次，2 次/d，每周連續熏 5 天，間隔 2 天后重復熏煙，標準毒理熏煙箱操作。高、低劑量隱丹參酮干預組每次熏煙前予隱丹參酮 30 mg﹒kg?1﹒d?1 或15mg﹒kg?1﹒d?1 腹腔注射。對照組及單純熏煙模型組小鼠在熏煙前接受腹腔注射生理鹽水。4周后，所有小鼠均以 3% 戊巴比妥鈉麻醉，心臟放血法處死，并收集相應樣本。
1.2.2 BALF 收集及細胞計數
夾閉小鼠左主支氣管，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）灌洗小鼠右側肺 3 次，每次 500 μL，回抽出 BALF，回收率須大于 95%。然后將 BALF 離心 1000 g 5 min，吸出上清存于80 ℃ 冰箱備用。細胞沉淀用 0.2 mL 的 PBS 重懸，混勻后用血細胞計數器對總細胞數進行計數。用離心涂片機以 700 r/min 離心細胞懸液 10 min，置于載玻片上，瑞氏染色后在顯微鏡下進行分類細胞計數。
1.2.3 酶聯免疫吸附測定
對BALF中的 IL-17、單核細胞趨化因子（monocyte chemotactic protein，MCP）-1、TNF-α 用相應的酶聯免疫吸附測定檢測試劑盒，按照說明書進行測定。試劑盒的檢測下限分別為 IL-17 7 pg/mL，MCP-1 2 pg/mL，TNF-α 7 pg/mL。
1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應
提取肺組織 RNA，實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測肺組織中的黏蛋白 Muc5ac 的mRNA 表達水平，以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，采用比較閾值法進行相對定量分析。計算方法：目的基因的相對表達量=2－△△Ct，Ct 值是熱循環儀中熒光達到閾值循環數，△Ct=目的基因 Ct內參基因 Ct，△△Ct=實驗組△Ct對照組△Ct。其中，Muc5ac正向引物5'-CAGCATCATCAACAGCGAAAC-3'，反向引物5'-TCACAGGCACAGGCGTCA-3'；β-actin正向引物5'-CAGGTCATCACTATTGGCAAC-3'，反向引物5'-TCTTTACGGATGTCAACGTCA-3'。
1.2.5 蘇木精-伊紅染色
左側未經灌洗的肺組織以 10% 甲醛固定，制成 5 μm 厚的石蠟切片，常規進行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡下觀察氣道及支氣管周圍肺組織的變化。
1.2.6 免疫組織化學檢測
經固定、石蠟包埋、切片的肺組織，用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法檢測氣道Muc5ac 的表達。用 PBS 代替一抗作陰性對照。陽性細胞呈棕黃色。高倍鏡下 Muc5ac 蛋白為胞漿顯色。
1.2.7 氧化應激檢測
取右側液氮保存的肺組織，研磨后用 PBS 溶解制成 10% 勻漿，4 ℃ 2000 g 離心 10 min 后取上清待檢。嚴格按照產品說明書檢測肺組織勻漿中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平。
1.2.8 蛋白印跡法檢測
取凍存于－80 ℃ 的左上肺組織，提取肺組織總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，用脫脂奶粉進行封閉，1 h 后分別加入磷酸化的兔抗鼠單克隆抗體凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor，LOX）-1、NF-κB p65、磷酸化 p65（phosphorylated p65，p-p65）、NF-κb抑制蛋白-α（NF-κB inhibitor α，IκB-α）、β-actin（1∶1000），置于 4 ℃ 孵箱中孵育過夜，洗膜，并加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10000），顯影，使用 Quantity One software（Bio-Rad）圖像分析軟件測定目的條帶及內參的積分光密度值，以兩者的比值表示蛋白的相對含量，進行統計分析。
1.3 統計學方法
所有數據均使用均數±標準差（
±s）的形式表示。采用方差分析中 Student-Newman-Keuls 法（SNK 法）進行兩兩均值的比較。P<0.05（雙側檢驗）為差異有統計學意義。所有數據均采用 SPSS 19.0 軟件進行統計學分析（IBM，Chicago，IL，USA），使用 Graphpad Prism 5.0（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）進行所有柱狀圖的構建。
2 結果
2.1 隱丹參酮減輕卷煙誘導的氣道炎癥損傷
HE 染色發現經過熏煙的小鼠發生氣道上皮增厚，肺泡腔破壞并充填部分黏液和細胞碎片，以及氣道周圍炎性細胞的浸潤等改變。不同劑量的隱丹參酮均可以使卷煙誘導的氣道炎癥損傷減弱。結果見圖 1。
圖1
隱丹參酮對卷煙誘導的小鼠肺組織中炎癥反應的作用（HE）
a. 空白對照組；b. 單純熏煙模型組；c. 熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；d. 熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。空白對照組大鼠肺組織結構清楚。經過熏煙的小鼠發生氣道上皮增厚，肺泡腔破壞并充填部分黏液和細胞碎片，以及氣道周圍炎性細胞的浸潤等改變。不同劑量的隱丹參酮均可以使卷煙誘導的氣道炎癥損傷減弱。標尺：50 µm。
2.2 隱丹參酮減輕卷煙誘導氣道炎癥細胞激活與炎癥因子釋放
熏煙可以使小鼠 BALF 中的總細胞、巨噬細胞及中性粒細胞均增加。與熏煙組相比，給予隱丹參酮可以減輕的 BALF 中細胞的浸潤，并且高劑量的隱丹參酮效果更加顯著。結果見圖 2。經過熏煙的小鼠 BALF 中 IL-17、MCP-1、TNF-α 表達水平明顯增加，使用隱丹參酮后，IL-17、MCP-1、TNF-α 的濃度水平可明顯下降，并且使用高劑量隱丹參酮小鼠BALF 中炎癥因子的下降更為明顯。結果見圖 3。
圖2
隱丹參酮減輕卷煙誘導炎性細胞激活
a. 細胞總數；b. 巨噬細胞；c. 中性粒細胞。1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
圖3
隱丹參酮降低卷煙誘導的小鼠 BALF 中的炎癥因子釋放
a. IL-17；b. MCP-1；c. TNF-α。1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
2.3 隱丹參酮減輕卷煙誘導的氣道黏液高分泌
實時熒光定量聚合酶鏈反應結果顯示，熏煙小鼠肺組織中 Muc5ac 的 mRNA 表達較正常對照組明顯增高，而隱丹參酮可以使熏煙的這種作用減弱，并且在高劑量組效果更加明顯。結果見圖4。免疫組織化學染色發現，經過熏煙 4 周后，小鼠肺組織中的 Muc5ac 黏蛋白染色明顯增加，給予隱丹參酮可以減輕卷煙誘導的 Muc5ac 黏蛋白的產生。結果見圖 5。
圖4
隱丹參酮對小鼠肺組織中Muc5ac的mRNA表達的影響
1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
圖5
隱丹參酮對卷煙誘導的肺組織 Muc5ac 蛋白表達的影響（免疫組織化學）
a. 空白對照組；b. 單純熏煙模型組；c. 熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；d. 熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。空白對照組大鼠肺組織中 Muc5ac 表達少。經過熏煙 4 周后，小鼠肺組織中 Muc5ac 黏蛋白染色明顯增加，給予隱丹參酮可以減輕卷煙誘導的 Muc5ac 黏蛋白的產生。標尺：50 µm。
2.4 隱丹參酮減輕卷煙誘導的氧化應激狀態
熏煙可以使小鼠肺組織中 MDA 的表達明顯增高，SOD 的活力明顯下降，隱丹參酮干預可以降低卷煙誘導的 MDA 產生，恢復卷煙導致的 SOD 的活力下降，并且高劑量的隱丹參酮具有更加顯著的效果。結果見圖 6。
圖6
隱丹參酮對卷煙處理后肺組織勻漿的 MDA、SOD 變化的影響
a. MDA; b. SOD。1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
2.5 隱丹參酮增加可以使肺組織中 LOX-1 的表達及 NF-κB 的磷酸化降低
蛋白印跡法分析顯示熏煙后小鼠肺組織中 LOX-1 及 p-p65 蛋白的表達明顯增加，IκB-α 表達明顯下調，加用隱丹參酮干預后下調 LOX-1 及 p-p65，上調 IκB-α 的表達。結果見圖 7。
圖7
隱丹參酮對肺組織中 LOX-1 及 NF-κB 信號通路的影響
a. 蛋白印跡法檢測像；b. 蛋白質半定量分析示意圖。1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
3 討論
在本研究中，我們通過熏煙建立小鼠氣道炎癥模型，觀察到卷煙可以使小鼠氣道炎癥細胞浸潤增加，氧化應激增加，氣道黏液高分泌。使用隱丹參酮預處理可以減輕卷煙的致炎、致氧化應激及致黏液高分泌效應，而且這種作用存在一定的量效關系，上述保護效應可能是通過調控 LOX-1 與 NF-κB 信號通路實現的，提示隱丹參酮有望成為治療卷煙誘導的氣道炎癥性疾病如慢阻肺的潛在藥物。
卷煙是導致慢阻肺的最重要的危險因素，可以導致氣道炎癥的發生、氧化應激反應與氣道黏液高分泌[4]。本研究的結果顯示卷煙可導致小鼠氣道炎癥性損傷，使小鼠發生氣道上皮增厚，肺泡腔破壞并充填部分黏液和細胞碎片，以及氣道周圍炎性細胞的浸潤，促進 BALF 中的炎癥因子釋放，氣道黏液高分泌與氧化應激狀態，進一步證實了卷煙導致了氣道炎癥與氧化應激失衡，與慢阻肺的病理學機制相符。丹參是一種我國常用的傳統中藥，隱丹參酮是丹參的脂溶性提取物之一，藥理學研究發現隱丹參酮具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[5, 10]。那么隱丹參酮是否具有對抗卷煙誘導的氣道炎癥及氧化應激具有治療作用呢，本研究發現隱丹參酮可以減輕卷煙導致的氣道上皮增厚，肺泡腔破壞以及氣道周圍炎性細胞的浸潤，劑量依賴性下調卷煙誘導的小鼠 BALF 中的 IL-17、MCP-1、TNF-α 的分泌及炎性細胞激活，這些炎癥因子與慢阻肺的發生、發展密切相關[11]，證實隱丹參酮對抗卷煙的炎癥反應可能通過減少氣道炎癥細胞的浸潤及氣道炎癥因子的分泌來實現。本研究也再次證實了隱丹參酮具有抗氧化應激的作用，隱丹參酮的預處理可以減輕卷煙導致的肺組織 MDA 的增加和 SOD 的降低。氣道黏液高分泌與慢阻肺密切相關[12]，本研究發現隱丹參酮可以使小鼠肺部的 Muc5ac 的 mRNA 及蛋白的表達相對于單獨熏煙時明顯下調，證實隱丹參酮對于卷煙導致的小鼠氣道黏液高分泌也具有一定的改善作用。上述發現證實隱丹參酮對抗的卷煙導致的小鼠氣道炎癥損傷、氧化應激與氣道黏液高分泌，對卷煙誘導的氣道炎癥性疾病具備潛在的治療價值。
在此基礎上，我們還對隱丹參酮的作用機制進行了探索。既往研究發現，卷煙的暴露可以引起嚴重的炎癥反應，導致 NF-κB 依賴的炎癥因子的分泌及中性粒細胞的肺組織募集，介導炎癥反應與氧化應激反應，NF-κB在 卷煙誘導氣道炎癥、慢性阻塞性肺疾病中發揮著重要作用[13]。在 LPS 誘導的小鼠急性肺損傷模型中也證實了隱丹參酮可以通過增加 IκB-α、抑制 p-p65 和 Toll 樣受體 4 的表達，減少 LPS 導致的肺組織中巨噬細胞增殖和中性粒細胞浸潤，顯著抑制髓過氧化物酶的活性，減少 BALF 中的 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的濃度，從而對 LPS 誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用[8]。提示隱丹參酮的藥理作用與 NF-κB 信號通路的干預有著不可忽視的聯系。本研究給予隱丹參酮干預的熏煙小鼠 IκB-α 的減低及 p-p65 的增加均受到抑制。這再次說明隱丹參酮可能通過下調 NF-κB 信號通路來發揮對抗卷煙導致的氣道炎癥及氧化應激的作用。
近年來的研究發現，LOX-1 在急性肺損傷、糖尿病性肺纖維化等肺部性疾病中發揮著重要作用，阻斷 LOX-1 能夠顯著減輕 LPS 誘導的小鼠肺部炎癥與損傷[14-15]。基因敲除 LOX-1 能降低膿毒癥相關的肺部炎癥與損傷，改善宿主免疫功能[16]，氯沙坦也可能通過下調 LOX-1 的表達減輕 LPS 誘導的大鼠急性肺損傷模型中的炎癥反應與氧化應激[17]，LOX-1 可能是調控炎癥反應的重要靶點。既往的研究 LOX-1 與 NF-κB 通路密切相關，抑制 LOX-1 信號通路可顯著抑制NF-κB通路的激活[18]，這兩者可能存在著信號交聯，放大炎癥反應。本研究發現 LOX-1 在熏煙小鼠的肺組織中的表達明顯增高，隱丹參酮干預可以使卷煙誘導的 LOX-1 的增加水平減低，提示隱丹參酮對抗卷煙導致的氣道炎癥損傷可能與抑制肺組織中的 LOX-1 的表達有關，LOX-1 也有望成為干預卷煙誘導氣道炎癥的潛在靶點。但是目前在卷煙誘導環境下，LOX-1 與 NF-κB 通路如何相互作用，隱丹參酮還參與了哪些調控機制，還需要進一步的研究來證實。
本研究尚存在不足之處：動物數量偏少；藥物是在熏煙前給予，所以在某種程度上是屬于預防性的作用，而非治療性作用；僅有動物研究，缺乏體外研究的證實。既往的研究表明更高劑量的 100 mg·kg?1·d?1 的隱丹參酮干預對小鼠而言是相對安全的[19]，所以本研究未再設置單純的藥物對照組。在未來的工作還需要有高質量的研究設計來證明本研究的發現。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，其主要的特征為持續的氣流受限和不斷加重的慢性氣道炎癥反應[1]。慢阻肺具有較高的發病率及死亡率，國內大規模流行病學調查顯示，我國 20 歲及以上成人的慢阻肺患病率為 8.6%，40 歲以上則達 13.7%，全國總患病人數約為 9990 萬[2]。來自中國疾控中心的數據顯示，2017 年中國慢阻肺的死亡率高達 68/100000，位列死亡率第 3 名，是導致死亡的重要原因[3]。慢阻肺的發病機制復雜，吸煙為重要的病因，其病理機制為卷煙激活中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞，釋放炎癥因子，誘導高氧化應激反應，持續的氣道炎癥與氧化應激導致氣道上皮炎癥損傷、結構的改變，氣道黏液高分泌，進一步導致氣道狹窄，氣流受限，參與慢阻肺的發生與發展[4]。圍繞著卷煙誘導的氣道炎癥反應與氧化應激進行研究，有望為慢阻肺等卷煙誘導的氣道炎癥性疾病的治療尋找新的靶點與干預藥物。
近年來的研究發現，傳統中藥丹參的有效成分之一隱丹參酮具有較好的抗炎和抗氧化應激的作用[5]。隱丹參酮可以通過調節 Ca2+ 信號通路以及線粒體氧化應激進而抑制巨噬細胞中 NLPR3 炎性小體的激活，參與炎癥反應的調節[6]。在妊娠期糖尿病小鼠模型中，隱丹參酮可通過抑制核因子（nuclear factor，NF）-κB 信號通路減輕胎盤的炎癥反應與氧化應激[7]。隱丹參酮可以顯著抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的肺組織中巨噬細胞增殖和中性粒細胞浸潤，減少支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukine，IL）-6 和 IL-1β 的分泌，從而對LPS誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用[8]。新近的研究還發現隱丹參酮可以調節 NF-κB 信號通路減輕卵清蛋白誘導的小鼠過敏性氣道炎癥損傷與炎癥因子 IL-4、IL-5、IL-13 等釋放[9]。從上述這些研究結果發現，隱丹參酮對于炎癥性疾病尤其是肺部炎癥性疾病具有潛在的治療價值。但目前為止，其對卷煙誘導的氣道炎癥反應是否也具有作用尚未見報道，因此本研究旨在探索隱丹參酮是否對卷煙誘導的氣道炎癥與氧化應激具有保護作用，并探索其相關的信號通路。
1 材料與方法
1.1 動物模型及分組
6～8 周雄性 BALB/C 小鼠（齡） 24 只，體重 20～24 g（達碩生物技術公司），飼養于四川大學生物治療國家重點實驗室動物飼養中心無特定病原級環境中。將小鼠隨機分為 4 個組，每組 6 只：空白對照組、單純熏煙模型組、熏煙聯合低劑量隱丹參酮組、熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。
1.2 方法
1.2.1 建模方法
熏煙方案：萬寶路牌（紅萬）卷煙（焦油量：12 mg），2.5 h/次，2 次/d，每周連續熏 5 天，間隔 2 天后重復熏煙，標準毒理熏煙箱操作。高、低劑量隱丹參酮干預組每次熏煙前予隱丹參酮 30 mg﹒kg?1﹒d?1 或15mg﹒kg?1﹒d?1 腹腔注射。對照組及單純熏煙模型組小鼠在熏煙前接受腹腔注射生理鹽水。4周后，所有小鼠均以 3% 戊巴比妥鈉麻醉，心臟放血法處死，并收集相應樣本。
1.2.2 BALF 收集及細胞計數
夾閉小鼠左主支氣管，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）灌洗小鼠右側肺 3 次，每次 500 μL，回抽出 BALF，回收率須大于 95%。然后將 BALF 離心 1000 g 5 min，吸出上清存于80 ℃ 冰箱備用。細胞沉淀用 0.2 mL 的 PBS 重懸，混勻后用血細胞計數器對總細胞數進行計數。用離心涂片機以 700 r/min 離心細胞懸液 10 min，置于載玻片上，瑞氏染色后在顯微鏡下進行分類細胞計數。
1.2.3 酶聯免疫吸附測定
對BALF中的 IL-17、單核細胞趨化因子（monocyte chemotactic protein，MCP）-1、TNF-α 用相應的酶聯免疫吸附測定檢測試劑盒，按照說明書進行測定。試劑盒的檢測下限分別為 IL-17 7 pg/mL，MCP-1 2 pg/mL，TNF-α 7 pg/mL。
1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應
提取肺組織 RNA，實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測肺組織中的黏蛋白 Muc5ac 的mRNA 表達水平，以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，采用比較閾值法進行相對定量分析。計算方法：目的基因的相對表達量=2－△△Ct，Ct 值是熱循環儀中熒光達到閾值循環數，△Ct=目的基因 Ct內參基因 Ct，△△Ct=實驗組△Ct對照組△Ct。其中，Muc5ac正向引物5'-CAGCATCATCAACAGCGAAAC-3'，反向引物5'-TCACAGGCACAGGCGTCA-3'；β-actin正向引物5'-CAGGTCATCACTATTGGCAAC-3'，反向引物5'-TCTTTACGGATGTCAACGTCA-3'。
1.2.5 蘇木精-伊紅染色
左側未經灌洗的肺組織以 10% 甲醛固定，制成 5 μm 厚的石蠟切片，常規進行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡下觀察氣道及支氣管周圍肺組織的變化。
1.2.6 免疫組織化學檢測
經固定、石蠟包埋、切片的肺組織，用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法檢測氣道Muc5ac 的表達。用 PBS 代替一抗作陰性對照。陽性細胞呈棕黃色。高倍鏡下 Muc5ac 蛋白為胞漿顯色。
1.2.7 氧化應激檢測
取右側液氮保存的肺組織，研磨后用 PBS 溶解制成 10% 勻漿，4 ℃ 2000 g 離心 10 min 后取上清待檢。嚴格按照產品說明書檢測肺組織勻漿中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平。
1.2.8 蛋白印跡法檢測
取凍存于－80 ℃ 的左上肺組織，提取肺組織總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，用脫脂奶粉進行封閉，1 h 后分別加入磷酸化的兔抗鼠單克隆抗體凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor，LOX）-1、NF-κB p65、磷酸化 p65（phosphorylated p65，p-p65）、NF-κb抑制蛋白-α（NF-κB inhibitor α，IκB-α）、β-actin（1∶1000），置于 4 ℃ 孵箱中孵育過夜，洗膜，并加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10000），顯影，使用 Quantity One software（Bio-Rad）圖像分析軟件測定目的條帶及內參的積分光密度值，以兩者的比值表示蛋白的相對含量，進行統計分析。
1.3 統計學方法
所有數據均使用均數±標準差（±s）的形式表示。采用方差分析中 Student-Newman-Keuls 法（SNK 法）進行兩兩均值的比較。P<0.05（雙側檢驗）為差異有統計學意義。所有數據均采用 SPSS 19.0 軟件進行統計學分析（IBM，Chicago，IL，USA），使用 Graphpad Prism 5.0（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）進行所有柱狀圖的構建。
2 結果
2.1 隱丹參酮減輕卷煙誘導的氣道炎癥損傷
HE 染色發現經過熏煙的小鼠發生氣道上皮增厚，肺泡腔破壞并充填部分黏液和細胞碎片，以及氣道周圍炎性細胞的浸潤等改變。不同劑量的隱丹參酮均可以使卷煙誘導的氣道炎癥損傷減弱。結果見圖 1。
圖1
隱丹參酮對卷煙誘導的小鼠肺組織中炎癥反應的作用（HE）
a. 空白對照組；b. 單純熏煙模型組；c. 熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；d. 熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。空白對照組大鼠肺組織結構清楚。經過熏煙的小鼠發生氣道上皮增厚，肺泡腔破壞并充填部分黏液和細胞碎片，以及氣道周圍炎性細胞的浸潤等改變。不同劑量的隱丹參酮均可以使卷煙誘導的氣道炎癥損傷減弱。標尺：50 µm。
2.2 隱丹參酮減輕卷煙誘導氣道炎癥細胞激活與炎癥因子釋放
熏煙可以使小鼠 BALF 中的總細胞、巨噬細胞及中性粒細胞均增加。與熏煙組相比，給予隱丹參酮可以減輕的 BALF 中細胞的浸潤，并且高劑量的隱丹參酮效果更加顯著。結果見圖 2。經過熏煙的小鼠 BALF 中 IL-17、MCP-1、TNF-α 表達水平明顯增加，使用隱丹參酮后，IL-17、MCP-1、TNF-α 的濃度水平可明顯下降，并且使用高劑量隱丹參酮小鼠BALF 中炎癥因子的下降更為明顯。結果見圖 3。
圖2
隱丹參酮減輕卷煙誘導炎性細胞激活
a. 細胞總數；b. 巨噬細胞；c. 中性粒細胞。1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
圖3
隱丹參酮降低卷煙誘導的小鼠 BALF 中的炎癥因子釋放
a. IL-17；b. MCP-1；c. TNF-α。1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
2.3 隱丹參酮減輕卷煙誘導的氣道黏液高分泌
實時熒光定量聚合酶鏈反應結果顯示，熏煙小鼠肺組織中 Muc5ac 的 mRNA 表達較正常對照組明顯增高，而隱丹參酮可以使熏煙的這種作用減弱，并且在高劑量組效果更加明顯。結果見圖4。免疫組織化學染色發現，經過熏煙 4 周后，小鼠肺組織中的 Muc5ac 黏蛋白染色明顯增加，給予隱丹參酮可以減輕卷煙誘導的 Muc5ac 黏蛋白的產生。結果見圖 5。
圖4
隱丹參酮對小鼠肺組織中Muc5ac的mRNA表達的影響
1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
圖5
隱丹參酮對卷煙誘導的肺組織 Muc5ac 蛋白表達的影響（免疫組織化學）
a. 空白對照組；b. 單純熏煙模型組；c. 熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；d. 熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。空白對照組大鼠肺組織中 Muc5ac 表達少。經過熏煙 4 周后，小鼠肺組織中 Muc5ac 黏蛋白染色明顯增加，給予隱丹參酮可以減輕卷煙誘導的 Muc5ac 黏蛋白的產生。標尺：50 µm。
2.4 隱丹參酮減輕卷煙誘導的氧化應激狀態
熏煙可以使小鼠肺組織中 MDA 的表達明顯增高，SOD 的活力明顯下降，隱丹參酮干預可以降低卷煙誘導的 MDA 產生，恢復卷煙導致的 SOD 的活力下降，并且高劑量的隱丹參酮具有更加顯著的效果。結果見圖 6。
圖6
隱丹參酮對卷煙處理后肺組織勻漿的 MDA、SOD 變化的影響
a. MDA; b. SOD。1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
2.5 隱丹參酮增加可以使肺組織中 LOX-1 的表達及 NF-κB 的磷酸化降低
蛋白印跡法分析顯示熏煙后小鼠肺組織中 LOX-1 及 p-p65 蛋白的表達明顯增加，IκB-α 表達明顯下調，加用隱丹參酮干預后下調 LOX-1 及 p-p65，上調 IκB-α 的表達。結果見圖 7。
圖7
隱丹參酮對肺組織中 LOX-1 及 NF-κB 信號通路的影響
a. 蛋白印跡法檢測像；b. 蛋白質半定量分析示意圖。1：空白對照組；2：單純熏煙模型組；3：熏煙聯合低劑量隱丹參酮組；4：熏煙聯合高劑量隱丹參酮組。*：相對于空白對照組，
3 討論
在本研究中，我們通過熏煙建立小鼠氣道炎癥模型，觀察到卷煙可以使小鼠氣道炎癥細胞浸潤增加，氧化應激增加，氣道黏液高分泌。使用隱丹參酮預處理可以減輕卷煙的致炎、致氧化應激及致黏液高分泌效應，而且這種作用存在一定的量效關系，上述保護效應可能是通過調控 LOX-1 與 NF-κB 信號通路實現的，提示隱丹參酮有望成為治療卷煙誘導的氣道炎癥性疾病如慢阻肺的潛在藥物。
卷煙是導致慢阻肺的最重要的危險因素，可以導致氣道炎癥的發生、氧化應激反應與氣道黏液高分泌[4]。本研究的結果顯示卷煙可導致小鼠氣道炎癥性損傷，使小鼠發生氣道上皮增厚，肺泡腔破壞并充填部分黏液和細胞碎片，以及氣道周圍炎性細胞的浸潤，促進 BALF 中的炎癥因子釋放，氣道黏液高分泌與氧化應激狀態，進一步證實了卷煙導致了氣道炎癥與氧化應激失衡，與慢阻肺的病理學機制相符。丹參是一種我國常用的傳統中藥，隱丹參酮是丹參的脂溶性提取物之一，藥理學研究發現隱丹參酮具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[5, 10]。那么隱丹參酮是否具有對抗卷煙誘導的氣道炎癥及氧化應激具有治療作用呢，本研究發現隱丹參酮可以減輕卷煙導致的氣道上皮增厚，肺泡腔破壞以及氣道周圍炎性細胞的浸潤，劑量依賴性下調卷煙誘導的小鼠 BALF 中的 IL-17、MCP-1、TNF-α 的分泌及炎性細胞激活，這些炎癥因子與慢阻肺的發生、發展密切相關[11]，證實隱丹參酮對抗卷煙的炎癥反應可能通過減少氣道炎癥細胞的浸潤及氣道炎癥因子的分泌來實現。本研究也再次證實了隱丹參酮具有抗氧化應激的作用，隱丹參酮的預處理可以減輕卷煙導致的肺組織 MDA 的增加和 SOD 的降低。氣道黏液高分泌與慢阻肺密切相關[12]，本研究發現隱丹參酮可以使小鼠肺部的 Muc5ac 的 mRNA 及蛋白的表達相對于單獨熏煙時明顯下調，證實隱丹參酮對于卷煙導致的小鼠氣道黏液高分泌也具有一定的改善作用。上述發現證實隱丹參酮對抗的卷煙導致的小鼠氣道炎癥損傷、氧化應激與氣道黏液高分泌，對卷煙誘導的氣道炎癥性疾病具備潛在的治療價值。
在此基礎上，我們還對隱丹參酮的作用機制進行了探索。既往研究發現，卷煙的暴露可以引起嚴重的炎癥反應，導致 NF-κB 依賴的炎癥因子的分泌及中性粒細胞的肺組織募集，介導炎癥反應與氧化應激反應，NF-κB在 卷煙誘導氣道炎癥、慢性阻塞性肺疾病中發揮著重要作用[13]。在 LPS 誘導的小鼠急性肺損傷模型中也證實了隱丹參酮可以通過增加 IκB-α、抑制 p-p65 和 Toll 樣受體 4 的表達，減少 LPS 導致的肺組織中巨噬細胞增殖和中性粒細胞浸潤，顯著抑制髓過氧化物酶的活性，減少 BALF 中的 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的濃度，從而對 LPS 誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用[8]。提示隱丹參酮的藥理作用與 NF-κB 信號通路的干預有著不可忽視的聯系。本研究給予隱丹參酮干預的熏煙小鼠 IκB-α 的減低及 p-p65 的增加均受到抑制。這再次說明隱丹參酮可能通過下調 NF-κB 信號通路來發揮對抗卷煙導致的氣道炎癥及氧化應激的作用。
近年來的研究發現，LOX-1 在急性肺損傷、糖尿病性肺纖維化等肺部性疾病中發揮著重要作用，阻斷 LOX-1 能夠顯著減輕 LPS 誘導的小鼠肺部炎癥與損傷[14-15]。基因敲除 LOX-1 能降低膿毒癥相關的肺部炎癥與損傷，改善宿主免疫功能[16]，氯沙坦也可能通過下調 LOX-1 的表達減輕 LPS 誘導的大鼠急性肺損傷模型中的炎癥反應與氧化應激[17]，LOX-1 可能是調控炎癥反應的重要靶點。既往的研究 LOX-1 與 NF-κB 通路密切相關，抑制 LOX-1 信號通路可顯著抑制NF-κB通路的激活[18]，這兩者可能存在著信號交聯，放大炎癥反應。本研究發現 LOX-1 在熏煙小鼠的肺組織中的表達明顯增高，隱丹參酮干預可以使卷煙誘導的 LOX-1 的增加水平減低，提示隱丹參酮對抗卷煙導致的氣道炎癥損傷可能與抑制肺組織中的 LOX-1 的表達有關，LOX-1 也有望成為干預卷煙誘導氣道炎癥的潛在靶點。但是目前在卷煙誘導環境下，LOX-1 與 NF-κB 通路如何相互作用，隱丹參酮還參與了哪些調控機制，還需要進一步的研究來證實。
本研究尚存在不足之處：動物數量偏少；藥物是在熏煙前給予，所以在某種程度上是屬于預防性的作用，而非治療性作用；僅有動物研究，缺乏體外研究的證實。既往的研究表明更高劑量的 100 mg·kg?1·d?1 的隱丹參酮干預對小鼠而言是相對安全的[19]，所以本研究未再設置單純的藥物對照組。在未來的工作還需要有高質量的研究設計來證明本研究的發現。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
