引用本文： 范傲, 黃鐘, 段宇清, 盧獻靈. 慢性阻塞性肺疾病患者血漿中性粒細胞胞外誘捕網和白細胞介素-8及白細胞介素-33的表達水平及其臨床意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(2): 84-89. doi: 10.7507/1671-6205.202110009 復制
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD，簡稱慢阻肺）全球倡議委員會將慢阻肺定義為一種常見的、可預防的和可治療的疾病[1]，持續的氣流限制、肺氣腫性肺泡壁破壞、持續的中性粒細胞浸潤增加和反復感染是慢阻肺的主要顯著特征[2]。中性粒細胞作為慢阻肺發病過程中肺部浸潤的關鍵先天免疫細胞之一[3]，其具體機制尚有待闡明。中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒細胞受到刺激活化后釋放到胞外的一種網狀結構，主要由雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）和組蛋白組成，此外還結合有髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil，NE）、組織因子等中性粒細胞的顆粒蛋白[4]。NETs特有的網狀結構及其攜帶的蛋白成分參與了多種疾病的病理過程，包括自身免疫性疾病、感染、膿毒癥、肺損傷、癌癥轉移、血栓形成和纖維化等[5-7]，慢阻肺患者痰液和氣道中NETs增多并且與癥狀和肺功能的嚴重程度相關[8-10]，提示NETs可能在慢阻肺的病理機制中發揮重要作用，但其機制還未被闡明。白細胞介素（interleukin，IL）-8是促進NETs形成的主要細胞因子，而IL-33作為一種新近發現的促炎細胞因子，已被發現可以促進支氣管內皮細胞和外周血單個核細胞IL-8的分泌[11]，但它是否參與NETs形成尚屬未知。本試驗通過研究血漿中NETs、IL-8和IL-33在不同階段慢阻肺患者和健康人之間的表達水平，以探討NETs在慢阻肺發病機制中的作用及臨床意義。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇2020年10月至2021年5月于石河子大學醫學院第一附屬醫院住院的慢阻肺急性加重期患者40例納入急性加重期組；急性加重期患者經抗感染、祛痰止咳、解痙等對癥治療后，咳嗽、咳痰、氣喘等癥狀穩定或癥狀輕微，病情基本恢復到急性加重前的狀態，判定為進入穩定期，納入慢阻肺穩定期組；同期于石河子大學醫學院第一附屬醫院體檢科選取40例健康體檢者納入對照組。慢阻肺診斷標準參考中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組于2013年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》。排除標準：患者有支氣管哮喘、矽肺、肺結核、間質性肺疾病等慢性疾病；合并冠心病、動脈粥樣硬化、2型糖尿病、肝腎疾病、腫瘤及自身免疫性疾病的患者；納入前使用過糖皮質激素、抗生素及免疫抑制劑的急性加重期慢阻肺患者；不能配合完成肺功能者。對照組為正常健康人群，依據隨機原則與病例組在性別、年齡上進行匹配。該研究通過石河子大學醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（KJ2020-133-01），所有入選對象均簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 一般臨床資料
收集性別、年齡、吸煙史等資料，慢阻肺穩定期組患者和對照組進行肺功能檢查，慢阻肺患者行慢阻肺評估測試（COPD assessment test，CAT）評分。
1.2.2 肺功能檢測
肺功能檢測由肺功能室專科醫生按照標準肺功能檢查程序完成。收集每位研究對象第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity，FEV1/FVC）和第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（forced expiratory volume in the first second predicted，FEV1%pred）。
1.2.3 血漿中dsDNA、瓜氨酸組蛋白3、MPO-DNA及IL-33、IL-8的檢測
采集各組患者清晨空腹狀態下外周靜脈血5 mL，置于有肝素抗凝劑的試管內，3000 r/min離心5 min，分離血漿，置于–80 ℃保存待測；使用酶聯免疫吸附法檢測血漿中瓜氨酸組蛋白3（citrulline histone 3，CitH3）、MPO-DNA、IL-33、IL-8水平，采用PicoGreen熒光染料定量分析血漿中dsDNA水平；CitH3試劑盒購于美國Cayman Chemical公司；MPO及凋亡檢測試劑盒購于美國Abcam公司、瑞士Roche公司；IL-8試劑盒購于美國Abcam公司；IL-33試劑盒購于美國R＆D公司；dsDNA試劑盒Quant-iT? PicoGreen ? reagent購于美國Invitrogen公司。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0統計軟件。呈正態分布的計量資料用均數±標準差（
±s）表示，偏態分布的計量資料用中位數和四分位數表示，計數資料用頻數和百分數表示。計數資料的組間比較采用χ2檢驗。符合正態分布的計量資料采用t檢驗，配對的兩組比較采用配對t檢驗，獨立的兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。偏態分布的計量資料用秩和檢驗。相關性分析，服從正態分布的計量資料用Pearson法，非正態分布計量資料和計數資料用Spearman法。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料比較
慢阻肺組與對照組的性別、年齡、體重指數（body mass index, BMI）差異無統計學意義（P>0.05），慢阻肺組FEV1%pred和FEV1/FVC顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。
表1
慢阻肺組與對照組的基本資料比較［（
）/例（%）］
2.2 急性加重期組、穩定期組與和對照組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8的比較
急性加重期組的dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8水平顯著高于穩定期組（P<0.05）和對照組（P<0.05）。穩定期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33的水平顯著高于對照組（P<0.05）。結果見圖1。
圖1
急性加重期組、穩定期組與和對照組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8水平的比較
1 對照組；2 急性加重期組；3 穩定期組。*與對照組比較，
2.3 急性加重期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8與臨床指標的相關性分析
急性加重期組CitH3、MPO-DNA、IL-33和IL-8水平均與CAT評分呈正相關（r=0.335，P=0.035；r=0.423，P=0.006；r=0.411，P=0.008；r=0.396，P=0.011）。結果見表2。
表2
急性加重期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8與臨床指標的相關性分析
2.4 穩定期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8與臨床指標的相關性分析
穩定期組MPO-DNA和IL-8水平均與CAT評分呈正相關（r=0.351，P=0.026；r=0.375，P=0.017）；穩定期組MPO-DNA與FEV1%pred呈負相關（r=?0.411，P=0.008）；穩定期期組CitH3與FEV1/FVC呈負相關（r=?0.395，P=0.012）。結果見表3。
表3
慢阻肺穩定期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8與臨床指標的相關性分析
2.5 慢阻肺患者IL-8與NETs的相關性分析
急性加重期組IL-8和dsDNA、CitH3水平呈正相關，與MPO-DNA水平無明顯相關性；穩定期組IL-8和dsDNA水平呈正相關，與CitH3和MPO-DNA無明顯相關性。結果見表4。
表4
慢阻肺患者IL-8與NETs的相關性分析
2.6 慢阻肺患者IL-33與IL-8和NETs的相關性分析
急性加重期組IL-33和IL-8、dsDNA、CitH3、MPO-DNA水平呈正相關；穩定期組中IL-33和IL-8、dsDNA、CitH3、MPO-DNA水平無明顯相關性。結果見表5。
表5
慢阻肺患者IL-33與IL-8和NETs的相關性分析
3 討論
慢阻肺是慢性氣道炎癥疾病中最常見但預后較差的類型，然而其確切的發病機制尚不清楚。吸煙是導致慢阻肺疾病進展的關鍵因素之一，香煙煙霧提取物可導致中性粒細胞繼發性顆粒脫顆粒，從而導致氣道炎癥和組織降解，并可以對中性粒細胞趨化性、中性粒細胞胞外誘捕網的形成和炎癥反應相關基因表達進行修飾[12]。眾所周知，中性粒細胞是連接先天免疫和適應性免疫的免疫防御屏障的重要組成部分之一，可通過趨化、吞噬、脫顆粒作用，消除無菌炎癥。近期研究發現，中性粒細胞可通過釋放由DNA骨架、組蛋白、髓過氧化物酶、組織因子等顆粒蛋白成分組成的網狀結構即NETs來參與殺死病原體、清除細胞碎片，參與機體自身免疫應答[13]。
研究發現，在慢阻肺患者外周血和痰樣本中NETs的形成增加，且在嚴重的慢阻肺患者中更為豐富，并與頻繁的病情惡化和微生物群多樣性減少相關[9]。此外，另一項研究也發現，與健康對照組相比，穩定期慢阻患者的外周血中NETs的產生增加[14]。本研究檢測了慢阻肺患者血漿中NETs的主要成分dsDNA、CitH3、MPO-DNA的水平，結果顯示慢阻肺患者急性加重期組和穩定期組的dsDNA、CitH3、MPO-DNA水平明顯高于健康對照組，且急性加重期組的dsDNA、CitH3、MPO-DNA的水平明顯高于穩定期組，這與既往的研究結果一致，提示中性粒細胞可能以NETs的形式參與了慢阻肺的發生發展。由于慢阻肺急性加重期患者血液、氣道和肺組織中中性粒細胞較穩定期明顯增加，我們推測慢阻肺患者機體在受到炎癥信號或病原體刺激后，中性粒細胞可能通過增加NETs表達量來參與慢阻肺患者急性加重期的機體炎癥反應。此外，本研究對NETs水平與肺功能指標、CAT評分等提示慢阻肺患者病情的相關指標進行相關性分析，結果顯示急性加重期組CitH3和MPO-DNA與CAT評分呈正相關，穩定期組MPO-DNA與CAT評分呈正相關；穩定期組MPO-DNA與FEV1%pred呈負相關；穩定期組CitH3與FEV1/FVC呈負相關，以上結果提示NETs與慢阻肺患者氣流受限嚴重程度及病情的進展情況相關，進一步證實了NETs與慢阻肺疾病密切相關，但其具體機制尚有待闡明。
IL-8是趨化因子家族中最強的炎癥細胞因子之一，大多由中性粒細胞和巨噬細胞分泌，并可通過激活、誘導中性粒細胞和巨噬細胞聚集并產生多種炎癥介質及氧自由基，從而參與機體的炎癥反應和免疫調節，本研究中慢阻肺組血漿IL-8水平明顯高于健康對照組，提示慢阻肺患者存在炎癥反應。近期有研究表明，IL-8通過誘導中性粒細胞活化促進NETs形成，即IL-8/NETs通路，該通路參與癌癥、動脈粥樣硬化等疾病的進展[15-16]。此外，在重癥肺炎所致的急性呼吸窘迫綜合征患者中也發現有大量的NETs形成，且與局部肺泡炎癥和支氣管肺泡灌洗液中IL-8水平升高有關[17]。本研究結果顯示，慢阻肺急性加重期組dsDNA、CitH3與IL-8水平均呈正相關，且慢阻肺穩定期組dsDNA和IL-8水平呈正相關，這與既往研究結果相一致。已有研究發現，中性粒細胞受到炎癥刺激后可通過蛋白激酶C激活Raf/MERK/ERK信號轉導通路激活煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶，進而刺激氧自由基的產生，使得組蛋白在肽酰基精氨酸脫亞胺酶4的作用下向瓜氨酸化組蛋白轉變，最終導致NETs的生成[18]。此外，在慢阻肺患者中，過量的NETs可通過誘導人上皮細胞和內皮細胞的死亡，進而對肺組織造成不同程度損害，導致肺功能受損和疾病進展[19]。故我們推測，在慢阻肺患者的炎癥反應過程中，IL-8等炎癥因子可促使中性粒細胞等炎癥細胞向受損的氣道上皮細胞處聚集，并分泌產生多種炎癥介質和蛋白酶，從而促進NETs的產生，而NETs的網狀結構可進一步促進炎癥細胞的聚集和炎癥介質的生成，從而造成慢阻肺炎癥中NETs的惡性循環。
IL-33屬于IL-1家族，是一種在多種慢性炎癥性疾病中起重要作用的新型細胞因子，但它在慢阻肺的慢性氣道炎癥中的作用尚不清楚。在慢阻肺小鼠模型中，香煙煙霧誘導支氣管上皮細胞和外周血單核淋巴細胞中IL-33表達增加，并且IL-33可促進外周血單個核細胞中IL-8的產生[20]；Shang等[11]研究也發現，與正常對照組相比，慢阻肺患者支氣管上皮層中IL-33的表達上調，IL-33可以通過ST2/IL-1 RacP通路和MAPKs通路誘導和增強慢阻肺患者肺上皮和內皮細胞IL-8的釋放，接著誘導細胞因子風暴，使中性粒細胞涌入肺部，導致肺組織損傷。本研究發現慢阻肺急性加重期和穩定期組患者血漿中IL-33水平高于對照組，慢阻肺急性加重期組患者血漿IL-33水平又高于穩定期組，這與既往的研究結果一致。此外，近年來有兩項分別在肝臟和皮膚炎癥中開展的研究結果顯示IL-33可以促進NETs的形成[21-22]。本研究中也發現慢阻肺急性加重期組IL-33和NETs的主要成分dsDNA、CitH3、MPO-DNA水平以及IL-8呈正相關，由此提示IL-33可能通過促進IL-8的表達進而促進NETs的形成，參與并放大慢阻肺過程中的炎癥反應。但是本研究發現，穩定期組血漿中的IL-33和NETs及IL-8無明顯相關性，我們推測可能是由于急性加重期組患者使用抗生素、糖皮質激素等藥物治療后，隨著病情進入穩定期，慢阻肺患者的機體炎癥反應較前明顯減輕所致。此外本研究相當于橫斷面研究，并未對慢阻肺患者急性加重期到穩定期的多個時間點進行IL-33、IL-8及NETs的檢測，且樣本量較小，有待設計嚴謹的大型試驗進一步研究確認三者之間的關系。
綜上所述，NETs、IL-33、IL-8可能參與了慢阻肺患者的機體炎癥反應。慢阻肺患者血漿NETs、IL-33、IL-8水平有望成為評估和監測慢阻肺患者病情的重要指標；通過抑制和調節慢阻肺患者NETs的表達可能成為治療慢阻肺的一個新的方向，但NETs導致慢阻肺發生發展的分子機制較為復雜，有待進一步深入研究闡明。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD，簡稱慢阻肺）全球倡議委員會將慢阻肺定義為一種常見的、可預防的和可治療的疾病[1]，持續的氣流限制、肺氣腫性肺泡壁破壞、持續的中性粒細胞浸潤增加和反復感染是慢阻肺的主要顯著特征[2]。中性粒細胞作為慢阻肺發病過程中肺部浸潤的關鍵先天免疫細胞之一[3]，其具體機制尚有待闡明。中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒細胞受到刺激活化后釋放到胞外的一種網狀結構，主要由雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）和組蛋白組成，此外還結合有髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil，NE）、組織因子等中性粒細胞的顆粒蛋白[4]。NETs特有的網狀結構及其攜帶的蛋白成分參與了多種疾病的病理過程，包括自身免疫性疾病、感染、膿毒癥、肺損傷、癌癥轉移、血栓形成和纖維化等[5-7]，慢阻肺患者痰液和氣道中NETs增多并且與癥狀和肺功能的嚴重程度相關[8-10]，提示NETs可能在慢阻肺的病理機制中發揮重要作用，但其機制還未被闡明。白細胞介素（interleukin，IL）-8是促進NETs形成的主要細胞因子，而IL-33作為一種新近發現的促炎細胞因子，已被發現可以促進支氣管內皮細胞和外周血單個核細胞IL-8的分泌[11]，但它是否參與NETs形成尚屬未知。本試驗通過研究血漿中NETs、IL-8和IL-33在不同階段慢阻肺患者和健康人之間的表達水平，以探討NETs在慢阻肺發病機制中的作用及臨床意義。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇2020年10月至2021年5月于石河子大學醫學院第一附屬醫院住院的慢阻肺急性加重期患者40例納入急性加重期組；急性加重期患者經抗感染、祛痰止咳、解痙等對癥治療后，咳嗽、咳痰、氣喘等癥狀穩定或癥狀輕微，病情基本恢復到急性加重前的狀態，判定為進入穩定期，納入慢阻肺穩定期組；同期于石河子大學醫學院第一附屬醫院體檢科選取40例健康體檢者納入對照組。慢阻肺診斷標準參考中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組于2013年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》。排除標準：患者有支氣管哮喘、矽肺、肺結核、間質性肺疾病等慢性疾病；合并冠心病、動脈粥樣硬化、2型糖尿病、肝腎疾病、腫瘤及自身免疫性疾病的患者；納入前使用過糖皮質激素、抗生素及免疫抑制劑的急性加重期慢阻肺患者；不能配合完成肺功能者。對照組為正常健康人群，依據隨機原則與病例組在性別、年齡上進行匹配。該研究通過石河子大學醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（KJ2020-133-01），所有入選對象均簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 一般臨床資料
收集性別、年齡、吸煙史等資料，慢阻肺穩定期組患者和對照組進行肺功能檢查，慢阻肺患者行慢阻肺評估測試（COPD assessment test，CAT）評分。
1.2.2 肺功能檢測
肺功能檢測由肺功能室專科醫生按照標準肺功能檢查程序完成。收集每位研究對象第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity，FEV1/FVC）和第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（forced expiratory volume in the first second predicted，FEV1%pred）。
1.2.3 血漿中dsDNA、瓜氨酸組蛋白3、MPO-DNA及IL-33、IL-8的檢測
采集各組患者清晨空腹狀態下外周靜脈血5 mL，置于有肝素抗凝劑的試管內，3000 r/min離心5 min，分離血漿，置于–80 ℃保存待測；使用酶聯免疫吸附法檢測血漿中瓜氨酸組蛋白3（citrulline histone 3，CitH3）、MPO-DNA、IL-33、IL-8水平，采用PicoGreen熒光染料定量分析血漿中dsDNA水平；CitH3試劑盒購于美國Cayman Chemical公司；MPO及凋亡檢測試劑盒購于美國Abcam公司、瑞士Roche公司；IL-8試劑盒購于美國Abcam公司；IL-33試劑盒購于美國R＆D公司；dsDNA試劑盒Quant-iT? PicoGreen ? reagent購于美國Invitrogen公司。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0統計軟件。呈正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，偏態分布的計量資料用中位數和四分位數表示，計數資料用頻數和百分數表示。計數資料的組間比較采用χ2檢驗。符合正態分布的計量資料采用t檢驗，配對的兩組比較采用配對t檢驗，獨立的兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。偏態分布的計量資料用秩和檢驗。相關性分析，服從正態分布的計量資料用Pearson法，非正態分布計量資料和計數資料用Spearman法。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料比較
慢阻肺組與對照組的性別、年齡、體重指數（body mass index, BMI）差異無統計學意義（P>0.05），慢阻肺組FEV1%pred和FEV1/FVC顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。
表1
慢阻肺組與對照組的基本資料比較［（）/例（%）］
2.2 急性加重期組、穩定期組與和對照組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8的比較
急性加重期組的dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8水平顯著高于穩定期組（P<0.05）和對照組（P<0.05）。穩定期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33的水平顯著高于對照組（P<0.05）。結果見圖1。
圖1
急性加重期組、穩定期組與和對照組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8水平的比較
1 對照組；2 急性加重期組；3 穩定期組。*與對照組比較，
2.3 急性加重期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8與臨床指標的相關性分析
急性加重期組CitH3、MPO-DNA、IL-33和IL-8水平均與CAT評分呈正相關（r=0.335，P=0.035；r=0.423，P=0.006；r=0.411，P=0.008；r=0.396，P=0.011）。結果見表2。
表2
急性加重期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8與臨床指標的相關性分析
2.4 穩定期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8與臨床指標的相關性分析
穩定期組MPO-DNA和IL-8水平均與CAT評分呈正相關（r=0.351，P=0.026；r=0.375，P=0.017）；穩定期組MPO-DNA與FEV1%pred呈負相關（r=?0.411，P=0.008）；穩定期期組CitH3與FEV1/FVC呈負相關（r=?0.395，P=0.012）。結果見表3。
表3
慢阻肺穩定期組dsDNA、CitH3、MPO-DNA、IL-33、IL-8與臨床指標的相關性分析
2.5 慢阻肺患者IL-8與NETs的相關性分析
急性加重期組IL-8和dsDNA、CitH3水平呈正相關，與MPO-DNA水平無明顯相關性；穩定期組IL-8和dsDNA水平呈正相關，與CitH3和MPO-DNA無明顯相關性。結果見表4。
表4
慢阻肺患者IL-8與NETs的相關性分析
2.6 慢阻肺患者IL-33與IL-8和NETs的相關性分析
急性加重期組IL-33和IL-8、dsDNA、CitH3、MPO-DNA水平呈正相關；穩定期組中IL-33和IL-8、dsDNA、CitH3、MPO-DNA水平無明顯相關性。結果見表5。
表5
慢阻肺患者IL-33與IL-8和NETs的相關性分析
3 討論
慢阻肺是慢性氣道炎癥疾病中最常見但預后較差的類型，然而其確切的發病機制尚不清楚。吸煙是導致慢阻肺疾病進展的關鍵因素之一，香煙煙霧提取物可導致中性粒細胞繼發性顆粒脫顆粒，從而導致氣道炎癥和組織降解，并可以對中性粒細胞趨化性、中性粒細胞胞外誘捕網的形成和炎癥反應相關基因表達進行修飾[12]。眾所周知，中性粒細胞是連接先天免疫和適應性免疫的免疫防御屏障的重要組成部分之一，可通過趨化、吞噬、脫顆粒作用，消除無菌炎癥。近期研究發現，中性粒細胞可通過釋放由DNA骨架、組蛋白、髓過氧化物酶、組織因子等顆粒蛋白成分組成的網狀結構即NETs來參與殺死病原體、清除細胞碎片，參與機體自身免疫應答[13]。
研究發現，在慢阻肺患者外周血和痰樣本中NETs的形成增加，且在嚴重的慢阻肺患者中更為豐富，并與頻繁的病情惡化和微生物群多樣性減少相關[9]。此外，另一項研究也發現，與健康對照組相比，穩定期慢阻患者的外周血中NETs的產生增加[14]。本研究檢測了慢阻肺患者血漿中NETs的主要成分dsDNA、CitH3、MPO-DNA的水平，結果顯示慢阻肺患者急性加重期組和穩定期組的dsDNA、CitH3、MPO-DNA水平明顯高于健康對照組，且急性加重期組的dsDNA、CitH3、MPO-DNA的水平明顯高于穩定期組，這與既往的研究結果一致，提示中性粒細胞可能以NETs的形式參與了慢阻肺的發生發展。由于慢阻肺急性加重期患者血液、氣道和肺組織中中性粒細胞較穩定期明顯增加，我們推測慢阻肺患者機體在受到炎癥信號或病原體刺激后，中性粒細胞可能通過增加NETs表達量來參與慢阻肺患者急性加重期的機體炎癥反應。此外，本研究對NETs水平與肺功能指標、CAT評分等提示慢阻肺患者病情的相關指標進行相關性分析，結果顯示急性加重期組CitH3和MPO-DNA與CAT評分呈正相關，穩定期組MPO-DNA與CAT評分呈正相關；穩定期組MPO-DNA與FEV1%pred呈負相關；穩定期組CitH3與FEV1/FVC呈負相關，以上結果提示NETs與慢阻肺患者氣流受限嚴重程度及病情的進展情況相關，進一步證實了NETs與慢阻肺疾病密切相關，但其具體機制尚有待闡明。
IL-8是趨化因子家族中最強的炎癥細胞因子之一，大多由中性粒細胞和巨噬細胞分泌，并可通過激活、誘導中性粒細胞和巨噬細胞聚集并產生多種炎癥介質及氧自由基，從而參與機體的炎癥反應和免疫調節，本研究中慢阻肺組血漿IL-8水平明顯高于健康對照組，提示慢阻肺患者存在炎癥反應。近期有研究表明，IL-8通過誘導中性粒細胞活化促進NETs形成，即IL-8/NETs通路，該通路參與癌癥、動脈粥樣硬化等疾病的進展[15-16]。此外，在重癥肺炎所致的急性呼吸窘迫綜合征患者中也發現有大量的NETs形成，且與局部肺泡炎癥和支氣管肺泡灌洗液中IL-8水平升高有關[17]。本研究結果顯示，慢阻肺急性加重期組dsDNA、CitH3與IL-8水平均呈正相關，且慢阻肺穩定期組dsDNA和IL-8水平呈正相關，這與既往研究結果相一致。已有研究發現，中性粒細胞受到炎癥刺激后可通過蛋白激酶C激活Raf/MERK/ERK信號轉導通路激活煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶，進而刺激氧自由基的產生，使得組蛋白在肽酰基精氨酸脫亞胺酶4的作用下向瓜氨酸化組蛋白轉變，最終導致NETs的生成[18]。此外，在慢阻肺患者中，過量的NETs可通過誘導人上皮細胞和內皮細胞的死亡，進而對肺組織造成不同程度損害，導致肺功能受損和疾病進展[19]。故我們推測，在慢阻肺患者的炎癥反應過程中，IL-8等炎癥因子可促使中性粒細胞等炎癥細胞向受損的氣道上皮細胞處聚集，并分泌產生多種炎癥介質和蛋白酶，從而促進NETs的產生，而NETs的網狀結構可進一步促進炎癥細胞的聚集和炎癥介質的生成，從而造成慢阻肺炎癥中NETs的惡性循環。
IL-33屬于IL-1家族，是一種在多種慢性炎癥性疾病中起重要作用的新型細胞因子，但它在慢阻肺的慢性氣道炎癥中的作用尚不清楚。在慢阻肺小鼠模型中，香煙煙霧誘導支氣管上皮細胞和外周血單核淋巴細胞中IL-33表達增加，并且IL-33可促進外周血單個核細胞中IL-8的產生[20]；Shang等[11]研究也發現，與正常對照組相比，慢阻肺患者支氣管上皮層中IL-33的表達上調，IL-33可以通過ST2/IL-1 RacP通路和MAPKs通路誘導和增強慢阻肺患者肺上皮和內皮細胞IL-8的釋放，接著誘導細胞因子風暴，使中性粒細胞涌入肺部，導致肺組織損傷。本研究發現慢阻肺急性加重期和穩定期組患者血漿中IL-33水平高于對照組，慢阻肺急性加重期組患者血漿IL-33水平又高于穩定期組，這與既往的研究結果一致。此外，近年來有兩項分別在肝臟和皮膚炎癥中開展的研究結果顯示IL-33可以促進NETs的形成[21-22]。本研究中也發現慢阻肺急性加重期組IL-33和NETs的主要成分dsDNA、CitH3、MPO-DNA水平以及IL-8呈正相關，由此提示IL-33可能通過促進IL-8的表達進而促進NETs的形成，參與并放大慢阻肺過程中的炎癥反應。但是本研究發現，穩定期組血漿中的IL-33和NETs及IL-8無明顯相關性，我們推測可能是由于急性加重期組患者使用抗生素、糖皮質激素等藥物治療后，隨著病情進入穩定期，慢阻肺患者的機體炎癥反應較前明顯減輕所致。此外本研究相當于橫斷面研究，并未對慢阻肺患者急性加重期到穩定期的多個時間點進行IL-33、IL-8及NETs的檢測，且樣本量較小，有待設計嚴謹的大型試驗進一步研究確認三者之間的關系。
綜上所述，NETs、IL-33、IL-8可能參與了慢阻肺患者的機體炎癥反應。慢阻肺患者血漿NETs、IL-33、IL-8水平有望成為評估和監測慢阻肺患者病情的重要指標；通過抑制和調節慢阻肺患者NETs的表達可能成為治療慢阻肺的一個新的方向，但NETs導致慢阻肺發生發展的分子機制較為復雜，有待進一步深入研究闡明。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
