引用本文： 王念, 鄭鈺凡, 黃少堅, 辜淦斌, 徐陽, 何芳. 大氣顆粒物暴露對大鼠心臟和肺組織的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(11): 795-801. doi: 10.7507/1671-6205.202105006 復制
大氣顆粒物（PM）是指懸浮在空氣中的混合污染物，其中包含煙霧、灰塵、其他固體和液體以及許多生物成分的復雜混合物[1]。PM污染目前是僅次于高血壓、吸煙、糖尿病和肥胖的全球第五大健康風險因素，導致全球每年約700萬人過早死亡[2]。長期暴露于PM除了可以引發呼吸道疾病[3]外，還會對心血管系統造成影響[4-5]，尤其是粒徑更小的PM2.5，其本身可吸附多種有害物質和重金屬，對人體健康的影響更大[6]。生物燃料煙霧（BMF）和機動車尾氣（MVE）的釋放是大氣中細PM的首要來源，PM通過呼吸道進入肺部，一部分沉積在肺泡中，另外一部分則可以通過血液循環對全身各個器官和組織造成損傷。我們在前期建立的大氣PM慢性暴露模型上發現，長期暴露于BMF和MVE兩種不同來源的PM可導致大鼠肺功能損害、引發肺部出現慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）樣病理特征性改變和腸道菌群失衡[7-8]。
PM暴露對機體影響的具體機制目前尚不完全清楚，既往的研究主要集中在肺部炎癥機制上[9]。為進一步研究大氣PM慢性暴露對大鼠心臟和肺組織的影響及其可能機制，在前期所建立的方法學基礎上，建立BMF和MVE慢性暴露大鼠模型，通過形態學觀察和免疫組織化學等方法研究PM暴露誘導的心臟和肺組織的病理變化。
1 材料與方法
1.1 材料和分組
1.1.1 實驗動物和分組
30只6～8周齡無特定病原體級SD雌性大鼠，體重（290±20）g，購自廣東省動物中心。所有實驗方案均經廣州醫科大學動物管理與使用委員會批準（倫理編號：GY2019-009）。動物飼養于廣州醫科大學實驗動物中心［該動物生產許可證號：SYXK（粵）2016-0168］，設施中的溫度和相對濕度分別控制在（23±2）℃和40%～70%，連續12 h的光照（06: 00～18: 00）和黑暗交替，無限制提供經消毒的食物和飲水。大鼠在適應性喂養7d后，隨機分為3組（n=10）：清潔空氣暴露組（對照組）、MVE暴露組（MVE組）和BMF暴露組（BMF組）。
1.1.2 主要試劑
兔抗-Bcl-2抗體和兔抗-Bax抗體購于Abcam公司；羊抗兔IgGⅡ抗購于Sigma公司；山羊血清封閉液購于Abcam公司；蘇木素–伊紅（HE）染色試劑盒購于Boster公司，馬松（Masson）染色試劑盒購于Solarbio公司。
1.2 方法
1.2.1 暴露系統
根據本課題前期所建立的大氣PM暴露裝置和方法學[7-8]對SD大鼠實施BMF和MVE暴露，暴露過程如下：BMF組大鼠置于BMF暴露室內，通過陰燃中國杉木木屑（40 g/次）產生煙霧并傳送到大鼠暴露室中，暴露時間為1 h/次，4次/d，每次間隔30 min，期間排出暴露室內廢氣，通入清潔空氣，連續暴露5 d，間隔2 d后再次重復處理，共暴露12 周。MVE組大鼠置于MVE暴露室內，通過摩托車怠速狀態產生MVE，經金屬管運輸至大鼠暴露室，暴露2 h/次，2次/d，期間排出暴露室內廢氣，通入清潔空氣，連續暴露5 d，間隔2 d后再次重復處理，共暴露12周。對照組大鼠放置在清潔空氣的動物房中作為對照。
1.2.2 PM濃度和相關氣體濃度的檢測
BMF組和MVE組暴露過程中通過DustTrak II空氣污染顆粒物監測儀（TSI，Shoreview，MN，美國）檢測PM顆粒大小及進行實時PM10、PM2.5和PM1質量濃度和粒度分布的監測。通過Testo 340便攜式煙氣分析儀（Testo，Lenzkirch，德國）對暴露系統中有關氣體濃度［氧氣（O2）、一氧化碳（CO）、氮氧化物（NOx）和二氧化硫（SO2）］進行監測。
1.2.3 支氣管肺泡灌洗
在第12周暴露實驗結束后，通過CO2窒息處死大鼠，于頸部氣管行縱行切口，逐層剝離暴露器官，鈍性分離出心臟。通過氣管插管對大鼠行支氣管肺泡灌洗，9 mL/次，反復灌洗3次。將收集的支氣管肺泡灌洗液（BALF）于1200 r/min離心10 min，收集底部的細胞，重懸后計數細胞總數經HE染色進行細胞分類計數。光鏡下400個非上皮細胞分類計數，以百分比報告結果。
1.2.4 組織病理學觀察
取1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm心臟和肺組織分別用福爾馬林固定，逐級脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，行HE及Masson染色，光鏡下觀察組織變化及纖維化程度。
1.2.5 免疫組織化學法觀察心臟和肺組織凋亡因子Bcl-2和Bax表達
經石蠟包埋切片處理后，消除過氧化物酶活性，用10%山羊血清封閉，分別加入Bcl-2和Bax抗體孵育12 h后清洗，孵育二抗，加顯色劑，復染、脫水、封片，應用切片掃描儀對切片進行圖像采集和定量分析。高倍鏡下每張切片隨機選擇不重疊的5個視野，Bcl-2和Bax呈胞漿陽性。計算每例樣本蛋白染色陽性細胞面積率（陽性細胞面積/總面積），作為比較參數。
1.3 統計學方法
采用SPSS 24.0統計軟件，數據以均數±標準差（
±s）表示，多組間比較分析采用單因素方差分析，并使用Bonferroni方法對P值進行校正。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 BMF和MVE暴露期間各PM和氣體濃度監測
對照組、BMF組和MVE組在PM暴露過程中PM10、PM2.5、PM1的平均暴露濃度和各氣體組份濃度見表1。BMF組和MVE組暴露期間暴露室內PM濃度變化趨勢見圖1。PM10、PM2.5和PM1在MVE暴露室中的濃度相近，但在BMF暴露室中濃度有較明顯差異。
表1
各實驗組暴露期間PM顆粒大小以及O2、CO、NO1、NOx、SO2濃度和環境溫濕度結果（
）
圖1
BMF組和MVE組暴露期間暴露室中PM濃度變化趨勢
a. BMF暴露室；b. MVE暴露室。PM10、PM2.5和PM1在MVE暴露室中的濃度相近，但在BMF暴露室中濃度有較明顯差異。
2.2 大鼠一般狀態
在12周的暴露過程中所有實驗大鼠均未出現死亡案例。與對照組大鼠相比，BMF組和MVE組大鼠均出現精神萎靡，活動力下降，進食減少，背毛稀疏等情況。其中BMF組大鼠的脫毛現象更為明顯，表現為胸部及雙側頸部均出現脫毛，MVE組大鼠僅雙側頸部出現脫毛現象。
2.3 BMF和MVE暴露對大鼠體重、BALF內細胞及肺組織的影響
在PM暴露第4周時，BMF組和MVE組大鼠體重增長速度與對照組相比明顯減緩（P<0.01），在實施PM暴露第12周后BMF組和MVE組大鼠體重較對照組相比顯著降低（P<0.01），BMF和MVE組之間大鼠的體重無顯著性差異（圖2a）。收集三組間BALF行細胞分類計數，MVE組和BMF組中細胞總數高于對照組（圖2b，P<0.05），升高的細胞以肺泡巨噬細胞為主，其中MVE組肺泡巨噬細胞升高更為顯著（圖2c，P<0.01）。BALF經HE染色，BMF組和MVE組中可見肺泡巨噬細胞吞噬黑色碳顆粒的現象（圖2d）。暴露12周后，打開胸腔可見對照組大鼠肺部圓潤飽滿，色澤鮮艷，而BMF組和MVE組大鼠肺組織顏色不一致，大部分呈蒼白的灰紅色，局部可見暗紅色，表面似有結節、凹凸不平、邊緣欠清，支氣管周圍可見數量不等的脂肪組織纏繞，且MVE組上述改變更為顯著（圖2e）。
圖2
BMF和MVE暴露對大鼠體重、BALF內細胞及肺組織的影響
a. BMF和MVE暴露對體重的影響。b和c. BMF和MVE暴露引起BALF細胞總數和肺泡巨噬細胞總數升高（結果以 ±
BMF和MVE暴露引起大鼠肺組織炎癥反應和氣管壁纖維化。與對照組相比，BMF組氣道壁輕微增厚伴炎癥浸潤，纖毛組織尚清晰。MVE組的氣道炎癥更為明顯，出現氣道壁增厚，纖毛上皮模糊不清，局部纖毛柱狀上皮倒伏、缺失，間質見炎癥細胞浸潤、紅細胞增多；BMF和MVE組大鼠均出現肺泡腔增大，肺氣腫的征象（圖3a）。Masson染色結果顯示BMF和MVE暴露組氣道壁和肺間質間均出現輕度纖維組織增生。此外，MVE組肺組織可見血管擴張、充血，血管壁增厚等情況（圖3b）。
圖3
BMF和MVE暴露對大鼠肺組織形態及纖維化的影響（×200）
右上角為放大細節圖。a圖為肺組織HE染色，與對照組相比，暴露組肺泡腔擴張，肺泡上皮細胞反應性增生，部分纖毛倒伏、丟失。b圖為肺組織Masson染色，與對照組相比，氣道壁和肺間質間纖維組織增生。
BMF和MVE暴露引起大鼠肺泡上皮細胞凋亡增加。與對照組相比，BMF和MVE暴露12周后大鼠肺組織Bcl-2表達明顯下降（P<0.01，圖4a），而Bax表達明顯升高（P<0.01，圖4b）。PM可誘導肺泡上皮細胞促凋亡因子Bax表達增多，抗凋亡因子Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2比值增加，提示BMF和MVE暴露可促進大鼠肺泡上皮細胞凋亡。
圖4
BMF和MVE暴露對大鼠肺組織表達Bcl-2和Bax的影響（免疫組織化學×200）
右上角為放大細節圖。a. Bcl-2表達；B. Bax表達。肺泡上皮細胞Bcl-2表達降低，Bax表達明顯升高。*
2.4 BMF和MVE暴露對大鼠心臟組織的影響
BMF和MVE暴露12周后引起大鼠心臟組織炎癥反應和纖維化改變。BMF暴露后，大鼠心肌細胞呈輕度變性水腫，排列稍紊亂，可見個別炎癥細胞浸潤。MVE暴露后，大鼠心肌細胞炎癥反應更加顯著，心肌纖維著色不均，肌纖維邊緣模糊，水腫明顯，可見散在心肌細胞核固縮、空泡變，并見出血。對照組的心肌細胞排列整齊，未發現心肌細胞明顯形態異常和炎癥細胞浸潤（圖5a）。Masson染色后可見，對照組心肌細胞形態正常，而BMF組和MVE組大鼠多處心肌細胞間可見纖維組織增生，呈淡藍色（圖5b）。
圖5
BMF和MVE暴露對大鼠心臟組織形態及纖維化的影響（×200）
右上角為放大細節圖。a圖為心臟組織HE染色，與對照組相比，BMF和MVE暴露后大鼠心肌細胞結構紊亂、水腫變性。b圖為心臟組織Masson染色，BMF與MVE組大鼠心肌肌束間纖維組織增生明顯。
BMF和MVE暴露引起大鼠心肌細胞凋亡增加。與對照組相比，BMF和MVE組心肌細胞Bcl-2表達減弱（P<0.01，圖6a），Bax表達增加（P<0.01，圖6b）。表明BMF和MVE暴露促進大鼠心肌細胞的凋亡。
圖6
BMF和MVE暴露對大鼠心臟組織表達Bcl-2和Bax的影響（免疫組織化學×200）
右上角為放大細節圖。a. Bcl-2表達；b. Bax表達。與對照組相比，BMF和MVE組大鼠心肌細胞Bcl-2表達降低，而Bax表達增多。*
3 討論
BMF和MVE分別是我國室內空氣污染和室外大氣PM的主要來源[1]，流行病學研究結果已證實，生物燃料的不完全燃燒和暴露于MVE與慢阻肺、冠心病和肺癌等疾病的高發病率相關[10-12]，因此研究上述兩種主要PM的毒性作用具有實際意義。本實驗通過陰燃木材和怠速摩托車發動機的方式，模擬農村特征燃料燃燒暴露以及城市中MVE暴露，在大鼠模型上研究這兩種PM暴露對心臟和肺組織的影響。
本研究發現，BMF和MVE暴露可引起肺部發生炎癥反應，BALF中細胞總數升高，且主要以肺泡巨噬細胞升高為主。肺泡巨噬細胞作為肺部最重要的免疫細胞之一，是處理吸入肺腔中病原體、抗原和PM的主要細胞，還可以通過分泌多種細胞因子發揮免疫調節和介導炎癥反應[13]。不斷地暴露于PM所誘導的氧化應激和炎癥過程會破壞氣道上皮層，引起肺泡上皮細胞水腫和肺泡腔擴張，氣道上皮損傷等現象。PM暴露引發炎癥反應而引起細胞損傷，一方面為PM經呼吸道吸入肺部后直接損傷呼吸道黏膜和上皮細胞而產生炎癥，另一方面通過募集多種炎癥細胞聚集到肺部后，釋放大量趨化因子和細胞因子，放大炎癥效應[14]。進一步研究發現，PM可以誘導上皮細胞分泌黏蛋白從而維持氣道黏液高分泌狀態[15]，激活Hh信號通路誘發氣道平滑肌遷移和分泌增加[16]，引起人支氣管上皮細胞發生上皮–間充質細胞轉分化（EMT）參與引起氣道重塑[17]。這一研究結果與本實驗中PM暴露組大鼠肺組織間質纖維組織增生結果相符。肺纖維化進展通常會導致氣體交換功能受損、呼吸衰竭，甚至死亡。有研究表明，肺纖維化的驅動因素除了肺成纖維細胞的異常活化和分化外，還有持續的肺泡損傷和不完全修復。經典活化巨噬細胞和交替活化巨噬細胞已在肺損傷、修復和纖維化中得到廣泛研究[18]。因此，提示BALF中巨噬細胞總數的增加與肺纖維化對肺的損傷可能是相互促進、共同作用的。有學者研究發現PM暴露可以通過上調Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3蛋白水平，和下調Bcl-2蛋白水平增加細胞凋亡，表明PM2.5激活了線粒體介導的凋亡通路[19]。本研究同樣發現PM暴露后可誘導肺泡上皮細胞促凋亡因子Bax表達增多，抗凋亡因子Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2比值增加，提示BMF和MVE暴露可促進大鼠肺泡上皮細胞凋亡。當肺泡上皮細胞凋亡異常增加的速度超過這些結構細胞增殖時，最終結果是肺組織的破壞和肺氣腫的發展[20]。總的來說，大氣PM暴露對肺部的影響是多方面的，涉及炎癥反應、纖維化和肺泡上皮凋亡等重要途徑，長期持久的PM暴露可引起肺氣腫和支氣管炎癥，最終導致慢阻肺[21-22]。
PM可通過肺部進入血液循環從而對心臟產生直接的作用，大氣PM暴露對心臟的影響同樣受到越來越多的科研工作者關注[23]。本研究發現，MVE和BMF暴露引起心肌細胞水腫變性，炎癥細胞浸潤增加，心肌排列紊亂，提示PM暴露可引起心肌細胞受損。有研究表明，PM主要通過引起心肌細胞氧化應激、影響心臟自主神經功能、直接的心肌細胞毒性以及改變血液凝固性和黏度這幾個方面而產生對心臟的損傷作用[24-25]。如血液循環中的PM可刺激單核細胞和T細胞，并通過上調內皮細胞微粒（膜聯蛋白Ⅴ/CD41–/CD31+）、促炎癥細胞因子（MCP-1，MIP-1α/β，IL-6和IL-1β）等途徑誘導血管內皮細胞凋亡以及炎癥反應，從而促進動脈粥樣硬化及冠心病的病程發展[9]。在本研究中，BMF和MVE暴露12周后均可引起大鼠心臟組織纖維反應，并且出現大鼠心肌細胞凋亡增加。過度炎癥、纖維化以及異常細胞凋亡是器官組織損傷的關鍵病理驅動因素[26-27]。
本研究尚存在一些局限性。首先，由于樣本受限，未能進行心肺功能方面的檢測，不能證實暴露于BMF和MVE 12周大鼠是否已經產生功能上的損害，達到了疾病狀態。其次，尚需進行更深層次的研究，比如分子機制等方面，進一步探索不同來源的大氣PM對機體的危害。
綜上所述，BMF和MVE暴露12周可引起大鼠心臟和肺組織不同程度的炎癥反應、形態學改變和凋亡增加，研究BMF和MVE暴露有助于我們進一步研究不同來源的空氣污染源暴露可能對機體重要臟器產生的不同影響以及致病機制。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
大氣顆粒物（PM）是指懸浮在空氣中的混合污染物，其中包含煙霧、灰塵、其他固體和液體以及許多生物成分的復雜混合物[1]。PM污染目前是僅次于高血壓、吸煙、糖尿病和肥胖的全球第五大健康風險因素，導致全球每年約700萬人過早死亡[2]。長期暴露于PM除了可以引發呼吸道疾病[3]外，還會對心血管系統造成影響[4-5]，尤其是粒徑更小的PM2.5，其本身可吸附多種有害物質和重金屬，對人體健康的影響更大[6]。生物燃料煙霧（BMF）和機動車尾氣（MVE）的釋放是大氣中細PM的首要來源，PM通過呼吸道進入肺部，一部分沉積在肺泡中，另外一部分則可以通過血液循環對全身各個器官和組織造成損傷。我們在前期建立的大氣PM慢性暴露模型上發現，長期暴露于BMF和MVE兩種不同來源的PM可導致大鼠肺功能損害、引發肺部出現慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）樣病理特征性改變和腸道菌群失衡[7-8]。
PM暴露對機體影響的具體機制目前尚不完全清楚，既往的研究主要集中在肺部炎癥機制上[9]。為進一步研究大氣PM慢性暴露對大鼠心臟和肺組織的影響及其可能機制，在前期所建立的方法學基礎上，建立BMF和MVE慢性暴露大鼠模型，通過形態學觀察和免疫組織化學等方法研究PM暴露誘導的心臟和肺組織的病理變化。
1 材料與方法
1.1 材料和分組
1.1.1 實驗動物和分組
30只6～8周齡無特定病原體級SD雌性大鼠，體重（290±20）g，購自廣東省動物中心。所有實驗方案均經廣州醫科大學動物管理與使用委員會批準（倫理編號：GY2019-009）。動物飼養于廣州醫科大學實驗動物中心［該動物生產許可證號：SYXK（粵）2016-0168］，設施中的溫度和相對濕度分別控制在（23±2）℃和40%～70%，連續12 h的光照（06: 00～18: 00）和黑暗交替，無限制提供經消毒的食物和飲水。大鼠在適應性喂養7d后，隨機分為3組（n=10）：清潔空氣暴露組（對照組）、MVE暴露組（MVE組）和BMF暴露組（BMF組）。
1.1.2 主要試劑
兔抗-Bcl-2抗體和兔抗-Bax抗體購于Abcam公司；羊抗兔IgGⅡ抗購于Sigma公司；山羊血清封閉液購于Abcam公司；蘇木素–伊紅（HE）染色試劑盒購于Boster公司，馬松（Masson）染色試劑盒購于Solarbio公司。
1.2 方法
1.2.1 暴露系統
根據本課題前期所建立的大氣PM暴露裝置和方法學[7-8]對SD大鼠實施BMF和MVE暴露，暴露過程如下：BMF組大鼠置于BMF暴露室內，通過陰燃中國杉木木屑（40 g/次）產生煙霧并傳送到大鼠暴露室中，暴露時間為1 h/次，4次/d，每次間隔30 min，期間排出暴露室內廢氣，通入清潔空氣，連續暴露5 d，間隔2 d后再次重復處理，共暴露12 周。MVE組大鼠置于MVE暴露室內，通過摩托車怠速狀態產生MVE，經金屬管運輸至大鼠暴露室，暴露2 h/次，2次/d，期間排出暴露室內廢氣，通入清潔空氣，連續暴露5 d，間隔2 d后再次重復處理，共暴露12周。對照組大鼠放置在清潔空氣的動物房中作為對照。
1.2.2 PM濃度和相關氣體濃度的檢測
BMF組和MVE組暴露過程中通過DustTrak II空氣污染顆粒物監測儀（TSI，Shoreview，MN，美國）檢測PM顆粒大小及進行實時PM10、PM2.5和PM1質量濃度和粒度分布的監測。通過Testo 340便攜式煙氣分析儀（Testo，Lenzkirch，德國）對暴露系統中有關氣體濃度［氧氣（O2）、一氧化碳（CO）、氮氧化物（NOx）和二氧化硫（SO2）］進行監測。
1.2.3 支氣管肺泡灌洗
在第12周暴露實驗結束后，通過CO2窒息處死大鼠，于頸部氣管行縱行切口，逐層剝離暴露器官，鈍性分離出心臟。通過氣管插管對大鼠行支氣管肺泡灌洗，9 mL/次，反復灌洗3次。將收集的支氣管肺泡灌洗液（BALF）于1200 r/min離心10 min，收集底部的細胞，重懸后計數細胞總數經HE染色進行細胞分類計數。光鏡下400個非上皮細胞分類計數，以百分比報告結果。
1.2.4 組織病理學觀察
取1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm心臟和肺組織分別用福爾馬林固定，逐級脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，行HE及Masson染色，光鏡下觀察組織變化及纖維化程度。
1.2.5 免疫組織化學法觀察心臟和肺組織凋亡因子Bcl-2和Bax表達
經石蠟包埋切片處理后，消除過氧化物酶活性，用10%山羊血清封閉，分別加入Bcl-2和Bax抗體孵育12 h后清洗，孵育二抗，加顯色劑，復染、脫水、封片，應用切片掃描儀對切片進行圖像采集和定量分析。高倍鏡下每張切片隨機選擇不重疊的5個視野，Bcl-2和Bax呈胞漿陽性。計算每例樣本蛋白染色陽性細胞面積率（陽性細胞面積/總面積），作為比較參數。
1.3 統計學方法
采用SPSS 24.0統計軟件，數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較分析采用單因素方差分析，并使用Bonferroni方法對P值進行校正。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 BMF和MVE暴露期間各PM和氣體濃度監測
對照組、BMF組和MVE組在PM暴露過程中PM10、PM2.5、PM1的平均暴露濃度和各氣體組份濃度見表1。BMF組和MVE組暴露期間暴露室內PM濃度變化趨勢見圖1。PM10、PM2.5和PM1在MVE暴露室中的濃度相近，但在BMF暴露室中濃度有較明顯差異。
表1
各實驗組暴露期間PM顆粒大小以及O2、CO、NO1、NOx、SO2濃度和環境溫濕度結果（）
圖1
BMF組和MVE組暴露期間暴露室中PM濃度變化趨勢
a. BMF暴露室；b. MVE暴露室。PM10、PM2.5和PM1在MVE暴露室中的濃度相近，但在BMF暴露室中濃度有較明顯差異。
2.2 大鼠一般狀態
在12周的暴露過程中所有實驗大鼠均未出現死亡案例。與對照組大鼠相比，BMF組和MVE組大鼠均出現精神萎靡，活動力下降，進食減少，背毛稀疏等情況。其中BMF組大鼠的脫毛現象更為明顯，表現為胸部及雙側頸部均出現脫毛，MVE組大鼠僅雙側頸部出現脫毛現象。
2.3 BMF和MVE暴露對大鼠體重、BALF內細胞及肺組織的影響
在PM暴露第4周時，BMF組和MVE組大鼠體重增長速度與對照組相比明顯減緩（P<0.01），在實施PM暴露第12周后BMF組和MVE組大鼠體重較對照組相比顯著降低（P<0.01），BMF和MVE組之間大鼠的體重無顯著性差異（圖2a）。收集三組間BALF行細胞分類計數，MVE組和BMF組中細胞總數高于對照組（圖2b，P<0.05），升高的細胞以肺泡巨噬細胞為主，其中MVE組肺泡巨噬細胞升高更為顯著（圖2c，P<0.01）。BALF經HE染色，BMF組和MVE組中可見肺泡巨噬細胞吞噬黑色碳顆粒的現象（圖2d）。暴露12周后，打開胸腔可見對照組大鼠肺部圓潤飽滿，色澤鮮艷，而BMF組和MVE組大鼠肺組織顏色不一致，大部分呈蒼白的灰紅色，局部可見暗紅色，表面似有結節、凹凸不平、邊緣欠清，支氣管周圍可見數量不等的脂肪組織纏繞，且MVE組上述改變更為顯著（圖2e）。
圖2
BMF和MVE暴露對大鼠體重、BALF內細胞及肺組織的影響
a. BMF和MVE暴露對體重的影響。b和c. BMF和MVE暴露引起BALF細胞總數和肺泡巨噬細胞總數升高（結果以 ±
BMF和MVE暴露引起大鼠肺組織炎癥反應和氣管壁纖維化。與對照組相比，BMF組氣道壁輕微增厚伴炎癥浸潤，纖毛組織尚清晰。MVE組的氣道炎癥更為明顯，出現氣道壁增厚，纖毛上皮模糊不清，局部纖毛柱狀上皮倒伏、缺失，間質見炎癥細胞浸潤、紅細胞增多；BMF和MVE組大鼠均出現肺泡腔增大，肺氣腫的征象（圖3a）。Masson染色結果顯示BMF和MVE暴露組氣道壁和肺間質間均出現輕度纖維組織增生。此外，MVE組肺組織可見血管擴張、充血，血管壁增厚等情況（圖3b）。
圖3
BMF和MVE暴露對大鼠肺組織形態及纖維化的影響（×200）
右上角為放大細節圖。a圖為肺組織HE染色，與對照組相比，暴露組肺泡腔擴張，肺泡上皮細胞反應性增生，部分纖毛倒伏、丟失。b圖為肺組織Masson染色，與對照組相比，氣道壁和肺間質間纖維組織增生。
BMF和MVE暴露引起大鼠肺泡上皮細胞凋亡增加。與對照組相比，BMF和MVE暴露12周后大鼠肺組織Bcl-2表達明顯下降（P<0.01，圖4a），而Bax表達明顯升高（P<0.01，圖4b）。PM可誘導肺泡上皮細胞促凋亡因子Bax表達增多，抗凋亡因子Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2比值增加，提示BMF和MVE暴露可促進大鼠肺泡上皮細胞凋亡。
圖4
BMF和MVE暴露對大鼠肺組織表達Bcl-2和Bax的影響（免疫組織化學×200）
右上角為放大細節圖。a. Bcl-2表達；B. Bax表達。肺泡上皮細胞Bcl-2表達降低，Bax表達明顯升高。*
2.4 BMF和MVE暴露對大鼠心臟組織的影響
BMF和MVE暴露12周后引起大鼠心臟組織炎癥反應和纖維化改變。BMF暴露后，大鼠心肌細胞呈輕度變性水腫，排列稍紊亂，可見個別炎癥細胞浸潤。MVE暴露后，大鼠心肌細胞炎癥反應更加顯著，心肌纖維著色不均，肌纖維邊緣模糊，水腫明顯，可見散在心肌細胞核固縮、空泡變，并見出血。對照組的心肌細胞排列整齊，未發現心肌細胞明顯形態異常和炎癥細胞浸潤（圖5a）。Masson染色后可見，對照組心肌細胞形態正常，而BMF組和MVE組大鼠多處心肌細胞間可見纖維組織增生，呈淡藍色（圖5b）。
圖5
BMF和MVE暴露對大鼠心臟組織形態及纖維化的影響（×200）
右上角為放大細節圖。a圖為心臟組織HE染色，與對照組相比，BMF和MVE暴露后大鼠心肌細胞結構紊亂、水腫變性。b圖為心臟組織Masson染色，BMF與MVE組大鼠心肌肌束間纖維組織增生明顯。
BMF和MVE暴露引起大鼠心肌細胞凋亡增加。與對照組相比，BMF和MVE組心肌細胞Bcl-2表達減弱（P<0.01，圖6a），Bax表達增加（P<0.01，圖6b）。表明BMF和MVE暴露促進大鼠心肌細胞的凋亡。
圖6
BMF和MVE暴露對大鼠心臟組織表達Bcl-2和Bax的影響（免疫組織化學×200）
右上角為放大細節圖。a. Bcl-2表達；b. Bax表達。與對照組相比，BMF和MVE組大鼠心肌細胞Bcl-2表達降低，而Bax表達增多。*
3 討論
BMF和MVE分別是我國室內空氣污染和室外大氣PM的主要來源[1]，流行病學研究結果已證實，生物燃料的不完全燃燒和暴露于MVE與慢阻肺、冠心病和肺癌等疾病的高發病率相關[10-12]，因此研究上述兩種主要PM的毒性作用具有實際意義。本實驗通過陰燃木材和怠速摩托車發動機的方式，模擬農村特征燃料燃燒暴露以及城市中MVE暴露，在大鼠模型上研究這兩種PM暴露對心臟和肺組織的影響。
本研究發現，BMF和MVE暴露可引起肺部發生炎癥反應，BALF中細胞總數升高，且主要以肺泡巨噬細胞升高為主。肺泡巨噬細胞作為肺部最重要的免疫細胞之一，是處理吸入肺腔中病原體、抗原和PM的主要細胞，還可以通過分泌多種細胞因子發揮免疫調節和介導炎癥反應[13]。不斷地暴露于PM所誘導的氧化應激和炎癥過程會破壞氣道上皮層，引起肺泡上皮細胞水腫和肺泡腔擴張，氣道上皮損傷等現象。PM暴露引發炎癥反應而引起細胞損傷，一方面為PM經呼吸道吸入肺部后直接損傷呼吸道黏膜和上皮細胞而產生炎癥，另一方面通過募集多種炎癥細胞聚集到肺部后，釋放大量趨化因子和細胞因子，放大炎癥效應[14]。進一步研究發現，PM可以誘導上皮細胞分泌黏蛋白從而維持氣道黏液高分泌狀態[15]，激活Hh信號通路誘發氣道平滑肌遷移和分泌增加[16]，引起人支氣管上皮細胞發生上皮–間充質細胞轉分化（EMT）參與引起氣道重塑[17]。這一研究結果與本實驗中PM暴露組大鼠肺組織間質纖維組織增生結果相符。肺纖維化進展通常會導致氣體交換功能受損、呼吸衰竭，甚至死亡。有研究表明，肺纖維化的驅動因素除了肺成纖維細胞的異常活化和分化外，還有持續的肺泡損傷和不完全修復。經典活化巨噬細胞和交替活化巨噬細胞已在肺損傷、修復和纖維化中得到廣泛研究[18]。因此，提示BALF中巨噬細胞總數的增加與肺纖維化對肺的損傷可能是相互促進、共同作用的。有學者研究發現PM暴露可以通過上調Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3蛋白水平，和下調Bcl-2蛋白水平增加細胞凋亡，表明PM2.5激活了線粒體介導的凋亡通路[19]。本研究同樣發現PM暴露后可誘導肺泡上皮細胞促凋亡因子Bax表達增多，抗凋亡因子Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2比值增加，提示BMF和MVE暴露可促進大鼠肺泡上皮細胞凋亡。當肺泡上皮細胞凋亡異常增加的速度超過這些結構細胞增殖時，最終結果是肺組織的破壞和肺氣腫的發展[20]。總的來說，大氣PM暴露對肺部的影響是多方面的，涉及炎癥反應、纖維化和肺泡上皮凋亡等重要途徑，長期持久的PM暴露可引起肺氣腫和支氣管炎癥，最終導致慢阻肺[21-22]。
PM可通過肺部進入血液循環從而對心臟產生直接的作用，大氣PM暴露對心臟的影響同樣受到越來越多的科研工作者關注[23]。本研究發現，MVE和BMF暴露引起心肌細胞水腫變性，炎癥細胞浸潤增加，心肌排列紊亂，提示PM暴露可引起心肌細胞受損。有研究表明，PM主要通過引起心肌細胞氧化應激、影響心臟自主神經功能、直接的心肌細胞毒性以及改變血液凝固性和黏度這幾個方面而產生對心臟的損傷作用[24-25]。如血液循環中的PM可刺激單核細胞和T細胞，并通過上調內皮細胞微粒（膜聯蛋白Ⅴ/CD41–/CD31+）、促炎癥細胞因子（MCP-1，MIP-1α/β，IL-6和IL-1β）等途徑誘導血管內皮細胞凋亡以及炎癥反應，從而促進動脈粥樣硬化及冠心病的病程發展[9]。在本研究中，BMF和MVE暴露12周后均可引起大鼠心臟組織纖維反應，并且出現大鼠心肌細胞凋亡增加。過度炎癥、纖維化以及異常細胞凋亡是器官組織損傷的關鍵病理驅動因素[26-27]。
本研究尚存在一些局限性。首先，由于樣本受限，未能進行心肺功能方面的檢測，不能證實暴露于BMF和MVE 12周大鼠是否已經產生功能上的損害，達到了疾病狀態。其次，尚需進行更深層次的研究，比如分子機制等方面，進一步探索不同來源的大氣PM對機體的危害。
綜上所述，BMF和MVE暴露12周可引起大鼠心臟和肺組織不同程度的炎癥反應、形態學改變和凋亡增加，研究BMF和MVE暴露有助于我們進一步研究不同來源的空氣污染源暴露可能對機體重要臟器產生的不同影響以及致病機制。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
