引用本文： 李乃健, 戴周麗, 陳熾勇, 張佳歡, 何芳, 李靖, 周玉民, 李冰, 冉丕鑫. 通過糞菌移植建立慢性阻塞性肺疾病腸道菌群研究模型及其效果評價. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(7): 465-471. doi: 10.7507/1671-6205.202104004 復制
越來越多的證據表明胃腸道和呼吸道之間的親密關系，腸道菌群與宿主免疫系統間的相互作用影響著疾病的發生發展，因此提出了腸道與肺部間免疫和炎癥的相關性，既“腸–肺軸”的概念[1]。隨著近年來對腸道菌群認識的加深，腸道菌群失衡對呼吸系統疾病的影響及其可能的機制開始受到科研工作者的關注[2-3]。微生物–宿主之間的相互影響遠遠超出了腸道局部，甚至參與了肺部疾病的發生發展。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種具有多種亞表型的復雜疾病，不僅能夠影響肺部，還能夠影響心血管、胃腸道和免疫系統[4-5]，但其機制尚未完全明了。慢阻肺雖然是呼吸道疾病，但慢阻肺患者的肺外表現，特別對胃腸道的影響卻很常見[5]。最近有研究發現慢阻肺患者的糞便微生物組和代謝組與健康個體的不同，該結果或將有助于尋找慢阻肺的潛在生物標志物[6]。為進一步研究慢阻肺患者腸道菌群的致病機制，我們嘗試通過糞菌移植（FMT）建立慢阻肺腸道菌群小鼠模型并初步評價其效果。現將結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 健康對照和慢阻肺患者入組和糞便收集流程
本研究中的健康對照和慢阻肺患者均來自既往慢阻肺研究隊列（國家重點研發計劃，No._2016YFC1304101）。在我們先前針對該人群的慢阻肺研究中[7-8]，獲得了來自廣州的代表性樣本，健康人群和患者均來自同一居住區，具有相似的生活方式和飲食習慣。所招募的患者和健康受試者在收集糞便前均簽署書面知情同意書。糞便收集流程：統一于清晨，根據 Bristol 糞便性狀評估表[9]收集符合Ⅱ-Ⅴ型糞便性狀的健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者新鮮糞便各 30 例于無菌容器中，干冰速凍并立即保存于–80 ℃ 低溫冰箱。
1.2 肺通氣功能檢測
肺功能資料收集操作具體規程參照美國胸科協會（ATS）及歐洲呼吸學會（ERS）制定的指南[10]，采用意大利 COSMED 公司的多功能肺測試儀進行檢測。主要收集指標包括用力肺活量（FVC）、用力肺活量占預計值百分比（FVC%pred）、第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）、第 1 秒呼氣容積占預計值百分比（FEV1%pred），計算 FEV1 與 FVC 的比值（FEV1/FVC）。
1.3 實驗動物與分組
40 只 6～8 周齡 SPF 級 C57BL/6 雄性小鼠購自廣州中醫藥大學動物中心，動物生產許可證號為 SCXK（粵）2013-0034。所有實驗方案均經廣州醫科大學動物管理與使用委員會批準（倫理編號：GY2018-084）。動物飼養設施中的溫度和相對濕度分別控制在（23±2）℃ 和 40%～70%，連續 12 h 的光照（06: 00-18: 00）和黑暗交替，無限制提供經消毒的食物和飲水。小鼠在適應性喂養 7 d 后，隨機分為四組：磷酸鹽緩沖液（PBS）對照組（PBS FMT 組）、健康對照糞菌移植組（健康對照 FMT 組）、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級患者糞菌移植組（慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組）和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者糞菌移植組（慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 組）。每組各 10 只。
1.4 方法
通過 FMT 建立慢阻肺腸道菌群研究小鼠模型的實驗流程圖見圖 1。主要包括小鼠腸道菌群預處理、FMT 和疾病模型評價。
圖1
實驗流程圖
1.4.1 小鼠腸道菌群預處理
為了耗竭小鼠腸道原有微生物，在飲水中加入混合的廣譜抗生素（氨芐青霉素 1 g/L、硫酸新霉素 1 g/L、甲硝唑 1 g/L 和萬古霉素 0.5 g/L，均購自 Sigma 公司），供自由飲用 21 d 以清除小鼠原有腸道菌群[11]。在 FMT 前 2 天，停止在飲用水中使用廣譜抗生素。隨機收集 20 只小鼠在抗生素使用前后的糞便行 16S rRNA 測序分析。
1.4.2 FMT
分別在 30 例健康對照組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級患者組和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者組中的每一例挑取 0.5 g 糞便，然后按組混合，然后以 1∶4 的比例將糞便重懸于 PBS 中并均質混勻。將混懸液在 4 ℃ 下以 200×g 離心 10 min，收集上清液即為待移植的糞菌液并–80 ℃ 保存。分別對健康對照 FMT 組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 組待移植小鼠，隔天行單次灌胃 100 μL 菌液進行人–小鼠腸道菌群轉移，在 28 d 內共進行 14 次灌胃，PBS FMT 組小鼠以 PBS 灌胃作為對照。
1.4.3 疾病模型評價
在 FMT 后第 29 天采集全血行單個核細胞分析，收集小鼠的糞便行 16S rRNA 測序分析。
根據體重（1% 戊巴比妥鈉，80 mg/kg）通過腹膜內注射麻醉小鼠，通過心臟采血的方法收集全血。為評估 FMT 對小鼠免疫表型的影響，通過流式細胞術對小鼠全血中 T/B 淋巴細胞表型進行分析。T/B 淋巴細胞亞群定義為 B 淋巴細胞（CD3–CD19+），輔助 T 淋巴細胞（CD3+CD4+）和細胞毒性 T 淋巴細胞（CD3+CD8+）。流式細胞術檢測：使用小鼠外周血單核細胞分離試劑盒（索萊寶，北京）分離外周血單個核細胞。首先在冰上將單個核細胞與抗 CD16/32 抗體孵育 15 min，從而阻斷 Fc 受體，離心并洗滌細胞。室溫下將細胞與 BB600 標記的抗小鼠 CD3、APC 標記的抗小鼠 CD19、BV421 標記的抗小鼠 CD8 和 FITC 標記的抗小鼠 CD4（BD Biosciences，美國）抗體混合物孵育 30 min 進行細胞表面染色。孵育結束后洗滌細胞除去未結合的抗體，FACS 裂解溶液（BD Biosciences，美國）固定細胞，CytoFLEX 流式細胞儀（貝克曼庫爾特，美國）上機檢測，并使用 FlowJo 軟件進行分析。
使用 HiPure Stool DNA 試劑盒（Magen BioSciences，美國）對 100 mg 人和小鼠糞便樣品進行總細菌 DNA 提取。以每個樣品中提取的 DNA 為模板，PCR 擴增 16S rRNA 基因的 V3-V4 區域，根據 Illumina 基因組測序指南進行 16S rRNA 基因擴增、轉錄、標記以及雜交[12]。16S 擴增子 PCR 正向引物 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3'；反向引物 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3'[13]。在 25 μL 的反應體系中進行 PCR 擴增，其中包含 2.5 μL 微生物 DNA（5 ng/μL），各 5 μL 的正反引物（1 μmol/L）和 12.5 μL 的 2× KAPA HiFi 高保真熱啟動 DNA 聚合酶預混液（KAPA Biosystems 公司，美國）。AMPure XP 磁珠（貝克曼庫爾特公司，美國）對 16S V3-V4 區擴增子產物進行純化，Nextera XT Index Kit（Illumina 公司，美國）制備 MiSeq 用文庫，反應條件和步驟詳見參考文獻[12]。最后在 RiboBio 基因組中心（廣東，廣州）的 Illumina Miseq PE250 平臺上進行測序分析。測序下機的數據經過處理后進行生物信息學分析[14]：對原始數據進行過濾，去除低質量數據，得到 clean data 后進行后續分析；將 Paired-end reads 拼接為 Tags，并且去冗余，獲取 Unique Tags；對 Unique Tags 進行聚類，生成操作分類單元（OTU）；利用已經存在的 16S 數據庫對 OTU 序列進行物種注釋；利用生成的 OTU 進行物種分類、統計和樣品間 α 多樣性分析，以評估小鼠腸道菌群的豐度和多樣性，其中，OTU 的數值初步說明了物種的豐富程度，Chao 1 和 Shannon 指數用于估算群落多樣性的高低。本研究原始測序數據已上傳至 Sequence Read Archive 數據庫（
1.5 統計學方法
采用 SPSS 24.0 統計軟件。符合正態分布數據以均數±標準差（
±s）表示，多組間比較分析采用單因素方差分析，使用 Bonferroni 方法對 P 值進行校正。不符合正態分布的變量以中位數（四分位數間距）［M（Q）］表示。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 入組對象一般特征
研究納入健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者各 30 例，一般人口學特征以及肺功能差異如表 1 所示。與健康對照組相比，慢阻肺患者組吸煙指數明顯升高，體重指數和肺功能明顯下降。
表1
30 例健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ 級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者一般特征（
）
2.2 廣譜抗生素預處理對小鼠腸道菌群的影響
經 α 多樣性分析后發現，與抗生素處理前相比經廣譜抗生素預處理 21 d 后，小鼠腸道的 OTU、Chao 1 和 Shannon 指數均顯著下降（P<0.001，圖 2），證實在廣譜抗生素預處理后小鼠腸道細菌的豐富程度和多樣性顯著下降，自身腸道菌群受到明顯耗竭。
圖2
廣譜抗生素預處理前后小鼠腸道菌群的變化
經廣譜抗生素預處理后小鼠腸道菌群顯著耗竭，表現為物種的豐富程度減少（a）和多樣性下降（b 和 c）。
2.3 FMT 后小鼠腸道菌群定植效果評價
與 PBS FMT 組相比，接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者 FMT 的受體小鼠其 OTU 顯著升高（P<0.01，圖 3a）。同樣，代表菌群多樣性指數的 Chao 1 和 Shannon 指數在接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者 FMT 的受體小鼠中亦顯著升高（P<0.01 或 P<0.05，圖 3b、c）。但是，OTU、Chao 1 和 Shannon 指數在健康對照 FMT 組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 組中無顯著性差異。在門水平，來自 PBS FMT 組、健康 FMT 組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組受體小鼠中所有的糞便樣本均包含四個主要細菌門（圖 4a）。在擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門和放線門中，PBS FMT 組和其余 3 組 FMT 組之間細菌門的相對豐度具有顯著性差異（P<0.05 或 P<0.01，圖 4a，表 2）。接受 FMT 的受體小鼠表現出比 PBS FMT 組更高的菌群豐度和多樣性，在細菌組成上亦存在顯著性差異。
圖3
FMT 后四組實驗小鼠腸道菌群變化
與 PBS 移植組相比，接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ或慢阻肺Ⅲ-Ⅳ患者的 FMT 后，受體小鼠腸道菌群物種的豐富程度（a）和多樣性指數（b 和 c）均得到顯著升高，但健康對照 FMT 組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組三組間無明顯差異。
圖4
FMT 后四組實驗小鼠腸道菌群組成差異以及原糞菌液菌群與實驗小鼠腸道菌群差異
a. FMT 后四組實驗小鼠腸道菌群組成差異。四組實驗小鼠糞便樣本均包含擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門和放線門，占比超過 80% 以上。與 PBS FMT 組相比，接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者 FMT 的受體小鼠腸道菌群組成出現顯著性差異。b-d. 原糞菌液菌群與實驗小鼠腸道菌群差異。
表2
FMT 后四組實驗小鼠腸道菌群差異［%，M（Q）］
與原糞菌液中的菌群進行比較，接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ或慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 后受體小鼠腸道菌群與原糞菌液在細菌組成上存在一定差異，均主要表現在擬桿菌門豐度降低，厚壁菌門和放線菌門豐度升高（P<0.05 或 P<0.01，圖 4b～d），而變形菌門豐度基本相似。
2.4 FMT 對小鼠外周血免疫功能的影響
與健康對照組相比，接受慢阻肺Ⅰ-Ⅱ患者和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ患者糞便菌群的受體小鼠其外周血 CD3+ T 淋巴細胞、輔助 T 淋巴細胞和細胞毒性 T 淋巴細胞（P<0.05 或 P<0.01，圖 5a-c）百分比明顯升高，而 B 淋巴細胞百分比顯著下降（P<0.05，圖 5d）。
圖5
FMT 對實驗小鼠外周血 T/B 淋巴細胞表型的影響
a. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組 CD3+細胞百分比較健康對照 FMT 組升高。b. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組輔助 T 淋巴細胞（CD3+CD4+）百分比較健康對照 FMT 組升高。c. 慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組細胞毒性 T 淋巴細胞（CD3+CD8+）百分比較健康對照 FMT 組升高。d. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組 B 淋巴細胞（CD3–CD19+）百分比較健康對照 FMT 組減少。結果顯示：±
3 討論
迄今為止，開始有少數研究報道了腸道菌群與慢阻肺之間存在關聯[6, 15-16]，腸道菌群失衡在慢阻肺發病中的作用及其機制開始受到關注。FMT 小鼠模型已經廣泛應用于對炎癥性腸病、自閉癥、肺炎和腫瘤等疾病中出現的腸道菌群失衡的研究[11, 17-19]，但有關如何建立慢阻肺的腸道菌群研究模型卻鮮有報道。在本研究中，證實了通過 FMT，可將慢阻肺患者腸道菌群移植到受體小鼠體內并定植，重建了受體小鼠腸道菌群，并且經過移植之后受體小鼠具有部分原慢阻肺患者腸道菌群特征，并在小鼠體內引起了免疫功能失調。
雖然慢阻肺是呼吸道疾病，但它與慢性胃腸道疾病常常并存[5]，腸道菌群失衡對慢阻肺發生發展的影響仍知之甚少。Bowerman 等[6]發現慢阻肺患者和健康對照組兩組間的腸道菌群有 146 種菌群存在顯著性差異，包括鏈球菌 sp000187445、前庭鏈球菌和鏈霉菌在內的多個種屬與慢阻肺患者的肺功能下降相關。在建立吸煙誘導的慢阻肺小鼠模型上，通過同籠飼養、抗生素處理和 FMT 實驗，證實了腸道菌群可影響慢阻肺的進展[15]。我們前期研究發現，在大氣顆粒物暴露誘導的慢阻肺大鼠模型中，隨著暴露時間的延長大鼠逐漸出現腸道菌群失調，短鏈脂肪酸減少和腸道菌群移位，這種變化與肺氣腫嚴重程度成正相關，在動物模型上提示腸道菌群失衡可能參與了慢阻肺的發生發展[16]。上述有限的研究將慢阻肺和腸道菌群失衡建立起了聯系，而通過 FMT 建立有效的慢阻肺腸道菌群模型則有助于研究的進一步開展。
腸道菌群以多種方式與人類宿主保持共生關系，包括調節宿主免疫力、消化食物、調控腸道內分泌和神經信號、影響藥物作用和代謝、清除毒素以及產生影響宿主的多種化合物[20]。健康的腸道菌群可通過暴露結構配體［如脂多糖（LPS）和（或）肽聚糖］和分泌代謝物［如短鏈脂肪酸（SCFA）］來維持腸道內局部免疫應答的平衡和維持屏障完整性[21]。綜合既往文獻報道腸道菌群失衡參與慢阻肺發病的可能機制如下：各種原因所致的腸道菌群失衡，一方面引起腸道菌群有益代謝產物（如 SCFA、色氨酸代謝物和次級膽汁酸等）減少而有害代謝產物（如三甲胺）增加，導致腸道屏障受損、腸道上皮細胞暴露和腸道通透性增加；另一方面腸道菌群比例失衡引起條件致病菌比例增多，導致腸道菌群移位，微生物產物（如 LPS）和有害代謝產物與免疫細胞的相互作用[22-23]。上述兩方面結果均可導致腸道局部免疫被激活，釋放促炎性細胞因子入血并通過血液循環到達肺部，進而啟動肺部的炎癥級聯反應，最終引起氣道重塑、黏液高分泌和細胞基質破壞等病理改變。
FMT 作為重建腸道菌群的方法，已被證明在多種代謝和免疫性疾病中取得良好的臨床療效，也在如潰瘍性結腸炎、克羅恩病和結腸癌等多種腸道疾病模型上得到廣泛的應用。FMT 后菌群是否能夠成功定植在受體小鼠腸道是 FMT 產生效果的基礎，而供體和宿主之間種屬的差異以及供體選擇對于 FMT 的成功至關重要[24]。既往研究結果顯示，與抗生素耗竭小鼠腸道菌群這種方法相比，采用無菌小鼠進行糞 FMT 在效果上更為精準，可免受腸道本底菌群的影響[25]，但無菌小鼠存在價格昂貴、飼養條件苛刻和無法暴露造模等缺點。本研究中采用廣譜抗生素預處理小鼠后再進行 FMT，實驗結果顯示接受 FMT 的受體小鼠表現出比 PBS FMT 組更高的菌群豐度和多樣性，在細菌組成上保留有原慢阻肺患者腸道菌群部分特征，證實了慢阻肺患者腸道菌群可成功進行移植。
本研究發現在移植慢阻肺患者糞便后受體小鼠出現免疫功能失調。慢阻肺 FMT 組與健康對照 FMT 組相比，CD3+CD4+和 CD3+CD8+ T 細胞的百分比明顯升高。既往研究顯示適應性免疫反應與慢阻肺的發病有關，尤其是 CD4+和 CD8+ T 細胞的數量和功能異常[26-28]。有研究證實腸道菌群介導的慢性低度炎癥以及對免疫功能的影響，與肥胖、癌癥等疾病的發生發展有關[29-30]，但腸道菌群介導的慢性炎癥是否與慢阻肺相關目前尚不清楚。我們的小鼠實驗支持了慢阻肺中微生物群和腸肺軸之間致病聯系的觀點[1, 31]。但本研究仍存在以下幾點局限性。首先，我們是在橫斷面下對健康對照和慢阻肺患者的腸道微生物群進行測序，并未對所獲得的數據進行深入分析，并且在缺乏縱向或干預性研究設計的情況下，很難確定腸道微生物群失調是慢阻肺的原因還是結果。其次，本研究是使用來自相同組別的健康對照和慢阻肺患者亞組的糞菌液進行混合后再移植，因此單個患者腸道菌群的特征對 FMT 結果的影響仍有待確定。第三，腸道菌群代表了一個龐大的微生物群落，每種細菌物種都應該在小鼠中進行單個菌群移植，以系統分析慢阻肺患者腸道菌群對宿主影響。
綜上所述，通過 FMT 可成功建立慢阻肺腸道菌群研究模型，但腸道菌群在慢阻肺發病中的作用及其可能的機制仍有待進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
越來越多的證據表明胃腸道和呼吸道之間的親密關系，腸道菌群與宿主免疫系統間的相互作用影響著疾病的發生發展，因此提出了腸道與肺部間免疫和炎癥的相關性，既“腸–肺軸”的概念[1]。隨著近年來對腸道菌群認識的加深，腸道菌群失衡對呼吸系統疾病的影響及其可能的機制開始受到科研工作者的關注[2-3]。微生物–宿主之間的相互影響遠遠超出了腸道局部，甚至參與了肺部疾病的發生發展。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種具有多種亞表型的復雜疾病，不僅能夠影響肺部，還能夠影響心血管、胃腸道和免疫系統[4-5]，但其機制尚未完全明了。慢阻肺雖然是呼吸道疾病，但慢阻肺患者的肺外表現，特別對胃腸道的影響卻很常見[5]。最近有研究發現慢阻肺患者的糞便微生物組和代謝組與健康個體的不同，該結果或將有助于尋找慢阻肺的潛在生物標志物[6]。為進一步研究慢阻肺患者腸道菌群的致病機制，我們嘗試通過糞菌移植（FMT）建立慢阻肺腸道菌群小鼠模型并初步評價其效果。現將結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 健康對照和慢阻肺患者入組和糞便收集流程
本研究中的健康對照和慢阻肺患者均來自既往慢阻肺研究隊列（國家重點研發計劃，No._2016YFC1304101）。在我們先前針對該人群的慢阻肺研究中[7-8]，獲得了來自廣州的代表性樣本，健康人群和患者均來自同一居住區，具有相似的生活方式和飲食習慣。所招募的患者和健康受試者在收集糞便前均簽署書面知情同意書。糞便收集流程：統一于清晨，根據 Bristol 糞便性狀評估表[9]收集符合Ⅱ-Ⅴ型糞便性狀的健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者新鮮糞便各 30 例于無菌容器中，干冰速凍并立即保存于–80 ℃ 低溫冰箱。
1.2 肺通氣功能檢測
肺功能資料收集操作具體規程參照美國胸科協會（ATS）及歐洲呼吸學會（ERS）制定的指南[10]，采用意大利 COSMED 公司的多功能肺測試儀進行檢測。主要收集指標包括用力肺活量（FVC）、用力肺活量占預計值百分比（FVC%pred）、第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）、第 1 秒呼氣容積占預計值百分比（FEV1%pred），計算 FEV1 與 FVC 的比值（FEV1/FVC）。
1.3 實驗動物與分組
40 只 6～8 周齡 SPF 級 C57BL/6 雄性小鼠購自廣州中醫藥大學動物中心，動物生產許可證號為 SCXK（粵）2013-0034。所有實驗方案均經廣州醫科大學動物管理與使用委員會批準（倫理編號：GY2018-084）。動物飼養設施中的溫度和相對濕度分別控制在（23±2）℃ 和 40%～70%，連續 12 h 的光照（06: 00-18: 00）和黑暗交替，無限制提供經消毒的食物和飲水。小鼠在適應性喂養 7 d 后，隨機分為四組：磷酸鹽緩沖液（PBS）對照組（PBS FMT 組）、健康對照糞菌移植組（健康對照 FMT 組）、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級患者糞菌移植組（慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組）和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者糞菌移植組（慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 組）。每組各 10 只。
1.4 方法
通過 FMT 建立慢阻肺腸道菌群研究小鼠模型的實驗流程圖見圖 1。主要包括小鼠腸道菌群預處理、FMT 和疾病模型評價。
圖1
實驗流程圖
1.4.1 小鼠腸道菌群預處理
為了耗竭小鼠腸道原有微生物，在飲水中加入混合的廣譜抗生素（氨芐青霉素 1 g/L、硫酸新霉素 1 g/L、甲硝唑 1 g/L 和萬古霉素 0.5 g/L，均購自 Sigma 公司），供自由飲用 21 d 以清除小鼠原有腸道菌群[11]。在 FMT 前 2 天，停止在飲用水中使用廣譜抗生素。隨機收集 20 只小鼠在抗生素使用前后的糞便行 16S rRNA 測序分析。
1.4.2 FMT
分別在 30 例健康對照組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級患者組和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者組中的每一例挑取 0.5 g 糞便，然后按組混合，然后以 1∶4 的比例將糞便重懸于 PBS 中并均質混勻。將混懸液在 4 ℃ 下以 200×g 離心 10 min，收集上清液即為待移植的糞菌液并–80 ℃ 保存。分別對健康對照 FMT 組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 組待移植小鼠，隔天行單次灌胃 100 μL 菌液進行人–小鼠腸道菌群轉移，在 28 d 內共進行 14 次灌胃，PBS FMT 組小鼠以 PBS 灌胃作為對照。
1.4.3 疾病模型評價
在 FMT 后第 29 天采集全血行單個核細胞分析，收集小鼠的糞便行 16S rRNA 測序分析。
根據體重（1% 戊巴比妥鈉，80 mg/kg）通過腹膜內注射麻醉小鼠，通過心臟采血的方法收集全血。為評估 FMT 對小鼠免疫表型的影響，通過流式細胞術對小鼠全血中 T/B 淋巴細胞表型進行分析。T/B 淋巴細胞亞群定義為 B 淋巴細胞（CD3–CD19+），輔助 T 淋巴細胞（CD3+CD4+）和細胞毒性 T 淋巴細胞（CD3+CD8+）。流式細胞術檢測：使用小鼠外周血單核細胞分離試劑盒（索萊寶，北京）分離外周血單個核細胞。首先在冰上將單個核細胞與抗 CD16/32 抗體孵育 15 min，從而阻斷 Fc 受體，離心并洗滌細胞。室溫下將細胞與 BB600 標記的抗小鼠 CD3、APC 標記的抗小鼠 CD19、BV421 標記的抗小鼠 CD8 和 FITC 標記的抗小鼠 CD4（BD Biosciences，美國）抗體混合物孵育 30 min 進行細胞表面染色。孵育結束后洗滌細胞除去未結合的抗體，FACS 裂解溶液（BD Biosciences，美國）固定細胞，CytoFLEX 流式細胞儀（貝克曼庫爾特，美國）上機檢測，并使用 FlowJo 軟件進行分析。
使用 HiPure Stool DNA 試劑盒（Magen BioSciences，美國）對 100 mg 人和小鼠糞便樣品進行總細菌 DNA 提取。以每個樣品中提取的 DNA 為模板，PCR 擴增 16S rRNA 基因的 V3-V4 區域，根據 Illumina 基因組測序指南進行 16S rRNA 基因擴增、轉錄、標記以及雜交[12]。16S 擴增子 PCR 正向引物 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3'；反向引物 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3'[13]。在 25 μL 的反應體系中進行 PCR 擴增，其中包含 2.5 μL 微生物 DNA（5 ng/μL），各 5 μL 的正反引物（1 μmol/L）和 12.5 μL 的 2× KAPA HiFi 高保真熱啟動 DNA 聚合酶預混液（KAPA Biosystems 公司，美國）。AMPure XP 磁珠（貝克曼庫爾特公司，美國）對 16S V3-V4 區擴增子產物進行純化，Nextera XT Index Kit（Illumina 公司，美國）制備 MiSeq 用文庫，反應條件和步驟詳見參考文獻[12]。最后在 RiboBio 基因組中心（廣東，廣州）的 Illumina Miseq PE250 平臺上進行測序分析。測序下機的數據經過處理后進行生物信息學分析[14]：對原始數據進行過濾，去除低質量數據，得到 clean data 后進行后續分析；將 Paired-end reads 拼接為 Tags，并且去冗余，獲取 Unique Tags；對 Unique Tags 進行聚類，生成操作分類單元（OTU）；利用已經存在的 16S 數據庫對 OTU 序列進行物種注釋；利用生成的 OTU 進行物種分類、統計和樣品間 α 多樣性分析，以評估小鼠腸道菌群的豐度和多樣性，其中，OTU 的數值初步說明了物種的豐富程度，Chao 1 和 Shannon 指數用于估算群落多樣性的高低。本研究原始測序數據已上傳至 Sequence Read Archive 數據庫（
1.5 統計學方法
采用 SPSS 24.0 統計軟件。符合正態分布數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較分析采用單因素方差分析，使用 Bonferroni 方法對 P 值進行校正。不符合正態分布的變量以中位數（四分位數間距）［M（Q）］表示。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 入組對象一般特征
研究納入健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者各 30 例，一般人口學特征以及肺功能差異如表 1 所示。與健康對照組相比，慢阻肺患者組吸煙指數明顯升高，體重指數和肺功能明顯下降。
表1
30 例健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ 級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者一般特征（）
2.2 廣譜抗生素預處理對小鼠腸道菌群的影響
經 α 多樣性分析后發現，與抗生素處理前相比經廣譜抗生素預處理 21 d 后，小鼠腸道的 OTU、Chao 1 和 Shannon 指數均顯著下降（P<0.001，圖 2），證實在廣譜抗生素預處理后小鼠腸道細菌的豐富程度和多樣性顯著下降，自身腸道菌群受到明顯耗竭。
圖2
廣譜抗生素預處理前后小鼠腸道菌群的變化
經廣譜抗生素預處理后小鼠腸道菌群顯著耗竭，表現為物種的豐富程度減少（a）和多樣性下降（b 和 c）。
2.3 FMT 后小鼠腸道菌群定植效果評價
與 PBS FMT 組相比，接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者 FMT 的受體小鼠其 OTU 顯著升高（P<0.01，圖 3a）。同樣，代表菌群多樣性指數的 Chao 1 和 Shannon 指數在接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者 FMT 的受體小鼠中亦顯著升高（P<0.01 或 P<0.05，圖 3b、c）。但是，OTU、Chao 1 和 Shannon 指數在健康對照 FMT 組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 組中無顯著性差異。在門水平，來自 PBS FMT 組、健康 FMT 組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組受體小鼠中所有的糞便樣本均包含四個主要細菌門（圖 4a）。在擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門和放線門中，PBS FMT 組和其余 3 組 FMT 組之間細菌門的相對豐度具有顯著性差異（P<0.05 或 P<0.01，圖 4a，表 2）。接受 FMT 的受體小鼠表現出比 PBS FMT 組更高的菌群豐度和多樣性，在細菌組成上亦存在顯著性差異。
圖3
FMT 后四組實驗小鼠腸道菌群變化
與 PBS 移植組相比，接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ或慢阻肺Ⅲ-Ⅳ患者的 FMT 后，受體小鼠腸道菌群物種的豐富程度（a）和多樣性指數（b 和 c）均得到顯著升高，但健康對照 FMT 組、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組三組間無明顯差異。
圖4
FMT 后四組實驗小鼠腸道菌群組成差異以及原糞菌液菌群與實驗小鼠腸道菌群差異
a. FMT 后四組實驗小鼠腸道菌群組成差異。四組實驗小鼠糞便樣本均包含擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門和放線門，占比超過 80% 以上。與 PBS FMT 組相比，接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ級和慢阻肺Ⅲ-Ⅳ級患者 FMT 的受體小鼠腸道菌群組成出現顯著性差異。b-d. 原糞菌液菌群與實驗小鼠腸道菌群差異。
表2
FMT 后四組實驗小鼠腸道菌群差異［%，M（Q）］
與原糞菌液中的菌群進行比較，接受健康對照、慢阻肺Ⅰ-Ⅱ或慢阻肺Ⅲ-Ⅳ FMT 后受體小鼠腸道菌群與原糞菌液在細菌組成上存在一定差異，均主要表現在擬桿菌門豐度降低，厚壁菌門和放線菌門豐度升高（P<0.05 或 P<0.01，圖 4b～d），而變形菌門豐度基本相似。
2.4 FMT 對小鼠外周血免疫功能的影響
與健康對照組相比，接受慢阻肺Ⅰ-Ⅱ患者和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ患者糞便菌群的受體小鼠其外周血 CD3+ T 淋巴細胞、輔助 T 淋巴細胞和細胞毒性 T 淋巴細胞（P<0.05 或 P<0.01，圖 5a-c）百分比明顯升高，而 B 淋巴細胞百分比顯著下降（P<0.05，圖 5d）。
圖5
FMT 對實驗小鼠外周血 T/B 淋巴細胞表型的影響
a. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組 CD3+細胞百分比較健康對照 FMT 組升高。b. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組輔助 T 淋巴細胞（CD3+CD4+）百分比較健康對照 FMT 組升高。c. 慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組細胞毒性 T 淋巴細胞（CD3+CD8+）百分比較健康對照 FMT 組升高。d. 慢阻肺Ⅰ-Ⅱ FMT 組和慢阻肺Ⅲ–Ⅳ FMT 組 B 淋巴細胞（CD3–CD19+）百分比較健康對照 FMT 組減少。結果顯示：±
3 討論
迄今為止，開始有少數研究報道了腸道菌群與慢阻肺之間存在關聯[6, 15-16]，腸道菌群失衡在慢阻肺發病中的作用及其機制開始受到關注。FMT 小鼠模型已經廣泛應用于對炎癥性腸病、自閉癥、肺炎和腫瘤等疾病中出現的腸道菌群失衡的研究[11, 17-19]，但有關如何建立慢阻肺的腸道菌群研究模型卻鮮有報道。在本研究中，證實了通過 FMT，可將慢阻肺患者腸道菌群移植到受體小鼠體內并定植，重建了受體小鼠腸道菌群，并且經過移植之后受體小鼠具有部分原慢阻肺患者腸道菌群特征，并在小鼠體內引起了免疫功能失調。
雖然慢阻肺是呼吸道疾病，但它與慢性胃腸道疾病常常并存[5]，腸道菌群失衡對慢阻肺發生發展的影響仍知之甚少。Bowerman 等[6]發現慢阻肺患者和健康對照組兩組間的腸道菌群有 146 種菌群存在顯著性差異，包括鏈球菌 sp000187445、前庭鏈球菌和鏈霉菌在內的多個種屬與慢阻肺患者的肺功能下降相關。在建立吸煙誘導的慢阻肺小鼠模型上，通過同籠飼養、抗生素處理和 FMT 實驗，證實了腸道菌群可影響慢阻肺的進展[15]。我們前期研究發現，在大氣顆粒物暴露誘導的慢阻肺大鼠模型中，隨著暴露時間的延長大鼠逐漸出現腸道菌群失調，短鏈脂肪酸減少和腸道菌群移位，這種變化與肺氣腫嚴重程度成正相關，在動物模型上提示腸道菌群失衡可能參與了慢阻肺的發生發展[16]。上述有限的研究將慢阻肺和腸道菌群失衡建立起了聯系，而通過 FMT 建立有效的慢阻肺腸道菌群模型則有助于研究的進一步開展。
腸道菌群以多種方式與人類宿主保持共生關系，包括調節宿主免疫力、消化食物、調控腸道內分泌和神經信號、影響藥物作用和代謝、清除毒素以及產生影響宿主的多種化合物[20]。健康的腸道菌群可通過暴露結構配體［如脂多糖（LPS）和（或）肽聚糖］和分泌代謝物［如短鏈脂肪酸（SCFA）］來維持腸道內局部免疫應答的平衡和維持屏障完整性[21]。綜合既往文獻報道腸道菌群失衡參與慢阻肺發病的可能機制如下：各種原因所致的腸道菌群失衡，一方面引起腸道菌群有益代謝產物（如 SCFA、色氨酸代謝物和次級膽汁酸等）減少而有害代謝產物（如三甲胺）增加，導致腸道屏障受損、腸道上皮細胞暴露和腸道通透性增加；另一方面腸道菌群比例失衡引起條件致病菌比例增多，導致腸道菌群移位，微生物產物（如 LPS）和有害代謝產物與免疫細胞的相互作用[22-23]。上述兩方面結果均可導致腸道局部免疫被激活，釋放促炎性細胞因子入血并通過血液循環到達肺部，進而啟動肺部的炎癥級聯反應，最終引起氣道重塑、黏液高分泌和細胞基質破壞等病理改變。
FMT 作為重建腸道菌群的方法，已被證明在多種代謝和免疫性疾病中取得良好的臨床療效，也在如潰瘍性結腸炎、克羅恩病和結腸癌等多種腸道疾病模型上得到廣泛的應用。FMT 后菌群是否能夠成功定植在受體小鼠腸道是 FMT 產生效果的基礎，而供體和宿主之間種屬的差異以及供體選擇對于 FMT 的成功至關重要[24]。既往研究結果顯示，與抗生素耗竭小鼠腸道菌群這種方法相比，采用無菌小鼠進行糞 FMT 在效果上更為精準，可免受腸道本底菌群的影響[25]，但無菌小鼠存在價格昂貴、飼養條件苛刻和無法暴露造模等缺點。本研究中采用廣譜抗生素預處理小鼠后再進行 FMT，實驗結果顯示接受 FMT 的受體小鼠表現出比 PBS FMT 組更高的菌群豐度和多樣性，在細菌組成上保留有原慢阻肺患者腸道菌群部分特征，證實了慢阻肺患者腸道菌群可成功進行移植。
本研究發現在移植慢阻肺患者糞便后受體小鼠出現免疫功能失調。慢阻肺 FMT 組與健康對照 FMT 組相比，CD3+CD4+和 CD3+CD8+ T 細胞的百分比明顯升高。既往研究顯示適應性免疫反應與慢阻肺的發病有關，尤其是 CD4+和 CD8+ T 細胞的數量和功能異常[26-28]。有研究證實腸道菌群介導的慢性低度炎癥以及對免疫功能的影響，與肥胖、癌癥等疾病的發生發展有關[29-30]，但腸道菌群介導的慢性炎癥是否與慢阻肺相關目前尚不清楚。我們的小鼠實驗支持了慢阻肺中微生物群和腸肺軸之間致病聯系的觀點[1, 31]。但本研究仍存在以下幾點局限性。首先，我們是在橫斷面下對健康對照和慢阻肺患者的腸道微生物群進行測序，并未對所獲得的數據進行深入分析，并且在缺乏縱向或干預性研究設計的情況下，很難確定腸道微生物群失調是慢阻肺的原因還是結果。其次，本研究是使用來自相同組別的健康對照和慢阻肺患者亞組的糞菌液進行混合后再移植，因此單個患者腸道菌群的特征對 FMT 結果的影響仍有待確定。第三，腸道菌群代表了一個龐大的微生物群落，每種細菌物種都應該在小鼠中進行單個菌群移植，以系統分析慢阻肺患者腸道菌群對宿主影響。
綜上所述，通過 FMT 可成功建立慢阻肺腸道菌群研究模型，但腸道菌群在慢阻肺發病中的作用及其可能的機制仍有待進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
