引用本文： 陳小菊, 冷長燕, 劉琴, 張文波. 鈣結合蛋白S100A8/A9在慢性阻塞性肺疾病大鼠中的作用及機制研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(12): 837-841. doi: 10.7507/1671-6205.202103035 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是呼吸系統最常見的慢性氣道炎癥性疾病，以持續氣流受限為主要特征，并且這種氣流受限呈進行性發展。慢阻肺主要與吸煙、反復感染和環境污染等有密切關系。鈣結合蛋白S100A8、S100A9是S100蛋白家族中的主要成員，常以二聚體S100A8/A9的形式存在，其主要來源于激活的中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等，在胞外可通過與Toll樣受體4（TLR4）和髓樣分化分子88（MyD88）結合而參與多種炎癥疾病的發生[1-2]。有研究證實S100A8/A9在肺癌、急性呼吸窘迫綜合征、牙周炎、心肌梗死等疾病中有重要作用[3-6]。本研究通過觀察煙熏聯合氣管內注射內毒素建立的慢阻肺大鼠模型中支氣管肺泡灌洗液（BALF）和血清中S100A8/A9蛋白的濃度變化，大鼠肺組織中S100A8、S100A9 mRNA及S100A8/A9蛋白的表達，以及由S100A8/A9介導的TLR4和MyD88 mRNA及蛋白的表達，探討S100A8/A9在煙熏聯合氣管內注射內毒素所建立的慢阻肺大鼠模型中的作用及機制。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗動物：雄性無特定病原級Wistar大鼠12只，購買并飼養于川北醫學院實驗動物中心［資質號：SCXK（川）2018-18］，8周齡，體重190～210 g，于自然光照條件下統一喂養，均自由飲水、攝食。
主要試劑及儀器：紅梅牌香煙（云南玉溪煙卷廠）、脂多糖（Sigma公司）、S100A8/A9 酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（Biolegend公司）、兔抗MyD88單抗（Novus公司）、鼠抗TLR4單抗（Abcam公司）、鼠抗S100A8/A9單抗（Abcam公司）、引物及定量PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）、SABC免疫組織化學試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、DAB kit AR1022（武漢博士德生物工程有限公司）、酶標儀（Bio-Tek公司)、PCR儀（ABI公司）、全自動免疫組織化學染色機（Thermoscientific公司）等。
1.2 方法
1.2.1 建立慢阻肺大鼠模型
大鼠適應性飼養1周后被隨機分成正常對照組和煙熏聯合內毒素處理組（慢阻肺組），每組各6只。參照陳延偉等[7]的實驗方法制備慢阻肺大鼠模型，慢阻肺組大鼠被放入45 cm×45 cm×30 cm大小的有機玻璃煙熏箱內，被動吸入紅梅牌香煙，每次10支，每天2次，每次30 min，共1個月；同時在第1天、第14天經氣管內注射200 mg/kg的內毒素。正常組在第1天、第14天氣管內滴注生理鹽水200μL，余時間不做任何處理。
1.2.2 血漿、BALF及肺組織的收集
待造模結束后第2天經腹腔注射3%戊巴比妥（30 mg/kg）將大鼠麻醉，將其固定于操作臺上，經腹主動脈采血3 mL，于4 ℃、3000 r/min離心15 min，然后收集血漿，于–80 ℃保存。用止血鉗鈍性分離大鼠頸部組織，暴露其氣管并結扎右肺，在第4與第5氣管軟骨之間行–2 mm的橫切口，將外徑約為1.8 mm的輸液管插入氣道內2 cm左右，再將已經預熱為37 ℃的生理鹽水4 mL注入左肺，輕柔肺部約2～3 min，緩慢回抽，收集回抽的BALF，重復4～5次。將BALF于4 ℃、1500 r/min離心10 min，收集上清液，于–80 ℃保存。將大鼠左肺分成約100 mg的小塊并立即置于液氮中，用于mRNA檢測。
1.2.3 大鼠肺組織標本制備及病理學檢測
取大鼠右肺放置于4%的多聚甲醛中固定，24 h后石蠟包埋切片，每個標本準備5張切片，用于蘇木素–伊紅（HE）染色，觀察病理學形態。采用圖像分析系統測量反映肺氣腫指標平均肺泡數（MAN）、肺平均內襯間隔（MLI）和肺泡腔面積占總面積的比值（PAA）[8]。
1.2.4 大鼠BALF和血漿中S100A8/A9蛋白檢測
采用ELISA檢測大鼠血漿和BALF中S100A8/A9蛋白的濃度，操作步驟按照說明書上進行。
1.2.5 大鼠肺組織中S100A8、S100A9、TLR4和MyD88 mRNA的表達
采用熒光定量PCR法檢測大鼠肺組織中S100A8、S100A9、MyD88、TLR4的mRNA表達情況。取出大鼠左肺肺組織，提取其總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA，S100A8上游引物5’-ACAGGGATGACTTCAGGAAAATG-3’，下游引物5’-CCACCCTTATCACCAACACAAG-3’，產物長度147 bp；S100A9上游引物5’-CTGAACAAGGCGGAATTCAAAG-3’，下游引物5’-TTCTCATGACAGGCAAAGATCAAC-3’，長185 bp；TLR4上游引物5’-CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTA-3’，下游引物5’-GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3’，產物長度177 bp；MyD88上游引物5’-TATACCAACCCTTGCACCAAGTC-3’，下游引物5’-TCAGGCTCCAAGTCAGCTCATC-3’，長121 bp；內參β-肌動蛋白上游引物5’-AGGCCAAGTGAAAAGATG-3’，下游引物5’-ACCAGAGGCATACAGGGACAA-3’，產物長度101 bp；擴增條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 32 s，共40個循環，反應體系為20 μL，基因表達量分析采用2－△△Ct計算。
1.2.6 免疫組織化學法檢測大鼠肺組織中S100A8/A9、TLR4和MyD88蛋白表達
采用免疫組織化學法檢測兩組大鼠肺組織中S100A8/A9、TLR4和MyD88蛋白的表達情況，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，陽性結果為棕黃色。OLYMPUS DP70顯微鏡高倍視野下觀察，每張切片不重復隨機采圖5張，采用Image-Pro Plus 6.0圖文分析軟件測量每張圖片平均光密度值，取每張切片的平均值作為該樣本S100A8/A9、TLR4和MyD88的蛋白表達含量。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件。呈正態分布的計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，采用獨立樣本t檢驗進行兩組之間比較；采用Pearson相關進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織病理形態學差異
正常組大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列整齊，肺泡結構完整（圖1a）；慢阻肺組大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列紊亂，部分脫落、壞死，黏膜下見大量炎癥細胞浸潤，支氣管管壁增厚，管腔內充滿較多的炎癥細胞和分泌物。肺泡結構紊亂，肺泡壁明顯變薄，甚至斷裂，肺泡擴張，部分融合（圖1b、1c）。
圖1
大鼠肺組織病理像（HE×200）
a. 正常對照組：大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列整齊，肺泡結構完整；b. 慢阻肺組：大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列紊亂，部分脫落、壞死，黏膜下見大量炎癥細胞浸潤，支氣管管壁增厚，管腔內充滿較多的炎癥細胞和分泌物；c. 慢阻肺組：大鼠肺泡結構紊亂，肺泡壁明顯變薄，甚至斷裂，肺泡擴張，部分融合。
2.2 肺氣腫定量指標比較
與正常對照組比較，慢阻肺組大鼠MLI和PAA明顯增加，而MAN則明顯降低，差異均具有統計學意義（均P<0.05）。結果見表1。
表1
兩組大鼠肺氣腫形態學定量指標比較［n=6，（ 
）］
2.3 BALF和血漿中S100A8/A9蛋白水平
與正常對照組比較，慢阻肺組大鼠BALF和血漿中S100A8/A9蛋白濃度均顯著升高，差異均具有統計學意義（均P<0.05），結果見表2。
表2
兩組血漿和BALF中S100A8/A9蛋白的濃度［n=6，（ 
）］
2.4 肺組織中S100A8、S100A9、TLR4、MyD88 mRNA的表達
與正常對照組比較，慢阻肺組大鼠肺組織中S100A8、S100A9、TLR4、MyD88 mRNA表達量均顯著增多，差異均有統計學意義（均P<0.05）。結果見表3。
表3
大鼠肺組織中S100A8、S100A9、TLR4、MyD88 mRNA的表達［n=6，（ 
）］
2.5 肺組織中S100A8、S100A9與TLR4、MyD88 mRNA的相關性分析
大鼠肺組織中S100A8 mRNA與TLR4、MyD88 mRNA表達呈正相關，相關系數分別為0.850和0.830（均P<0.05），S100A9 mRNA與大鼠肺組織中TLR4、MyD88 mRNA的表達也呈正相關，相關系數分別為0.952和0.817（均P<0.05）。
2.6 肺組織中S100A8/A9、TLR4、MyD88蛋白表達
免疫組織化學結果顯示：S100A8/A9蛋白主要表達于細胞漿和細胞膜上，TLR4則主要表達于細胞膜上，MyD88主要表達于細胞漿中。慢阻肺組大鼠肺組織中S100A8/A9表達量顯著高于正常對照組（P<0.05），S100A8/A9的表達量與TLR4和MyD88蛋白的表達量呈正相關，相關系數分別為0.950和0.961（均P<0.05）。結果見圖2和表4。
圖2
大鼠肺組織病理像（免疫組織化學×200）
a、c、e：正常對照組；b、d、f：慢阻肺組。a、b：S100A8/A9在慢阻肺組大鼠肺組織中表達明顯增加；c、d：TLR4在在慢阻肺組大鼠肺組織中表達明顯增加；e、f：MyD88在慢阻肺組大鼠肺組織中表達明顯增加。
表4
大鼠肺組織中S100A8/A9、TLR4和MyD88蛋白表達［n=6，（ 
）］
3 討論
吸煙和反復感染是慢阻肺發生發展過程中兩個最重要的因素[9]。本實驗采用煙熏聯合氣管內注射內毒素的方法構建慢阻肺模型，此方法符合人類慢阻肺的發生發展過程。通過病理形態學和定量指標證實，煙熏聯合氣管內注射內毒素1個月后，慢阻肺大鼠的PAA和MLI較正常大鼠明顯增加（P<0.05），MAN較正常大鼠明顯減少（P<0.05），說明煙熏聯合氣管內注射內毒素可成功構建大鼠慢阻肺模型，這與以往的研究結果一致[8, 10]。
S100A8/A9是S100蛋白家族的主要成員之一，占中性粒細胞胞質的45%左右，是中性粒細胞的一種重要蛋白[11]。在細胞內，S100A8/A9與鈣離子結合后則可促進吞噬細胞的遷移，同時可增強細胞核因子-κB（NF-κB）的活性，并提高活性氧水平，進一步介導細胞因子的分泌釋放并放大炎癥反應[12]。在細胞外，S100A8/A9作為一種警報素，通過與其受體TLR4結合，從而啟動經典的TLR4-MyD88-NF-κB炎癥通路，介導炎癥反應，參與多種炎癥疾病的發生[13-14]。本實驗顯示慢阻肺大鼠BALF和血漿中S100A8/A9的水平較正常對照組明顯升高，這與我們前期在慢阻肺患者中的研究結論一致[15]。本實驗還發現慢阻肺大鼠肺組織中S100A8、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白的表達較正常對照組明顯增加，提示煙熏聯合氣管內注射內毒素能刺激S100A8、S100A9在大鼠肺組織的表達及釋放增加。慢阻肺患者氣道和肺組織中有大量炎癥細胞（如中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞）聚集和活化，尤其是中性粒細胞，而激活的中性粒細胞、巨噬細胞是S100A8/A9的主要來源，S100A8/A9作為一種新的炎癥介質，又可促進中性粒粒細胞和巨噬細胞等炎癥細胞的活化，以及炎癥介質的趨化，形成炎癥反應的正反饋，介導并放大炎癥反應，從而促進慢阻肺的發生發展。我們前期的研究也證實S100A8和S100A9呈劑量、時間依賴性刺激大鼠肺泡巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6和IL-8等炎癥介質[16]。
本實驗同時發現，與正常對照組比較，S100A8/A9的受體TLR4及其通路中的關鍵分子MyD88的mRNA和蛋白在慢阻肺大鼠肺組織中的表達也明顯增加；S100A8、S100A9 mRNA表達量分別與TLR4、MyD88 mRNA表達量呈正相關，S100A8/A9蛋白表達量也與TLR4、MyD88蛋白表達量呈正相關。以上結果提示S100A8/A9可能通過上調TLR4和MyD88的表達，進一步啟動經典的TLR4-MyD88炎癥通路，從而激活了NF-κB并促炎細胞因子的分泌，如TNF-α和IL-8、IL-1β、IL-10和S100A8/A9等。而這些促炎細胞因子又可激活炎癥細胞以及上調TLR4和MyD88，周而復始，形成惡性循環，加重炎癥反應，從而進一步促進慢阻肺的發生發展。
綜上所述，S100A8/A9可能作為一種新的炎癥介質，通過與TLR4結合，激活經典TLR4-MyD88炎癥通路，導致下游炎癥因子的分泌和釋放，介導并加重炎癥從而參與慢阻肺的發生發展。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是呼吸系統最常見的慢性氣道炎癥性疾病，以持續氣流受限為主要特征，并且這種氣流受限呈進行性發展。慢阻肺主要與吸煙、反復感染和環境污染等有密切關系。鈣結合蛋白S100A8、S100A9是S100蛋白家族中的主要成員，常以二聚體S100A8/A9的形式存在，其主要來源于激活的中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等，在胞外可通過與Toll樣受體4（TLR4）和髓樣分化分子88（MyD88）結合而參與多種炎癥疾病的發生[1-2]。有研究證實S100A8/A9在肺癌、急性呼吸窘迫綜合征、牙周炎、心肌梗死等疾病中有重要作用[3-6]。本研究通過觀察煙熏聯合氣管內注射內毒素建立的慢阻肺大鼠模型中支氣管肺泡灌洗液（BALF）和血清中S100A8/A9蛋白的濃度變化，大鼠肺組織中S100A8、S100A9 mRNA及S100A8/A9蛋白的表達，以及由S100A8/A9介導的TLR4和MyD88 mRNA及蛋白的表達，探討S100A8/A9在煙熏聯合氣管內注射內毒素所建立的慢阻肺大鼠模型中的作用及機制。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗動物：雄性無特定病原級Wistar大鼠12只，購買并飼養于川北醫學院實驗動物中心［資質號：SCXK（川）2018-18］，8周齡，體重190～210 g，于自然光照條件下統一喂養，均自由飲水、攝食。
主要試劑及儀器：紅梅牌香煙（云南玉溪煙卷廠）、脂多糖（Sigma公司）、S100A8/A9 酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（Biolegend公司）、兔抗MyD88單抗（Novus公司）、鼠抗TLR4單抗（Abcam公司）、鼠抗S100A8/A9單抗（Abcam公司）、引物及定量PCR試劑盒（大連寶生物有限公司）、SABC免疫組織化學試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）、DAB kit AR1022（武漢博士德生物工程有限公司）、酶標儀（Bio-Tek公司)、PCR儀（ABI公司）、全自動免疫組織化學染色機（Thermoscientific公司）等。
1.2 方法
1.2.1 建立慢阻肺大鼠模型
大鼠適應性飼養1周后被隨機分成正常對照組和煙熏聯合內毒素處理組（慢阻肺組），每組各6只。參照陳延偉等[7]的實驗方法制備慢阻肺大鼠模型，慢阻肺組大鼠被放入45 cm×45 cm×30 cm大小的有機玻璃煙熏箱內，被動吸入紅梅牌香煙，每次10支，每天2次，每次30 min，共1個月；同時在第1天、第14天經氣管內注射200 mg/kg的內毒素。正常組在第1天、第14天氣管內滴注生理鹽水200μL，余時間不做任何處理。
1.2.2 血漿、BALF及肺組織的收集
待造模結束后第2天經腹腔注射3%戊巴比妥（30 mg/kg）將大鼠麻醉，將其固定于操作臺上，經腹主動脈采血3 mL，于4 ℃、3000 r/min離心15 min，然后收集血漿，于–80 ℃保存。用止血鉗鈍性分離大鼠頸部組織，暴露其氣管并結扎右肺，在第4與第5氣管軟骨之間行–2 mm的橫切口，將外徑約為1.8 mm的輸液管插入氣道內2 cm左右，再將已經預熱為37 ℃的生理鹽水4 mL注入左肺，輕柔肺部約2～3 min，緩慢回抽，收集回抽的BALF，重復4～5次。將BALF于4 ℃、1500 r/min離心10 min，收集上清液，于–80 ℃保存。將大鼠左肺分成約100 mg的小塊并立即置于液氮中，用于mRNA檢測。
1.2.3 大鼠肺組織標本制備及病理學檢測
取大鼠右肺放置于4%的多聚甲醛中固定，24 h后石蠟包埋切片，每個標本準備5張切片，用于蘇木素–伊紅（HE）染色，觀察病理學形態。采用圖像分析系統測量反映肺氣腫指標平均肺泡數（MAN）、肺平均內襯間隔（MLI）和肺泡腔面積占總面積的比值（PAA）[8]。
1.2.4 大鼠BALF和血漿中S100A8/A9蛋白檢測
采用ELISA檢測大鼠血漿和BALF中S100A8/A9蛋白的濃度，操作步驟按照說明書上進行。
1.2.5 大鼠肺組織中S100A8、S100A9、TLR4和MyD88 mRNA的表達
采用熒光定量PCR法檢測大鼠肺組織中S100A8、S100A9、MyD88、TLR4的mRNA表達情況。取出大鼠左肺肺組織，提取其總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA，S100A8上游引物5’-ACAGGGATGACTTCAGGAAAATG-3’，下游引物5’-CCACCCTTATCACCAACACAAG-3’，產物長度147 bp；S100A9上游引物5’-CTGAACAAGGCGGAATTCAAAG-3’，下游引物5’-TTCTCATGACAGGCAAAGATCAAC-3’，長185 bp；TLR4上游引物5’-CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTA-3’，下游引物5’-GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3’，產物長度177 bp；MyD88上游引物5’-TATACCAACCCTTGCACCAAGTC-3’，下游引物5’-TCAGGCTCCAAGTCAGCTCATC-3’，長121 bp；內參β-肌動蛋白上游引物5’-AGGCCAAGTGAAAAGATG-3’，下游引物5’-ACCAGAGGCATACAGGGACAA-3’，產物長度101 bp；擴增條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃ 32 s，共40個循環，反應體系為20 μL，基因表達量分析采用2－△△Ct計算。
1.2.6 免疫組織化學法檢測大鼠肺組織中S100A8/A9、TLR4和MyD88蛋白表達
采用免疫組織化學法檢測兩組大鼠肺組織中S100A8/A9、TLR4和MyD88蛋白的表達情況，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，陽性結果為棕黃色。OLYMPUS DP70顯微鏡高倍視野下觀察，每張切片不重復隨機采圖5張，采用Image-Pro Plus 6.0圖文分析軟件測量每張圖片平均光密度值，取每張切片的平均值作為該樣本S100A8/A9、TLR4和MyD88的蛋白表達含量。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件。呈正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗進行兩組之間比較；采用Pearson相關進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織病理形態學差異
正常組大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列整齊，肺泡結構完整（圖1a）；慢阻肺組大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列紊亂，部分脫落、壞死，黏膜下見大量炎癥細胞浸潤，支氣管管壁增厚，管腔內充滿較多的炎癥細胞和分泌物。肺泡結構紊亂，肺泡壁明顯變薄，甚至斷裂，肺泡擴張，部分融合（圖1b、1c）。
圖1
大鼠肺組織病理像（HE×200）
a. 正常對照組：大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列整齊，肺泡結構完整；b. 慢阻肺組：大鼠支氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞排列紊亂，部分脫落、壞死，黏膜下見大量炎癥細胞浸潤，支氣管管壁增厚，管腔內充滿較多的炎癥細胞和分泌物；c. 慢阻肺組：大鼠肺泡結構紊亂，肺泡壁明顯變薄，甚至斷裂，肺泡擴張，部分融合。
2.2 肺氣腫定量指標比較
與正常對照組比較，慢阻肺組大鼠MLI和PAA明顯增加，而MAN則明顯降低，差異均具有統計學意義（均P<0.05）。結果見表1。
表1
兩組大鼠肺氣腫形態學定量指標比較［n=6，（ ）］
2.3 BALF和血漿中S100A8/A9蛋白水平
與正常對照組比較，慢阻肺組大鼠BALF和血漿中S100A8/A9蛋白濃度均顯著升高，差異均具有統計學意義（均P<0.05），結果見表2。
表2
兩組血漿和BALF中S100A8/A9蛋白的濃度［n=6，（ ）］
2.4 肺組織中S100A8、S100A9、TLR4、MyD88 mRNA的表達
與正常對照組比較，慢阻肺組大鼠肺組織中S100A8、S100A9、TLR4、MyD88 mRNA表達量均顯著增多，差異均有統計學意義（均P<0.05）。結果見表3。
表3
大鼠肺組織中S100A8、S100A9、TLR4、MyD88 mRNA的表達［n=6，（ ）］
2.5 肺組織中S100A8、S100A9與TLR4、MyD88 mRNA的相關性分析
大鼠肺組織中S100A8 mRNA與TLR4、MyD88 mRNA表達呈正相關，相關系數分別為0.850和0.830（均P<0.05），S100A9 mRNA與大鼠肺組織中TLR4、MyD88 mRNA的表達也呈正相關，相關系數分別為0.952和0.817（均P<0.05）。
2.6 肺組織中S100A8/A9、TLR4、MyD88蛋白表達
免疫組織化學結果顯示：S100A8/A9蛋白主要表達于細胞漿和細胞膜上，TLR4則主要表達于細胞膜上，MyD88主要表達于細胞漿中。慢阻肺組大鼠肺組織中S100A8/A9表達量顯著高于正常對照組（P<0.05），S100A8/A9的表達量與TLR4和MyD88蛋白的表達量呈正相關，相關系數分別為0.950和0.961（均P<0.05）。結果見圖2和表4。
圖2
大鼠肺組織病理像（免疫組織化學×200）
a、c、e：正常對照組；b、d、f：慢阻肺組。a、b：S100A8/A9在慢阻肺組大鼠肺組織中表達明顯增加；c、d：TLR4在在慢阻肺組大鼠肺組織中表達明顯增加；e、f：MyD88在慢阻肺組大鼠肺組織中表達明顯增加。
表4
大鼠肺組織中S100A8/A9、TLR4和MyD88蛋白表達［n=6，（ ）］
3 討論
吸煙和反復感染是慢阻肺發生發展過程中兩個最重要的因素[9]。本實驗采用煙熏聯合氣管內注射內毒素的方法構建慢阻肺模型，此方法符合人類慢阻肺的發生發展過程。通過病理形態學和定量指標證實，煙熏聯合氣管內注射內毒素1個月后，慢阻肺大鼠的PAA和MLI較正常大鼠明顯增加（P<0.05），MAN較正常大鼠明顯減少（P<0.05），說明煙熏聯合氣管內注射內毒素可成功構建大鼠慢阻肺模型，這與以往的研究結果一致[8, 10]。
S100A8/A9是S100蛋白家族的主要成員之一，占中性粒細胞胞質的45%左右，是中性粒細胞的一種重要蛋白[11]。在細胞內，S100A8/A9與鈣離子結合后則可促進吞噬細胞的遷移，同時可增強細胞核因子-κB（NF-κB）的活性，并提高活性氧水平，進一步介導細胞因子的分泌釋放并放大炎癥反應[12]。在細胞外，S100A8/A9作為一種警報素，通過與其受體TLR4結合，從而啟動經典的TLR4-MyD88-NF-κB炎癥通路，介導炎癥反應，參與多種炎癥疾病的發生[13-14]。本實驗顯示慢阻肺大鼠BALF和血漿中S100A8/A9的水平較正常對照組明顯升高，這與我們前期在慢阻肺患者中的研究結論一致[15]。本實驗還發現慢阻肺大鼠肺組織中S100A8、S100A9 mRNA和S100A8/A9蛋白的表達較正常對照組明顯增加，提示煙熏聯合氣管內注射內毒素能刺激S100A8、S100A9在大鼠肺組織的表達及釋放增加。慢阻肺患者氣道和肺組織中有大量炎癥細胞（如中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞）聚集和活化，尤其是中性粒細胞，而激活的中性粒細胞、巨噬細胞是S100A8/A9的主要來源，S100A8/A9作為一種新的炎癥介質，又可促進中性粒粒細胞和巨噬細胞等炎癥細胞的活化，以及炎癥介質的趨化，形成炎癥反應的正反饋，介導并放大炎癥反應，從而促進慢阻肺的發生發展。我們前期的研究也證實S100A8和S100A9呈劑量、時間依賴性刺激大鼠肺泡巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6和IL-8等炎癥介質[16]。
本實驗同時發現，與正常對照組比較，S100A8/A9的受體TLR4及其通路中的關鍵分子MyD88的mRNA和蛋白在慢阻肺大鼠肺組織中的表達也明顯增加；S100A8、S100A9 mRNA表達量分別與TLR4、MyD88 mRNA表達量呈正相關，S100A8/A9蛋白表達量也與TLR4、MyD88蛋白表達量呈正相關。以上結果提示S100A8/A9可能通過上調TLR4和MyD88的表達，進一步啟動經典的TLR4-MyD88炎癥通路，從而激活了NF-κB并促炎細胞因子的分泌，如TNF-α和IL-8、IL-1β、IL-10和S100A8/A9等。而這些促炎細胞因子又可激活炎癥細胞以及上調TLR4和MyD88，周而復始，形成惡性循環，加重炎癥反應，從而進一步促進慢阻肺的發生發展。
綜上所述，S100A8/A9可能作為一種新的炎癥介質，通過與TLR4結合，激活經典TLR4-MyD88炎癥通路，導致下游炎癥因子的分泌和釋放，介導并加重炎癥從而參與慢阻肺的發生發展。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
