引用本文： 康錦花, 寧怡樂, 龍文杰, 劉晴晴, 王陵軍, 冼紹祥, 楊忠奇. 基于生物信息學分析早期液體復蘇改善膿毒癥休克的核心基因及通路. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(2): 102-111. doi: 10.7507/1671-6205.202101027 復制
根據最新的第三國際共識定義，膿毒癥是宿主對感染的反應失調導致器官功能障礙進而威脅生命的一種綜合征[1]。膿毒癥休克是膿毒癥最嚴重的階段，由于嚴重的外傷、燒傷、大手術和感染引起其循環系統和細胞代謝功能障礙，相比膿毒癥，它具有更高的死亡風險[2]。經充分液體復蘇仍需血管活性藥物維持動脈平均血壓≥65 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）以及血清乳酸水平>2 mmol/L是膿毒癥休克的兩大特征。盡管目前關于膿毒癥休克的內科抗菌藥物、外科手術技術以及相應的護理方法的不斷進步，但膿毒癥休克患者的死亡率仍然很高，2019年Vincent等[3]對北美和歐洲膿毒癥休克患者的患病率及死亡率進行了系統評價和薈萃分析，發現膿毒癥休克患者死亡率高達38%。因此尋找新的與膿毒癥休克有關的生物基因研發新的藥物非常必要。生物信息學技術是一門結合分子生物學和計算機信息技術的新興熱門且重要的學科，通過計算機信息技術預測生命科學中相關分子生物信息在復雜疾病的生理病理過程。隨著基因檢測技術和生物信息學的發展，許多疾病的早期診斷、預后分析和基因治療取得了新的突破。為了更好地了解膿毒癥休克的早期液體復蘇后器官功能改善的潛在生物學差異基因和可能機制，我們借助了Barcella等[4]研究膿毒癥休克患者在早期液體復蘇前后全血轉錄組數據集GSE110487中的部分數據集，進行生物信息學的深度分析。通過使用R軟件和相關軟件包識別了GSE110487數據集，進行蛋白質–蛋白質相互作用（protein?protein interaction，PPI）網絡、《京都基因與基因組百科全書》（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途徑和《基因本體論》（Gene Ontology，GO）富集分析，旨在為治療早期膿毒性性休克提供新穎的潛在靶點以及新的思路和方法。
1 資料與方法
1.1 微陣列數據信息
基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫（
1.2 篩選差異基因
使用R軟件（版本3.5.3）及其相關軟件包DESeq2構建分析。我們調整|log2倍數變化（fold change，FC）|≥1的閾值和P<0.05篩選經早期液體復蘇后器官功能改善和未改善患者的重要表達基因，得到差異基因。
1.3 通路和功能富集分析
GO富集分析是基因產物的簡單注釋，它提供了分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細胞組成（cellular component，CC）的基因產物的標準化描述。GO富集分析可用于了解差異基因富集的生物學功能，如途徑或細胞定位。KEGG是一個整合了基因組、化學和生物功能信息的綜合數據庫。本研究重點關注GO術語的生物過程富集結果，以說明膿毒癥休克的生物學特點。最后，使用KEGG及clusterProfile軟件包演示差異基因中的豐富信號傳導途徑[5-6]。根據P<0.05篩選出差異基因顯著富集的GO術語和KEGG通路。
1.4 PPI網絡和分子復合物檢測分析
為了預測這些數據集之間的功能交互作用，使用搜索工具STRING（
2 結果
2.1 篩選得到的差異基因
在去除批次差異并進行數據歸一化后，獲得了膿毒癥休克有改善的患者中的差異基因，差異基因中符合閾值|log2倍數變化（fold change，FC）|≥1和P<0.05標準的468個差異基因，包括255個上調基因和213個下調基因（表1）。使用R項目中的可視工具Volcano plots來顯示總體基因表達水平中的差異基因，以可視化已識別的差異基因（圖1）。圖2顯示了處理后的基因表達數據集中前100個上調基因和下調基因的聚類熱圖。
表1
膿毒癥休克患者早期液體復蘇后存在的468個差異基因
圖1
數據集GSE110487中膿毒癥休克經早期液體復蘇后有改善的患者中差異基因的火山圖
上調基因和下調基因分別以紅色和綠色顯示。|logFC|>3的區域用黑色字體標記，排列前2的子集群的差異基因用藍色字體標記。
圖2
差異基因聚類熱圖顯示篩選調整|logFC|≥1和P<0.05后的前100個上調和下調基因
每列代表T2時間各個樣本的基因表達譜。
2.2 差異基因的GO和KEGG通路富集分析
表2列出了已鑒定出的差異基因的與生物過程有關的10個最豐富的GO術語，上調的差異基因與以下生物過程有關：免疫系統過程（immune system process）、免疫反應（immune response）、適應性免疫反應（Adaptive immune response）、免疫反應高度相關激活信號轉導（immune response-activating signal transduction）和免疫應答激活細胞表面受體信號傳導途徑（immune response-activating cell surface receptor signaling pathway），下調的差異基因與以下生物過程有關：多細胞有機體生物過程（multicellular organismal process）、有機物轉運（organic substance transport）、離子轉運（ion transport）、對有機含氮化合物的反應（response to organonitrogen compound）和對有機含氮化合物的細胞反應（cellular response to organonitrogen compound）。KEGG富集分析顯示，從這些差異基因中富集的信號通路中，排名前10的KEGG通路為細胞因子與細胞因子受體的相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、自然殺傷細胞介導的細胞毒性（natural killer cell mediated cytotoxicity）、造血細胞譜（hematopoietic cell lineage）、T淋巴細胞受體信號傳導途徑（T cell receptor signaling pathway）、磷脂酶D信號通路（phospholipase D signaling pathway）、細胞黏附分子（cell adhesion molecules）、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作（viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）、原發性免疫缺陷（primary immunodeficiency）、移植物抗宿主病（graft-versus-host disease）和1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus）（圖3）。
表2
差異基因顯示生物過程中前10個最豐富的GO術語
圖3
KEGG富集分析顯示排名前10的信號通路
2.3 PPI網絡和MCODE分析
PPI網絡中包含154個節點和535個邊緣，RPI軟件使用ggnetwork軟件包對其進行了分析（圖4）。MCODE插件用于在膿毒癥休克的PPI網絡中創建子集群，并且總共創建了7個子集群。前2個子集群的基因具有較高的連通性（圖5）。選擇MCODE得分大于5的亞類基因作為核心基因，并從表3中所示的兩個子集群中篩選出總共28個基因。然后對28個基因進行功能富集分析，將前10個GO富集分析項中包含的前2個子集的核心基因，通過GO圖包處理，得到23個關鍵基因，包括CD28、CD3D、CD8B、CD8A、CD160、CXCR6、CCR3、CCR8、CCR9、TLR3、EOMES、GZMB、PTGDR2、CXCL8、GZMA、FASLG、GPR18、PRF1、IDO1、CNR1、GPER1、TMIGD3、GRM2等（圖6）。在這23個關鍵基因中，CD28、CD3D、CD8B、CD8A、CD160、CXCR6、CCR3、CCR8、CCR9、TLR3、EOMES、GZMB、PTGDR2、CXCL8、GZMA、FASLG、GPR18、PRF1、IDO1與免疫過程有關外，CNR1、GPER1、TMIGD3、GRM2與有機物轉運、離子轉運、對有機含氮化合物的反應以及對有機氮化合物的細胞反應等生物過程有關。
圖4
PPI網絡圖
用差異基因構建整個PPI網絡（a），將排列前2的兩個子集基因在（b）和（c）顯示。紅色表示表達基因上調，綠色表示基因表達下調。
圖5
通過MCODE分析從PPI網絡中為膿毒癥休克患者早期液體復蘇后有改善者創建子集
高度關聯的差異基因顯示于子集1和子集2。
表3
從MCODE得分大于5的子集群基因中選擇選取具有高度關聯性的28個差異基因
圖6
GO富集分析顯示生物過程的前10個術語中包含的前2個子集的23個核心基因
3 討論
生物信息學技術是一門結合分子生物學和計算機信息技術的新興熱門且重要的學科，主要利用計算機技術通過對生物學大數據的收集、篩選、分析等方式獲得相應基因、蛋白結構等方面信息，從而預測相關分子生物信息在復雜疾病的生理病理過程。膿毒癥休克是嚴重感染的結果，它可導致全身性炎癥和器官衰竭。盡管目前抗生素治療和現代護理方式不斷進步，但重癥加強治療病房中膿毒癥休克患者的死亡率仍然很高。本文通過計算機信息技術挖掘膿毒癥休克患者早期液體復蘇后機體器官功能改善情況的全血轉錄組測序數據集GSE110487進行分析，以獲得膿毒癥休克的可能機制及早期治療的新靶點基因。
本次研究我們發現CD28、CD3D、CD8B、CD8A、CD160、CXCR6、CCR3、CCR8、CCR9、TLR3、EOMES、GZMB、PTGDR2、CXCL8、GZMA、FASLG、GPR18、PRF1、IDO1等上調的差異基因與免疫過程關系更為密切。膿毒癥誘導的免疫改變涉及先天和適應性免疫應答，由膿毒癥休克引發的免疫功能障礙的發展不僅可作用于原發感染，也可導致繼發新的感染，而繼發新的感染和死亡的風險增加取決于這些改變的持續時間和強度[11]。因此，改善免疫細胞衰竭狀況顯得十分重要。人體內免疫細胞主要分為淋巴細胞、造血干細胞、抗原提呈細胞及其他免疫細胞（如巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等）四大類，其中淋巴細胞又分為T淋巴細胞、B淋巴細胞及自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）[12]。既往多項研究表明了CD28、CD3、CD4分子在膿毒癥或膿毒癥休克中的作用[13-14]。但關于CD160與膿毒癥休克的研究較少，但已發現CD160在人類免疫缺陷病毒等感染類疾病以及腫瘤中發揮免疫保護作用[15]。在我們的研究中，發現膿毒癥休克早期液體復蘇后有改善者CD160基因存在明顯上調。CD160是含有單個IgV結構域的糖基化磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨定蛋白，CD160-GPI主要在CD56dimCD16+ NK細胞、CD8+CD28– T淋巴細胞、NK T細胞以及在外周血單核細胞中大部分CD3–淋巴細胞表面高表達。它作為一種共信號分子，在NK細胞表面可通過與主要組織復合體I類受體結合識別靶細胞的同時，可分泌殺傷介質如穿孔素、NK細胞毒因子、腫瘤壞死因子、γ干擾素、白細胞介素-6、白細胞介素-8等，以產生強效的細胞殺傷活性；另一方面，CD160可以與CD8+ T淋巴細胞上的2B4（CD244）共表達使效應T淋巴細胞發揮作用。而且CD160可與單純皰疹病毒侵入介體結合來抑制CD4+ T淋巴細胞的增殖。在CD3/CD28共刺激下，隨著CD4+ T淋巴細胞增殖活躍，CD160的表達也隨之升高[16-18]。基于CD160在NK細胞和T淋巴細胞中的重要作用，我們推測CD160是潛在的治療膿毒癥休克的新型靶向基因。
趨化因子及其受體在免疫細胞的遷移運動和駐留過程中發揮重要作用。趨化因子屬于小分子細胞因子蛋白家族，大多數趨化因子屬于CC和CXC趨化因子亞家族[19]。趨化因子及受體在膿毒癥及膿毒癥休克中的扮演重要角色[20]。在輔助性T淋巴細胞Th1細胞中優勢表達的CXCR6在細胞免疫應答中通過增強吞噬細胞介導的抗感染效應，在Th2細胞中高表達的CCR3、CCR8在B細胞體液免疫中發揮功效[21]。PTGDR2又名CRTH2，Venet等[22]觀察了58例膿毒癥休克患者和39位健康志愿者全血中的調節性T淋巴細胞和Th2細胞上CRTH2以及嗜酸性粒細胞CCR3的表達情況，發現在膿毒癥休克中CRTH2/CCR3呈現低表達狀態，但同時也發現，在膿毒癥休克幸存的患者中，CRTH2或CCR3的表達升高。有研究表明，在小鼠盲腸結扎和穿刺制作膿毒癥模型中，與野生型小鼠相比，CCR9–/–小鼠表現出嚴重的感染性休克和更高的死亡率[23]。這與我們研究中發現在膿毒癥休克改善者外周血中趨化因子及受體基因表達水平升高的結論一致。
通過生物信息學分析，我們發現在早期液體復蘇改善膿毒癥休克的患者中還有部分顯著表達下調的基因如GRM2、CNR1、GPER1、TMIGD3基因。膿毒癥休克患者常常因嚴重感染繼發腦組織損傷引發膿毒癥相關性腦病，早期出現煩躁、嗜睡、譫妄、昏迷、抑郁等異常精神狀態，進一步發展可出現認知障礙等。GRM2（谷氨酸代謝型受體2，又稱mGlu2）是G蛋白耦聯受體，其表達與精神神經類疾病關系密切[24]。Taylor等[25]研究發現mGlu2可以誘導小膠質細胞激活并釋放大量具有神經毒性的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），通過激活腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor，TNFR1）和胱天蛋白酶3來誘導神經元凋亡。在我們研究中發現膿毒癥休克有改善組中GRM2下調，故推測GRM2主要在膿毒癥休克伴隨膿毒癥相關性腦病中發揮作用。GPER1（G蛋白耦聯雌激素受體1）作為一種非經典雌激素受體，在心血管、腎臟系統中發揮著重要作用。既往研究表明，無論是雄性或雌性動物中，GPER1的激活均會引起內皮依賴性或一氧化氮依賴性血管舒張，而抑制GPER1的活性后會導致血管收縮[26-27]。在高脂飲食誘導的小鼠心臟中CNR1表達增加，而CNR1敲除改善了高脂飲食觸發的心臟功能障礙[28]。眾所周知，盡管有足夠的液體復蘇，膿毒癥休克具有經血管活性藥物維持血壓。血壓的維持與心臟收縮功能、血管的收縮以及血容量有關。而GPER1和CNR1關鍵基因與血壓調節和心臟功能有關，故我們推測GPER1和CNR1可能可以通過改善膿毒癥休克低血壓狀態來治療早期膿毒癥休克。
KEGG富集分析表明，NK細胞介導的細胞毒性、細胞因子受體間的相互作用、T淋巴細胞受體信號傳導途徑、細胞黏附分子等通路與膿毒癥休克經早期液體復蘇后有改善相關。NK細胞是先天免疫系統的大淋巴細胞。膿毒癥休克的發病機制受到NK細胞介導的細胞毒性的巨大影響，例如炎癥，免疫激活，吞噬作用和急性反應物的產生[29]。而EOMES在NK細胞高度表達，在人類CD4+ T淋巴細胞中，EOMES驅動γ干擾素和細胞毒性分子（Prf1和Gzm基因）的表達，同時抑制Th17分化[30]。TNF-α可誘導細胞間細胞黏附分子1和血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達。而VCAM-1可幫助調節炎癥相關的血管黏附和巨噬細胞和T淋巴細胞等白細胞的跨內皮遷移。最近的證據表明，VCAM-1與各種免疫學疾病密切相關[31]。在我們KEGG富集通路中，細胞黏附分子信號通路與膿毒癥休克關系密切。以往的研究表明，在動物實驗膿毒癥模型中磷脂酶D1（phospholipase D1，PLD1）或磷脂酶D2（phospholipase D2，PLD2）的缺乏可降低小鼠的TNF-α等炎癥因子的表達和器官損傷，并增加小鼠的存活率[32-33]。我們的數據也發現PLD信號通路與膿毒癥休克有關。故針對PLD的藥物的進一步研究對治療早期膿毒癥休克患者有益。
在本研究中，我們發現多種淋巴細胞如T淋巴細胞、NK細胞等參與的免疫過程及與其相關的核心基因在膿毒癥休克中發揮重要作用，CD160、CNR1、GPER1、GRM2等關鍵基因可能是治療早期膿毒癥休克的新靶點。本研究也存在不足，首先是樣本量不夠大，還需更多樣本進行驗證。此外，本研究發現的核心基因以及相關通路局限于生物信息學分析，這需要進一步的體內和體外研究來證明這些作用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
根據最新的第三國際共識定義，膿毒癥是宿主對感染的反應失調導致器官功能障礙進而威脅生命的一種綜合征[1]。膿毒癥休克是膿毒癥最嚴重的階段，由于嚴重的外傷、燒傷、大手術和感染引起其循環系統和細胞代謝功能障礙，相比膿毒癥，它具有更高的死亡風險[2]。經充分液體復蘇仍需血管活性藥物維持動脈平均血壓≥65 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）以及血清乳酸水平>2 mmol/L是膿毒癥休克的兩大特征。盡管目前關于膿毒癥休克的內科抗菌藥物、外科手術技術以及相應的護理方法的不斷進步，但膿毒癥休克患者的死亡率仍然很高，2019年Vincent等[3]對北美和歐洲膿毒癥休克患者的患病率及死亡率進行了系統評價和薈萃分析，發現膿毒癥休克患者死亡率高達38%。因此尋找新的與膿毒癥休克有關的生物基因研發新的藥物非常必要。生物信息學技術是一門結合分子生物學和計算機信息技術的新興熱門且重要的學科，通過計算機信息技術預測生命科學中相關分子生物信息在復雜疾病的生理病理過程。隨著基因檢測技術和生物信息學的發展，許多疾病的早期診斷、預后分析和基因治療取得了新的突破。為了更好地了解膿毒癥休克的早期液體復蘇后器官功能改善的潛在生物學差異基因和可能機制，我們借助了Barcella等[4]研究膿毒癥休克患者在早期液體復蘇前后全血轉錄組數據集GSE110487中的部分數據集，進行生物信息學的深度分析。通過使用R軟件和相關軟件包識別了GSE110487數據集，進行蛋白質–蛋白質相互作用（protein?protein interaction，PPI）網絡、《京都基因與基因組百科全書》（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途徑和《基因本體論》（Gene Ontology，GO）富集分析，旨在為治療早期膿毒性性休克提供新穎的潛在靶點以及新的思路和方法。
1 資料與方法
1.1 微陣列數據信息
基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數據庫（
1.2 篩選差異基因
使用R軟件（版本3.5.3）及其相關軟件包DESeq2構建分析。我們調整|log2倍數變化（fold change，FC）|≥1的閾值和P<0.05篩選經早期液體復蘇后器官功能改善和未改善患者的重要表達基因，得到差異基因。
1.3 通路和功能富集分析
GO富集分析是基因產物的簡單注釋，它提供了分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細胞組成（cellular component，CC）的基因產物的標準化描述。GO富集分析可用于了解差異基因富集的生物學功能，如途徑或細胞定位。KEGG是一個整合了基因組、化學和生物功能信息的綜合數據庫。本研究重點關注GO術語的生物過程富集結果，以說明膿毒癥休克的生物學特點。最后，使用KEGG及clusterProfile軟件包演示差異基因中的豐富信號傳導途徑[5-6]。根據P<0.05篩選出差異基因顯著富集的GO術語和KEGG通路。
1.4 PPI網絡和分子復合物檢測分析
為了預測這些數據集之間的功能交互作用，使用搜索工具STRING（
2 結果
2.1 篩選得到的差異基因
在去除批次差異并進行數據歸一化后，獲得了膿毒癥休克有改善的患者中的差異基因，差異基因中符合閾值|log2倍數變化（fold change，FC）|≥1和P<0.05標準的468個差異基因，包括255個上調基因和213個下調基因（表1）。使用R項目中的可視工具Volcano plots來顯示總體基因表達水平中的差異基因，以可視化已識別的差異基因（圖1）。圖2顯示了處理后的基因表達數據集中前100個上調基因和下調基因的聚類熱圖。
表1
膿毒癥休克患者早期液體復蘇后存在的468個差異基因
圖1
數據集GSE110487中膿毒癥休克經早期液體復蘇后有改善的患者中差異基因的火山圖
上調基因和下調基因分別以紅色和綠色顯示。|logFC|>3的區域用黑色字體標記，排列前2的子集群的差異基因用藍色字體標記。
圖2
差異基因聚類熱圖顯示篩選調整|logFC|≥1和P<0.05后的前100個上調和下調基因
每列代表T2時間各個樣本的基因表達譜。
2.2 差異基因的GO和KEGG通路富集分析
表2列出了已鑒定出的差異基因的與生物過程有關的10個最豐富的GO術語，上調的差異基因與以下生物過程有關：免疫系統過程（immune system process）、免疫反應（immune response）、適應性免疫反應（Adaptive immune response）、免疫反應高度相關激活信號轉導（immune response-activating signal transduction）和免疫應答激活細胞表面受體信號傳導途徑（immune response-activating cell surface receptor signaling pathway），下調的差異基因與以下生物過程有關：多細胞有機體生物過程（multicellular organismal process）、有機物轉運（organic substance transport）、離子轉運（ion transport）、對有機含氮化合物的反應（response to organonitrogen compound）和對有機含氮化合物的細胞反應（cellular response to organonitrogen compound）。KEGG富集分析顯示，從這些差異基因中富集的信號通路中，排名前10的KEGG通路為細胞因子與細胞因子受體的相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、自然殺傷細胞介導的細胞毒性（natural killer cell mediated cytotoxicity）、造血細胞譜（hematopoietic cell lineage）、T淋巴細胞受體信號傳導途徑（T cell receptor signaling pathway）、磷脂酶D信號通路（phospholipase D signaling pathway）、細胞黏附分子（cell adhesion molecules）、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作（viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）、原發性免疫缺陷（primary immunodeficiency）、移植物抗宿主病（graft-versus-host disease）和1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus）（圖3）。
表2
差異基因顯示生物過程中前10個最豐富的GO術語
圖3
KEGG富集分析顯示排名前10的信號通路
2.3 PPI網絡和MCODE分析
PPI網絡中包含154個節點和535個邊緣，RPI軟件使用ggnetwork軟件包對其進行了分析（圖4）。MCODE插件用于在膿毒癥休克的PPI網絡中創建子集群，并且總共創建了7個子集群。前2個子集群的基因具有較高的連通性（圖5）。選擇MCODE得分大于5的亞類基因作為核心基因，并從表3中所示的兩個子集群中篩選出總共28個基因。然后對28個基因進行功能富集分析，將前10個GO富集分析項中包含的前2個子集的核心基因，通過GO圖包處理，得到23個關鍵基因，包括CD28、CD3D、CD8B、CD8A、CD160、CXCR6、CCR3、CCR8、CCR9、TLR3、EOMES、GZMB、PTGDR2、CXCL8、GZMA、FASLG、GPR18、PRF1、IDO1、CNR1、GPER1、TMIGD3、GRM2等（圖6）。在這23個關鍵基因中，CD28、CD3D、CD8B、CD8A、CD160、CXCR6、CCR3、CCR8、CCR9、TLR3、EOMES、GZMB、PTGDR2、CXCL8、GZMA、FASLG、GPR18、PRF1、IDO1與免疫過程有關外，CNR1、GPER1、TMIGD3、GRM2與有機物轉運、離子轉運、對有機含氮化合物的反應以及對有機氮化合物的細胞反應等生物過程有關。
圖4
PPI網絡圖
用差異基因構建整個PPI網絡（a），將排列前2的兩個子集基因在（b）和（c）顯示。紅色表示表達基因上調，綠色表示基因表達下調。
圖5
通過MCODE分析從PPI網絡中為膿毒癥休克患者早期液體復蘇后有改善者創建子集
高度關聯的差異基因顯示于子集1和子集2。
表3
從MCODE得分大于5的子集群基因中選擇選取具有高度關聯性的28個差異基因
圖6
GO富集分析顯示生物過程的前10個術語中包含的前2個子集的23個核心基因
3 討論
生物信息學技術是一門結合分子生物學和計算機信息技術的新興熱門且重要的學科，主要利用計算機技術通過對生物學大數據的收集、篩選、分析等方式獲得相應基因、蛋白結構等方面信息，從而預測相關分子生物信息在復雜疾病的生理病理過程。膿毒癥休克是嚴重感染的結果，它可導致全身性炎癥和器官衰竭。盡管目前抗生素治療和現代護理方式不斷進步，但重癥加強治療病房中膿毒癥休克患者的死亡率仍然很高。本文通過計算機信息技術挖掘膿毒癥休克患者早期液體復蘇后機體器官功能改善情況的全血轉錄組測序數據集GSE110487進行分析，以獲得膿毒癥休克的可能機制及早期治療的新靶點基因。
本次研究我們發現CD28、CD3D、CD8B、CD8A、CD160、CXCR6、CCR3、CCR8、CCR9、TLR3、EOMES、GZMB、PTGDR2、CXCL8、GZMA、FASLG、GPR18、PRF1、IDO1等上調的差異基因與免疫過程關系更為密切。膿毒癥誘導的免疫改變涉及先天和適應性免疫應答，由膿毒癥休克引發的免疫功能障礙的發展不僅可作用于原發感染，也可導致繼發新的感染，而繼發新的感染和死亡的風險增加取決于這些改變的持續時間和強度[11]。因此，改善免疫細胞衰竭狀況顯得十分重要。人體內免疫細胞主要分為淋巴細胞、造血干細胞、抗原提呈細胞及其他免疫細胞（如巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等）四大類，其中淋巴細胞又分為T淋巴細胞、B淋巴細胞及自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）[12]。既往多項研究表明了CD28、CD3、CD4分子在膿毒癥或膿毒癥休克中的作用[13-14]。但關于CD160與膿毒癥休克的研究較少，但已發現CD160在人類免疫缺陷病毒等感染類疾病以及腫瘤中發揮免疫保護作用[15]。在我們的研究中，發現膿毒癥休克早期液體復蘇后有改善者CD160基因存在明顯上調。CD160是含有單個IgV結構域的糖基化磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨定蛋白，CD160-GPI主要在CD56dimCD16+ NK細胞、CD8+CD28– T淋巴細胞、NK T細胞以及在外周血單核細胞中大部分CD3–淋巴細胞表面高表達。它作為一種共信號分子，在NK細胞表面可通過與主要組織復合體I類受體結合識別靶細胞的同時，可分泌殺傷介質如穿孔素、NK細胞毒因子、腫瘤壞死因子、γ干擾素、白細胞介素-6、白細胞介素-8等，以產生強效的細胞殺傷活性；另一方面，CD160可以與CD8+ T淋巴細胞上的2B4（CD244）共表達使效應T淋巴細胞發揮作用。而且CD160可與單純皰疹病毒侵入介體結合來抑制CD4+ T淋巴細胞的增殖。在CD3/CD28共刺激下，隨著CD4+ T淋巴細胞增殖活躍，CD160的表達也隨之升高[16-18]。基于CD160在NK細胞和T淋巴細胞中的重要作用，我們推測CD160是潛在的治療膿毒癥休克的新型靶向基因。
趨化因子及其受體在免疫細胞的遷移運動和駐留過程中發揮重要作用。趨化因子屬于小分子細胞因子蛋白家族，大多數趨化因子屬于CC和CXC趨化因子亞家族[19]。趨化因子及受體在膿毒癥及膿毒癥休克中的扮演重要角色[20]。在輔助性T淋巴細胞Th1細胞中優勢表達的CXCR6在細胞免疫應答中通過增強吞噬細胞介導的抗感染效應，在Th2細胞中高表達的CCR3、CCR8在B細胞體液免疫中發揮功效[21]。PTGDR2又名CRTH2，Venet等[22]觀察了58例膿毒癥休克患者和39位健康志愿者全血中的調節性T淋巴細胞和Th2細胞上CRTH2以及嗜酸性粒細胞CCR3的表達情況，發現在膿毒癥休克中CRTH2/CCR3呈現低表達狀態，但同時也發現，在膿毒癥休克幸存的患者中，CRTH2或CCR3的表達升高。有研究表明，在小鼠盲腸結扎和穿刺制作膿毒癥模型中，與野生型小鼠相比，CCR9–/–小鼠表現出嚴重的感染性休克和更高的死亡率[23]。這與我們研究中發現在膿毒癥休克改善者外周血中趨化因子及受體基因表達水平升高的結論一致。
通過生物信息學分析，我們發現在早期液體復蘇改善膿毒癥休克的患者中還有部分顯著表達下調的基因如GRM2、CNR1、GPER1、TMIGD3基因。膿毒癥休克患者常常因嚴重感染繼發腦組織損傷引發膿毒癥相關性腦病，早期出現煩躁、嗜睡、譫妄、昏迷、抑郁等異常精神狀態，進一步發展可出現認知障礙等。GRM2（谷氨酸代謝型受體2，又稱mGlu2）是G蛋白耦聯受體，其表達與精神神經類疾病關系密切[24]。Taylor等[25]研究發現mGlu2可以誘導小膠質細胞激活并釋放大量具有神經毒性的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），通過激活腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor，TNFR1）和胱天蛋白酶3來誘導神經元凋亡。在我們研究中發現膿毒癥休克有改善組中GRM2下調，故推測GRM2主要在膿毒癥休克伴隨膿毒癥相關性腦病中發揮作用。GPER1（G蛋白耦聯雌激素受體1）作為一種非經典雌激素受體，在心血管、腎臟系統中發揮著重要作用。既往研究表明，無論是雄性或雌性動物中，GPER1的激活均會引起內皮依賴性或一氧化氮依賴性血管舒張，而抑制GPER1的活性后會導致血管收縮[26-27]。在高脂飲食誘導的小鼠心臟中CNR1表達增加，而CNR1敲除改善了高脂飲食觸發的心臟功能障礙[28]。眾所周知，盡管有足夠的液體復蘇，膿毒癥休克具有經血管活性藥物維持血壓。血壓的維持與心臟收縮功能、血管的收縮以及血容量有關。而GPER1和CNR1關鍵基因與血壓調節和心臟功能有關，故我們推測GPER1和CNR1可能可以通過改善膿毒癥休克低血壓狀態來治療早期膿毒癥休克。
KEGG富集分析表明，NK細胞介導的細胞毒性、細胞因子受體間的相互作用、T淋巴細胞受體信號傳導途徑、細胞黏附分子等通路與膿毒癥休克經早期液體復蘇后有改善相關。NK細胞是先天免疫系統的大淋巴細胞。膿毒癥休克的發病機制受到NK細胞介導的細胞毒性的巨大影響，例如炎癥，免疫激活，吞噬作用和急性反應物的產生[29]。而EOMES在NK細胞高度表達，在人類CD4+ T淋巴細胞中，EOMES驅動γ干擾素和細胞毒性分子（Prf1和Gzm基因）的表達，同時抑制Th17分化[30]。TNF-α可誘導細胞間細胞黏附分子1和血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達。而VCAM-1可幫助調節炎癥相關的血管黏附和巨噬細胞和T淋巴細胞等白細胞的跨內皮遷移。最近的證據表明，VCAM-1與各種免疫學疾病密切相關[31]。在我們KEGG富集通路中，細胞黏附分子信號通路與膿毒癥休克關系密切。以往的研究表明，在動物實驗膿毒癥模型中磷脂酶D1（phospholipase D1，PLD1）或磷脂酶D2（phospholipase D2，PLD2）的缺乏可降低小鼠的TNF-α等炎癥因子的表達和器官損傷，并增加小鼠的存活率[32-33]。我們的數據也發現PLD信號通路與膿毒癥休克有關。故針對PLD的藥物的進一步研究對治療早期膿毒癥休克患者有益。
在本研究中，我們發現多種淋巴細胞如T淋巴細胞、NK細胞等參與的免疫過程及與其相關的核心基因在膿毒癥休克中發揮重要作用，CD160、CNR1、GPER1、GRM2等關鍵基因可能是治療早期膿毒癥休克的新靶點。本研究也存在不足，首先是樣本量不夠大，還需更多樣本進行驗證。此外，本研究發現的核心基因以及相關通路局限于生物信息學分析，這需要進一步的體內和體外研究來證明這些作用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
