引用本文： 黃艷生, 文文, 賴國祥, 潘建光, 蘇時禎. 白藜蘆醇對海水淹溺性肺損傷大鼠的保護作用研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(8): 570-576. doi: 10.7507/1671-6205.202012019 復制
海水淹溺不僅是航海事故、海上生產作業、旅游的死亡原因之一，而且是軍隊海上訓練、作戰、搶灘登陸戰斗和非戰斗減員的重要原因[1]。2016 年，世界衛生組織（WHO）對來自 85 個國家的死亡數據進行統計，結果顯示在符合數據標準的 48 個國家中，溺水是 1～14 歲兒童死亡的五大原因之一[2]。不同于淡水淹溺，海水化學成分復雜，加之其本身高滲透壓的特性使海水吸入較淡水吸入導致的肺損傷更為嚴重。盡管淹溺致死率高，但是海水淹溺性肺損傷的相關研究并不多。在藥物治療方面，近年來動物研究證實氯沙坦[3]、4 鄰羥基苯乙酸[4]、促紅細胞生成素[5]均對大鼠海水淹溺性肺損傷具有一定的保護作用。白藜蘆醇為中藥虎杖甙成分中的一種化合物[6]。白藜蘆醇苷在植物中分布廣，含量高，可從天然植物提取，提取工序簡單，容易獲得[7]。目前已知白藜蘆醇具有抗炎、心血管保護、抗休克等療效[7-11]。本研究擬通過檢測對比海水淹溺、白藜蘆醇預處理后海水淹溺不同時間點的大鼠血氣分析中動脈血氧分壓（PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）水平的變化，肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）、髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的含量及活性，了解白藜蘆醇是否能從抑制細胞凋亡、抗氧化這兩條途徑，改善海水淹溺導致肺損傷大鼠的預后，減輕海水淹溺導致的急性肺損傷。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑和儀器
白藜蘆醇（北京索萊寶科技有限公司）；SOD、MDA、MPO、抗 Caspase-3 抗體檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；配方海水：嚴格根據中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水主要成分及比例配制（NaCl 26.518 g/L，MgCl2 2.447 g/L，MgSO4 3.305 g/L，CaCl2 1.141 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO3 0.202 g/L，NaBr 0.083 g/L）。配置好后置于 4℃ 冰箱保存備用，淹溺前配方海水復溫至常溫（20～25℃）。雅培便攜式血氣分析儀 i-stat300、雅培 EG7+血液測試片匣（美國雅培 i-STAT 公司）。
1.1.2 實驗動物
健康雄性 SD 大鼠 112 只，體重 280～350 g，日齡 58～68 d，批號 SCXK（滬）2018-0006，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，由聯勤保障部隊第 900 醫院比較醫學科提供。實驗通過聯勤保障部隊第 900 醫院動物倫理委員會許可（許可證編號 2019-035）。動物外觀健康、反應良好。實驗動物飼養于聯勤保障部隊第 900 醫院實驗動物中心實驗室，普通級，室溫 20～25℃，層流房間通風良好，全營養飼料購于上海斯萊克實驗動物有限公司。適應環境 1 周后按隨機數字表法分組并用苦味酸標記。
1.2 方法
1.2.1 模型制備及實驗分組
將健康的 SD 大鼠用配好的 2% 戊巴比妥鈉 1.5 mL/kg（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥，四肢及頭部松緊適度地固定于手術板。抬高鼠臺頭部與桌面呈 45°，直視下經口氣管插管（置入深度距上齒 5～6 cm），小棉簽間斷清理聲門上分泌物。用 1.0 mL 注射器連接氣管插管、勻速向大鼠氣管內灌入海水 2 mL/kg，1 min 內灌完，復制海水淹溺性急性肺損傷動物模型。若大鼠造模后死亡，應記錄死亡數量，計算死亡率（死亡率=死亡數/海水淹溺總數，海水淹溺總數=S、S+R 組大鼠數+死亡大鼠數）。遞補大鼠編號不變。
將 112 只大鼠隨機分成 5 組，空白對照組（C 組）8 只，海水淹溺組（S 組）32 只，白黎蘆醇+海水淹溺組（S+R 組）32 只，白黎蘆醇組（R 組）8 只，氣管插管組（E 組）32 只。S 組、S+R 組、E 組再按照取材時間分為 0.5、1、2、4 h 四個亞組，即 S0.5、S1、S2、S4、（S+R）0.5、（S+R）1、（S+R）2、（S+R）4、E0.5、E1、E2、E4 組，每個亞組 8 只。C 組僅 2% 戊巴比妥鈉 1.5 mL/kg（30 mg/kg）腹腔注射麻醉。S 組造模后按不同時間點取動脈血、肺組織標本；S+R 組白藜蘆醇 50 mg/kg 預處理（灌胃）3 d，每天 1 次，最后一次灌胃后 24 h 造模，造模后按不同亞組時間取動脈血、肺組織標本；R 組白藜蘆醇 50 mg/kg 灌胃 3 d，最后一次灌胃后 24 h 取動脈血、肺組織標本；E 組氣管插管 1 min 后拔除，按不同取材時間收集標本、處死。
1.2.2 檢測指標
各組收集動脈血行血氣分析檢測。大鼠處死后，取肺后分離左全肺，稱濕重，用吸水紙清除表面血跡和水分，放置于電子天平稱量濕重并記錄，后置于 110 ℃ 恒溫烤箱烘烤 36 h（預實驗已知，此時肺組織稱重已恒定）后稱干重，計算肺組織濕/干重比（W/D）；右肺中、下葉制備 10% 肺組織勻漿后用 ELISA 法檢測肺組織中 SOD、MPO 活性及 MDA 含量、Caspase-3 蛋白表達；右肺上葉于 10% 甲醛浸泡 24 h 后行常規包埋蠟塊，切片，蘇木素–伊紅（HE）染色，100 倍光鏡下觀察肺病理變化并攝片。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。呈正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，使用獨立樣本 t 檢驗或者單因素方差分析（One-way ANOVA）。非正態分布的計量資料采用中位數（四分位數）［M（Q）］表示。不服從正態分布或方差不齊采用兩獨立樣本 Wilcoxon 符號秩和檢驗，多個獨立樣本比較的 Kruskal-Wallis H 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般情況
本實驗總共 120 只大鼠（入組 112 只，死亡 8 只），其中 S 組、S+R 組大鼠共 72 只（造模成功 64 只，死亡 8 只），海水淹溺后，大鼠均出現一過性呼吸暫停（2～5 s），之后恢復呼吸，呼吸頻率慢（50～70 次/min）、呼吸費力，平均 5 min 后轉為淺快呼吸（110～130 次/min）。平均 40 min 后神志恢復清醒，精神萎靡，反應遲鈍，呼吸淺快。所有海水淹溺大鼠胸部外觀均未見明顯異常。本實驗中有 8 只大鼠死亡，死亡率 11.1%（8/72）。本實驗采用經口氣管插管灌注海水代替傳統的頸前氣管切開，置管后灌注海水（圖 1）。大鼠海水淹溺后局部損傷輕，對頸部血管、神經、甲狀腺無任何損傷。麻醉藥物代謝后神志恢復清醒，避免頸前切開導致大鼠傷口疼痛。
圖1
各種海水淹溺造模方式
a. 傳統造模方式采用頸前分離后切開氣管，置入導管，注入海水；b. 本研究中造模方式采用經口氣管插管，接 1 mL 注射器后注入海水；c. 海水淹溺后死亡大鼠，口鼻腔見白色透明泡沫溢出。
2.2 血氣分析
海水淹溺后 0.5 h，腹主動脈血氣分析提示大鼠存在Ⅱ型呼吸衰竭、呼吸性酸中毒，隨時間進展，缺氧情況漸好轉，PaCO2 稍有下降。S+R 組大鼠海水淹溺后 PaO2 下降情況較 S 組明顯減輕（各時間點對比，0.5 h、1 h、2 h 組差異均有統計學意義），呼吸性酸中毒明顯改善（各時間點對比，0.5 h、1 h 組差異均有統計學意義），恢復時間較 S 組短。C 組、R 組、E 組三組 PaO2、PaCO2 比較差異均無統計學意義。結果見表 1。
表1
各組不同時間 PaO2、PaCO2、MDA、MPO、SOD、Caspase-3、W/D 比值的變化［n=8，M（Q）］
2.3 肺組織 MDA、MPO、SOD 含量
海水淹溺后大鼠出現 MDA 含量明顯升高，MPO、SOD 活性明顯下降；1 h 之后，MDA 含量漸下降，MPO、SOD 活性漸回升；4 h 時 S 組與 C 組差異無統計學意義。而 S+R 組海水淹溺后也出現 MDA 含量升高，MPO、SOD 活性下降，但是程度較 S 組輕（各時間點對比，0.5 h、1 h、2 h 組差異均有統計學意義），恢復較 S 組快。C 組、R 組、E 組三組 MDA 含量、MPO、SOD 活性比較差異均無統計學意義。結果見表 1。
2.4 肺組織 Caspase-3 含量
海水淹溺后 0.5 h，S 組、S+R 組大鼠肺組織檢測 Caspase-3 表達明顯高于 C 組，各個時間點 S 組 Caspase-3 較 S+R 組表達水平升高明顯（各時間點對比，0.5 h、1 h、2 h、4 h 組差異均有統計學意義）。1 h 之后，S 組、S+R 組 Caspase-3 不同程度下降，S 組下降速度比 S+R 組慢。C 組、R 組、E 組三組 Caspase-3 含量比較差異均無統計學意義。結果見表 1。
2.5 肺組織 W/D 比值
大鼠海水淹溺后，肺組織明顯腫脹、充血，S 組較 S+R 組更為嚴重，S+R 組肺組織 W/D 比值低于同時間段 S 組（各時間點對比，0.5 h、1 h、2 h 組差異均有統計學意義）。1 h 之后，S 組、S+R 組 W/D 比值緩慢下降，造模 4 h 后，S 組、S+R 組 W/D 比值仍高于空白組，差異有統計學意義。C 組、R 組、E 組三組 W/D 比值比較差異均無統計學意義。結果見表 1。
2.6 海水淹溺后肺組織病理變化
2.6.1 大體觀
海水淹溺后，所有大鼠胸部外觀均未見明顯異常。解剖大鼠，胸腔未見積液，夾閉氣管后取出整個肺組織，肺部充血、水腫，大鼠肺表面可見大小不等點狀、片狀出血灶，部分融合，嚴重者成肝樣變，低垂部位明顯。分離各葉肺組織，見氣管、支氣管口白色泡沫溢出。以淹溺后 0.5、1 h 最為明顯，至淹溺后 4 h 雙肺腫脹減輕，偶有散在出血點，未見明顯出血灶。切面可見暗紅色斑片灶及大量粉紅色泡沫樣液體滲出。死亡大鼠解剖胸腔未見積液，雙肺對稱、均勻地彌漫性腫脹，占滿整個胸腔。雙肺體積增大、腫脹更加明顯。雙肺表面可見彌漫性點狀、片狀出血，氣管、支氣管口見大量白色泡沫。
2.6.2 肺組織病理學變化
C 組大鼠的肺組織結構較為完整，肺泡腔、肺間質未見明顯的水腫、出血以及炎性細胞浸潤，肺泡壁厚度基本正常。R 組和 E 組大鼠鏡下表現與 C 組相似。S 組大鼠的肺組織結構紊亂，肺泡壁增厚、肺泡腔塌陷、大量紅細胞，可見灶性淋巴細胞浸潤，支氣管上皮細胞脫落，肺毛細血管充血。S+R 組大鼠的肺間質結構紊亂，但是肺泡壁明顯薄于 S 組，肺泡出血較 S 組輕；灶性淋巴細胞浸潤現象罕見；S+R 組肺損傷較 S 組輕。結果見圖 2。
圖2
各組大鼠肺組織病理檢查像（HE）
a. S 組（a1 和 a2，×200；a3，×100）：大鼠肺組織可見肺組織結構紊亂，肺泡壁增厚、結構破壞、肺泡腔塌陷、炎性細胞浸潤，肺泡腔、間質見大量紅細胞，在支氣管、血管周圍常可見灶性淋巴細胞浸潤，支氣管內可見支氣管上皮細胞脫落。b. S+R 組（b1 和 b2，×200；b3，×100）：大鼠肺組織可見肺泡壁增厚，肺泡腔內少量紅細胞，較 S 組輕，支氣管內上皮細胞脫落現象較 S 組輕。c. C 組（c1，×400）、R 組（c2，×200）、E 組（c3，×100）：C 組大鼠的肺組織結構較為完整，肺泡腔、肺間質未見明顯的水腫、出血以及炎性細胞浸潤，肺泡壁厚度基本正常，R、E 組大鼠肺組織結構與 C 組相仿。
3 討論
查閱國內外文獻，目前常見海水淹溺造模方法有：（1）頸前部分離后 T 行切開氣管，插入“Y”型玻璃套管并固定，灌入海水 4 mL/kg，4 min 內灌完[12]；（2）縱行切開大鼠頸部皮膚，鈍性分離至氣管前，取 1 mL 注射器向大鼠氣管內滴注配方海水（4 mL/kg）[13-15]（圖 1a）。兩種方法中以后一種更為多見，兩種方法均采取頸前有創操作，分離過程中對頸部血管、神經、甲狀腺均造成不同程度的損傷。本研究通過改良海水淹溺造模操作方法，改氣管切開為經口氣管插管（圖 1b），模仿人類氣管插管模型，直視下置入氣管插管套管（深度約至隆突上 0.5～1 cm），淹溺后馬上將手術臺垂直桌面 90° 放置，舌體外拉固定，保證上氣道通暢。此種操作方式簡單，避免對大鼠頸部、氣管的有創介入，減輕大鼠的疼痛。
在本研究中，海水淹溺后大鼠出現一過性呼吸暫停，2～5 s 后呼吸恢復，但是呼吸窘迫、費力，約 5 min 后變為淺快呼吸，呼吸費力情況改善。抽取大鼠腹主動脈血氣分析提示Ⅱ型呼吸衰竭，PaO2 下降，PaCO2 升高，S 組較 S+R 組明顯。隨著淹溺時間延長，0.5～4 h，PaO2 漸漸回升至正常水平，S+R 組 PaO2 較 S 組回升更快。C、R、E 組 PaO2、PaCO2 將近正常，差異無統計學意義。研究結果提示海水淹溺后出現呼吸衰竭，而白藜蘆醇預處理能減輕海水淹溺時大鼠呼吸衰竭情況，使大鼠缺氧情況改善更快，恢復更及時。而 C、R、E 組 PaO2、PaCO2 將近正常，三組之間差異無統計學意義，提示白藜蘆醇灌胃、氣管插管并未對大鼠造成通氣、彌散功能影響。與 C 組相比，海水淹溺 S、S+R 組均出現 PaCO2 升高，考慮可能有三種因素。其一，海水淹溺后導致主氣管黏膜水腫，引起通氣功能障礙，導致 CO2 儲留；其二，大鼠全麻后，自主呼吸功能減弱，咳嗽能力下降，海水灌注后少量液體反流至主氣管，導致通氣功能減弱、CO2 潴留；第三，海水淹溺及氣管插管可能誘發大鼠出現氣道痙攣，影響大鼠通氣功能。海水淹溺后隨著自主呼吸功能恢復，氣道黏膜水腫消退，通氣功能改善，PaCO2 漸下降，4 h 降至正常。此結果與顧興等[16]兔海水淹溺實驗的結果吻合。本研究中，氣管插管組（E 組）未出現 PaCO2 升高的情況，與 C、R 組相比，差異無統計學意義。在顧興等[16]兔海水淹溺實驗中，單純氣管插管組 PaCO2 正常，與本實驗結果相同。
MDA 和 SOD、MPO 是一組能夠反映體內氧化應激情況的重要指標。正常情況下，機體可通過自身產生的抗氧化劑降解過量的 ROS，減輕組織損傷，其中 SOD 和 MPO 是最重要的抗氧化劑。細胞膜中的多價不飽和脂肪酸與氧自由基發生氧化反應，最終生成 MDA。MDA 為一種常用的體現氧化應激的生物學標記，其濃度可提示脂質過氧化情況，從而間接反映氧自由基的殺傷力及組織細胞的受損情況[17-18]。因此，SOD、MPO、MDA 是監測機體抗氧化功能狀態的常用生物學指標。本研究證實，S、S+R 組 SOD、MPO 較 C 組降低，其中 S 組降低最明顯；而 S、S+R 組 MDA 較 C、R、E 組升高，其中 S 組升高明顯。此結果與馬李杰[19]的乙酰化白藜蘆醇對海水吸入型肺損傷的保護研究的結果一致。本實驗結果提示海水淹溺后出現大鼠氧自由基產生增加，生成 MDA 增多。而機體自身的抗氧化劑，SOD、MPO 明顯下降，提示海水淹溺可能通過氧化/抗氧化失衡的機制導致大鼠肺損傷。而白藜蘆醇預處理的大鼠，MDA 升高程度較 S 組輕，SOD、MPO 下降程度也較 S 組輕，提示白藜蘆醇預處理可能通過減輕氧化應激的途徑達到肺保護作用。
細胞凋亡是機體內細胞死亡的重要途徑，Caspase-3 是死亡受體介導的外部凋亡途徑中的效應凋亡蛋白酶，在細胞凋亡中起到重要的作用。本研究結果顯示，S、S+R 大鼠肺組織中 Caspase-3 含量高于 C、R、E 組，S 組增高明顯。提示海水吸入后確實導致細胞凋亡增加，引起肺組織損傷。白藜蘆醇預處理組 Caspase-3 含量升高，但是程度較 S 組輕，提示白藜蘆醇可能通過減輕細胞凋亡而達到對海水淹溺肺損傷的保護作用。
S 組大鼠海水淹溺后肺組織腫脹明顯，大鼠肺表面可見大小不等點狀、片狀出血灶，部分融合，嚴重者成肝樣變，低垂部位明顯。顯微鏡下均可見肺組織結構紊亂，肺泡壁增厚、結構破壞、肺泡腔塌陷、大量紅細胞浸潤，支氣管上皮細胞脫落，而對比淹溺后同時間點的 S+R 組，肺組織腫脹減輕，出血灶減少，鏡下肺泡結構紊亂、破壞程度輕。這提示經過白藜蘆醇預處理后的大鼠肺損傷明顯減輕。
綜上所述，本研究結果提示海水淹溺后，大鼠出現肺水腫、抗氧化/抗氧化失衡、細胞凋亡增加，而白藜蘆醇可能通過抗氧化、抑制細胞凋亡這兩種途徑，來減輕海水淹溺導致的大鼠的肺損傷。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
海水淹溺不僅是航海事故、海上生產作業、旅游的死亡原因之一，而且是軍隊海上訓練、作戰、搶灘登陸戰斗和非戰斗減員的重要原因[1]。2016 年，世界衛生組織（WHO）對來自 85 個國家的死亡數據進行統計，結果顯示在符合數據標準的 48 個國家中，溺水是 1～14 歲兒童死亡的五大原因之一[2]。不同于淡水淹溺，海水化學成分復雜，加之其本身高滲透壓的特性使海水吸入較淡水吸入導致的肺損傷更為嚴重。盡管淹溺致死率高，但是海水淹溺性肺損傷的相關研究并不多。在藥物治療方面，近年來動物研究證實氯沙坦[3]、4 鄰羥基苯乙酸[4]、促紅細胞生成素[5]均對大鼠海水淹溺性肺損傷具有一定的保護作用。白藜蘆醇為中藥虎杖甙成分中的一種化合物[6]。白藜蘆醇苷在植物中分布廣，含量高，可從天然植物提取，提取工序簡單，容易獲得[7]。目前已知白藜蘆醇具有抗炎、心血管保護、抗休克等療效[7-11]。本研究擬通過檢測對比海水淹溺、白藜蘆醇預處理后海水淹溺不同時間點的大鼠血氣分析中動脈血氧分壓（PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）水平的變化，肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）、髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的含量及活性，了解白藜蘆醇是否能從抑制細胞凋亡、抗氧化這兩條途徑，改善海水淹溺導致肺損傷大鼠的預后，減輕海水淹溺導致的急性肺損傷。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑和儀器
白藜蘆醇（北京索萊寶科技有限公司）；SOD、MDA、MPO、抗 Caspase-3 抗體檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；配方海水：嚴格根據中國國家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水主要成分及比例配制（NaCl 26.518 g/L，MgCl2 2.447 g/L，MgSO4 3.305 g/L，CaCl2 1.141 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO3 0.202 g/L，NaBr 0.083 g/L）。配置好后置于 4℃ 冰箱保存備用，淹溺前配方海水復溫至常溫（20～25℃）。雅培便攜式血氣分析儀 i-stat300、雅培 EG7+血液測試片匣（美國雅培 i-STAT 公司）。
1.1.2 實驗動物
健康雄性 SD 大鼠 112 只，體重 280～350 g，日齡 58～68 d，批號 SCXK（滬）2018-0006，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，由聯勤保障部隊第 900 醫院比較醫學科提供。實驗通過聯勤保障部隊第 900 醫院動物倫理委員會許可（許可證編號 2019-035）。動物外觀健康、反應良好。實驗動物飼養于聯勤保障部隊第 900 醫院實驗動物中心實驗室，普通級，室溫 20～25℃，層流房間通風良好，全營養飼料購于上海斯萊克實驗動物有限公司。適應環境 1 周后按隨機數字表法分組并用苦味酸標記。
1.2 方法
1.2.1 模型制備及實驗分組
將健康的 SD 大鼠用配好的 2% 戊巴比妥鈉 1.5 mL/kg（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥，四肢及頭部松緊適度地固定于手術板。抬高鼠臺頭部與桌面呈 45°，直視下經口氣管插管（置入深度距上齒 5～6 cm），小棉簽間斷清理聲門上分泌物。用 1.0 mL 注射器連接氣管插管、勻速向大鼠氣管內灌入海水 2 mL/kg，1 min 內灌完，復制海水淹溺性急性肺損傷動物模型。若大鼠造模后死亡，應記錄死亡數量，計算死亡率（死亡率=死亡數/海水淹溺總數，海水淹溺總數=S、S+R 組大鼠數+死亡大鼠數）。遞補大鼠編號不變。
將 112 只大鼠隨機分成 5 組，空白對照組（C 組）8 只，海水淹溺組（S 組）32 只，白黎蘆醇+海水淹溺組（S+R 組）32 只，白黎蘆醇組（R 組）8 只，氣管插管組（E 組）32 只。S 組、S+R 組、E 組再按照取材時間分為 0.5、1、2、4 h 四個亞組，即 S0.5、S1、S2、S4、（S+R）0.5、（S+R）1、（S+R）2、（S+R）4、E0.5、E1、E2、E4 組，每個亞組 8 只。C 組僅 2% 戊巴比妥鈉 1.5 mL/kg（30 mg/kg）腹腔注射麻醉。S 組造模后按不同時間點取動脈血、肺組織標本；S+R 組白藜蘆醇 50 mg/kg 預處理（灌胃）3 d，每天 1 次，最后一次灌胃后 24 h 造模，造模后按不同亞組時間取動脈血、肺組織標本；R 組白藜蘆醇 50 mg/kg 灌胃 3 d，最后一次灌胃后 24 h 取動脈血、肺組織標本；E 組氣管插管 1 min 后拔除，按不同取材時間收集標本、處死。
1.2.2 檢測指標
各組收集動脈血行血氣分析檢測。大鼠處死后，取肺后分離左全肺，稱濕重，用吸水紙清除表面血跡和水分，放置于電子天平稱量濕重并記錄，后置于 110 ℃ 恒溫烤箱烘烤 36 h（預實驗已知，此時肺組織稱重已恒定）后稱干重，計算肺組織濕/干重比（W/D）；右肺中、下葉制備 10% 肺組織勻漿后用 ELISA 法檢測肺組織中 SOD、MPO 活性及 MDA 含量、Caspase-3 蛋白表達；右肺上葉于 10% 甲醛浸泡 24 h 后行常規包埋蠟塊，切片，蘇木素–伊紅（HE）染色，100 倍光鏡下觀察肺病理變化并攝片。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。呈正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，使用獨立樣本 t 檢驗或者單因素方差分析（One-way ANOVA）。非正態分布的計量資料采用中位數（四分位數）［M（Q）］表示。不服從正態分布或方差不齊采用兩獨立樣本 Wilcoxon 符號秩和檢驗，多個獨立樣本比較的 Kruskal-Wallis H 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般情況
本實驗總共 120 只大鼠（入組 112 只，死亡 8 只），其中 S 組、S+R 組大鼠共 72 只（造模成功 64 只，死亡 8 只），海水淹溺后，大鼠均出現一過性呼吸暫停（2～5 s），之后恢復呼吸，呼吸頻率慢（50～70 次/min）、呼吸費力，平均 5 min 后轉為淺快呼吸（110～130 次/min）。平均 40 min 后神志恢復清醒，精神萎靡，反應遲鈍，呼吸淺快。所有海水淹溺大鼠胸部外觀均未見明顯異常。本實驗中有 8 只大鼠死亡，死亡率 11.1%（8/72）。本實驗采用經口氣管插管灌注海水代替傳統的頸前氣管切開，置管后灌注海水（圖 1）。大鼠海水淹溺后局部損傷輕，對頸部血管、神經、甲狀腺無任何損傷。麻醉藥物代謝后神志恢復清醒，避免頸前切開導致大鼠傷口疼痛。
圖1
各種海水淹溺造模方式
a. 傳統造模方式采用頸前分離后切開氣管，置入導管，注入海水；b. 本研究中造模方式采用經口氣管插管，接 1 mL 注射器后注入海水；c. 海水淹溺后死亡大鼠，口鼻腔見白色透明泡沫溢出。
2.2 血氣分析
海水淹溺后 0.5 h，腹主動脈血氣分析提示大鼠存在Ⅱ型呼吸衰竭、呼吸性酸中毒，隨時間進展，缺氧情況漸好轉，PaCO2 稍有下降。S+R 組大鼠海水淹溺后 PaO2 下降情況較 S 組明顯減輕（各時間點對比，0.5 h、1 h、2 h 組差異均有統計學意義），呼吸性酸中毒明顯改善（各時間點對比，0.5 h、1 h 組差異均有統計學意義），恢復時間較 S 組短。C 組、R 組、E 組三組 PaO2、PaCO2 比較差異均無統計學意義。結果見表 1。
表1
各組不同時間 PaO2、PaCO2、MDA、MPO、SOD、Caspase-3、W/D 比值的變化［n=8，M（Q）］
2.3 肺組織 MDA、MPO、SOD 含量
海水淹溺后大鼠出現 MDA 含量明顯升高，MPO、SOD 活性明顯下降；1 h 之后，MDA 含量漸下降，MPO、SOD 活性漸回升；4 h 時 S 組與 C 組差異無統計學意義。而 S+R 組海水淹溺后也出現 MDA 含量升高，MPO、SOD 活性下降，但是程度較 S 組輕（各時間點對比，0.5 h、1 h、2 h 組差異均有統計學意義），恢復較 S 組快。C 組、R 組、E 組三組 MDA 含量、MPO、SOD 活性比較差異均無統計學意義。結果見表 1。
2.4 肺組織 Caspase-3 含量
海水淹溺后 0.5 h，S 組、S+R 組大鼠肺組織檢測 Caspase-3 表達明顯高于 C 組，各個時間點 S 組 Caspase-3 較 S+R 組表達水平升高明顯（各時間點對比，0.5 h、1 h、2 h、4 h 組差異均有統計學意義）。1 h 之后，S 組、S+R 組 Caspase-3 不同程度下降，S 組下降速度比 S+R 組慢。C 組、R 組、E 組三組 Caspase-3 含量比較差異均無統計學意義。結果見表 1。
2.5 肺組織 W/D 比值
大鼠海水淹溺后，肺組織明顯腫脹、充血，S 組較 S+R 組更為嚴重，S+R 組肺組織 W/D 比值低于同時間段 S 組（各時間點對比，0.5 h、1 h、2 h 組差異均有統計學意義）。1 h 之后，S 組、S+R 組 W/D 比值緩慢下降，造模 4 h 后，S 組、S+R 組 W/D 比值仍高于空白組，差異有統計學意義。C 組、R 組、E 組三組 W/D 比值比較差異均無統計學意義。結果見表 1。
2.6 海水淹溺后肺組織病理變化
2.6.1 大體觀
海水淹溺后，所有大鼠胸部外觀均未見明顯異常。解剖大鼠，胸腔未見積液，夾閉氣管后取出整個肺組織，肺部充血、水腫，大鼠肺表面可見大小不等點狀、片狀出血灶，部分融合，嚴重者成肝樣變，低垂部位明顯。分離各葉肺組織，見氣管、支氣管口白色泡沫溢出。以淹溺后 0.5、1 h 最為明顯，至淹溺后 4 h 雙肺腫脹減輕，偶有散在出血點，未見明顯出血灶。切面可見暗紅色斑片灶及大量粉紅色泡沫樣液體滲出。死亡大鼠解剖胸腔未見積液，雙肺對稱、均勻地彌漫性腫脹，占滿整個胸腔。雙肺體積增大、腫脹更加明顯。雙肺表面可見彌漫性點狀、片狀出血，氣管、支氣管口見大量白色泡沫。
2.6.2 肺組織病理學變化
C 組大鼠的肺組織結構較為完整，肺泡腔、肺間質未見明顯的水腫、出血以及炎性細胞浸潤，肺泡壁厚度基本正常。R 組和 E 組大鼠鏡下表現與 C 組相似。S 組大鼠的肺組織結構紊亂，肺泡壁增厚、肺泡腔塌陷、大量紅細胞，可見灶性淋巴細胞浸潤，支氣管上皮細胞脫落，肺毛細血管充血。S+R 組大鼠的肺間質結構紊亂，但是肺泡壁明顯薄于 S 組，肺泡出血較 S 組輕；灶性淋巴細胞浸潤現象罕見；S+R 組肺損傷較 S 組輕。結果見圖 2。
圖2
各組大鼠肺組織病理檢查像（HE）
a. S 組（a1 和 a2，×200；a3，×100）：大鼠肺組織可見肺組織結構紊亂，肺泡壁增厚、結構破壞、肺泡腔塌陷、炎性細胞浸潤，肺泡腔、間質見大量紅細胞，在支氣管、血管周圍常可見灶性淋巴細胞浸潤，支氣管內可見支氣管上皮細胞脫落。b. S+R 組（b1 和 b2，×200；b3，×100）：大鼠肺組織可見肺泡壁增厚，肺泡腔內少量紅細胞，較 S 組輕，支氣管內上皮細胞脫落現象較 S 組輕。c. C 組（c1，×400）、R 組（c2，×200）、E 組（c3，×100）：C 組大鼠的肺組織結構較為完整，肺泡腔、肺間質未見明顯的水腫、出血以及炎性細胞浸潤，肺泡壁厚度基本正常，R、E 組大鼠肺組織結構與 C 組相仿。
3 討論
查閱國內外文獻，目前常見海水淹溺造模方法有：（1）頸前部分離后 T 行切開氣管，插入“Y”型玻璃套管并固定，灌入海水 4 mL/kg，4 min 內灌完[12]；（2）縱行切開大鼠頸部皮膚，鈍性分離至氣管前，取 1 mL 注射器向大鼠氣管內滴注配方海水（4 mL/kg）[13-15]（圖 1a）。兩種方法中以后一種更為多見，兩種方法均采取頸前有創操作，分離過程中對頸部血管、神經、甲狀腺均造成不同程度的損傷。本研究通過改良海水淹溺造模操作方法，改氣管切開為經口氣管插管（圖 1b），模仿人類氣管插管模型，直視下置入氣管插管套管（深度約至隆突上 0.5～1 cm），淹溺后馬上將手術臺垂直桌面 90° 放置，舌體外拉固定，保證上氣道通暢。此種操作方式簡單，避免對大鼠頸部、氣管的有創介入，減輕大鼠的疼痛。
在本研究中，海水淹溺后大鼠出現一過性呼吸暫停，2～5 s 后呼吸恢復，但是呼吸窘迫、費力，約 5 min 后變為淺快呼吸，呼吸費力情況改善。抽取大鼠腹主動脈血氣分析提示Ⅱ型呼吸衰竭，PaO2 下降，PaCO2 升高，S 組較 S+R 組明顯。隨著淹溺時間延長，0.5～4 h，PaO2 漸漸回升至正常水平，S+R 組 PaO2 較 S 組回升更快。C、R、E 組 PaO2、PaCO2 將近正常，差異無統計學意義。研究結果提示海水淹溺后出現呼吸衰竭，而白藜蘆醇預處理能減輕海水淹溺時大鼠呼吸衰竭情況，使大鼠缺氧情況改善更快，恢復更及時。而 C、R、E 組 PaO2、PaCO2 將近正常，三組之間差異無統計學意義，提示白藜蘆醇灌胃、氣管插管并未對大鼠造成通氣、彌散功能影響。與 C 組相比，海水淹溺 S、S+R 組均出現 PaCO2 升高，考慮可能有三種因素。其一，海水淹溺后導致主氣管黏膜水腫，引起通氣功能障礙，導致 CO2 儲留；其二，大鼠全麻后，自主呼吸功能減弱，咳嗽能力下降，海水灌注后少量液體反流至主氣管，導致通氣功能減弱、CO2 潴留；第三，海水淹溺及氣管插管可能誘發大鼠出現氣道痙攣，影響大鼠通氣功能。海水淹溺后隨著自主呼吸功能恢復，氣道黏膜水腫消退，通氣功能改善，PaCO2 漸下降，4 h 降至正常。此結果與顧興等[16]兔海水淹溺實驗的結果吻合。本研究中，氣管插管組（E 組）未出現 PaCO2 升高的情況，與 C、R 組相比，差異無統計學意義。在顧興等[16]兔海水淹溺實驗中，單純氣管插管組 PaCO2 正常，與本實驗結果相同。
MDA 和 SOD、MPO 是一組能夠反映體內氧化應激情況的重要指標。正常情況下，機體可通過自身產生的抗氧化劑降解過量的 ROS，減輕組織損傷，其中 SOD 和 MPO 是最重要的抗氧化劑。細胞膜中的多價不飽和脂肪酸與氧自由基發生氧化反應，最終生成 MDA。MDA 為一種常用的體現氧化應激的生物學標記，其濃度可提示脂質過氧化情況，從而間接反映氧自由基的殺傷力及組織細胞的受損情況[17-18]。因此，SOD、MPO、MDA 是監測機體抗氧化功能狀態的常用生物學指標。本研究證實，S、S+R 組 SOD、MPO 較 C 組降低，其中 S 組降低最明顯；而 S、S+R 組 MDA 較 C、R、E 組升高，其中 S 組升高明顯。此結果與馬李杰[19]的乙酰化白藜蘆醇對海水吸入型肺損傷的保護研究的結果一致。本實驗結果提示海水淹溺后出現大鼠氧自由基產生增加，生成 MDA 增多。而機體自身的抗氧化劑，SOD、MPO 明顯下降，提示海水淹溺可能通過氧化/抗氧化失衡的機制導致大鼠肺損傷。而白藜蘆醇預處理的大鼠，MDA 升高程度較 S 組輕，SOD、MPO 下降程度也較 S 組輕，提示白藜蘆醇預處理可能通過減輕氧化應激的途徑達到肺保護作用。
細胞凋亡是機體內細胞死亡的重要途徑，Caspase-3 是死亡受體介導的外部凋亡途徑中的效應凋亡蛋白酶，在細胞凋亡中起到重要的作用。本研究結果顯示，S、S+R 大鼠肺組織中 Caspase-3 含量高于 C、R、E 組，S 組增高明顯。提示海水吸入后確實導致細胞凋亡增加，引起肺組織損傷。白藜蘆醇預處理組 Caspase-3 含量升高，但是程度較 S 組輕，提示白藜蘆醇可能通過減輕細胞凋亡而達到對海水淹溺肺損傷的保護作用。
S 組大鼠海水淹溺后肺組織腫脹明顯，大鼠肺表面可見大小不等點狀、片狀出血灶，部分融合，嚴重者成肝樣變，低垂部位明顯。顯微鏡下均可見肺組織結構紊亂，肺泡壁增厚、結構破壞、肺泡腔塌陷、大量紅細胞浸潤，支氣管上皮細胞脫落，而對比淹溺后同時間點的 S+R 組，肺組織腫脹減輕，出血灶減少，鏡下肺泡結構紊亂、破壞程度輕。這提示經過白藜蘆醇預處理后的大鼠肺損傷明顯減輕。
綜上所述，本研究結果提示海水淹溺后，大鼠出現肺水腫、抗氧化/抗氧化失衡、細胞凋亡增加，而白藜蘆醇可能通過抗氧化、抑制細胞凋亡這兩種途徑，來減輕海水淹溺導致的大鼠的肺損傷。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
