引用本文： 尚粉青, 郭瑄, 顧興. 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者血清 miRNA-92a 水平與血管內皮功能損傷的關系研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(9): 625-631. doi: 10.7507/1671-6205.202009043 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是一種常見的但很容易忽視的疾病，由于呼吸暫停引起反復發作的夜間低氧和高碳酸血癥，可導致多個系統損害，其中以心血管系統損害發生率最高，而血管內皮功能障礙為心血管疾病主要的病理基礎[1]。微小 RNA（miRNA）-92a 在內皮細胞特異性高表達，研究表明高血壓、高血脂、高血糖及高同型半胱氨酸等危險因素均可導致 miRNA-92a 表達增加[2-3]。miRNA-92a 的靶基因 Krüppel 樣因子-2（KLF-2）、Krüppel 樣因子-4（KLF-4）、NAD-依賴性去乙酰化酶 Sirtuin-1（SIRT1）及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）等均與內皮細胞功能密切相關，miRNA-92a 與其靶基因結合抑制其表達從而影響血管內功能，與動脈粥樣硬化及冠心病密切相關[4]。本研究收集 OSAHS 患者血清，觀察血清中 miRNA-92a 水平變化、內皮細胞中相關靶基因變化以及內皮功能變化情況，進一步明確 OSAHS 誘導心血管疾病發展的病理生理機制，為防治此類疾病提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 病例收集
收集 2018 年 1 月至 12 月在西安市第一醫院睡眠呼吸監測中心行睡眠呼吸檢測的患者共 72 例，其中男 52 例，女 20 例。根據 OSAHS 診斷標準進行分組：非 OSAHS 組 22 例，輕度 OSAHS 組 18 例，中度 OSAHS 組 10 例，重度 OSAHS 組 22 例。排除標準：上呼吸道顯著梗阻、心腦血管疾病史、嚴重心力衰竭、甲狀腺功能減退、嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤等。本研究經西安市第一醫院倫理委員會審核通過（編號 NO.xadyyy2018028）。所有受試者均知情同意。
1.1.2 主要試劑
Trizol 試劑購自 Invitrogen 公司，HiScriptTM qPCR SuperMix 逆轉錄試劑盒及 PCR DNA 聚合酶購自 Vazyme 公司。β-actin 抗體購自 Santa Cruz 公司，KLF-2 抗體、KLF-4 抗體、eNOS 抗體、磷酸化 eNOS（p-eNOS。S1177）抗體購自美國 Cell Signaling 公司，蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑購自德國 Roche 公司，ECL 發光液購自美國 Millipore 公司，JC-1 粉劑購自美國 Molecular Probes 公司，其余試劑為國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 睡眠呼吸監測
受試者使用 SOMNOlab 2 便攜式多導睡眠記錄儀（德國萬曼），由配套專用軟件分析監測數據。根據 2016 年美國睡眠醫學會阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診斷測試指南[5]，呼吸暫停低通氣指數（AHI）為主要觀察指標，判斷 OSAHS 嚴重程度：AHI<5 次/h 正常，5～15 次/h 輕度，16～30 次/h 中度，>30 次/h 重度。
1.2.2 血清 miRNA-92a 及相關指標的水平檢測
用血自動生化儀測定血清轉氨酶、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、膽固醇、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）等。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法測定血清中 miRNA-92a 的含量，檢測過程參考 Taqman miRNA assay（Life Technologies，Carlsbad，CA）；具體操作方法見參考文獻[2]。
1.2.3 肱動脈內皮依賴性舒張功能檢測
受檢者取仰臥位，去枕平臥，雙臂置于身體兩側，選擇一側肱動脈作為受檢動脈，該側手臂輕度外展 15 ℃，手心向上。以縱切面掃描肱動脈，掃描位置取肘橫紋處至肘上 3 cm 之間，探頭輕壓在皮膚表面，以能夠清晰顯示動脈前后壁而不致令動脈受壓變形為準。首先記錄基礎肱動脈二維圖像及其多普勒血流頻譜。然后按照測量血壓標準方法將血壓計袖帶縛于該側上臂，袖帶下緣位于肘橫紋以上 2～3 cm 處，將袖帶充氣至高于收縮壓 50 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）并完全阻斷血流 10 min。血流阻斷過程中囑受檢者安靜體位不變。10 min 后迅速放氣，記錄放氣后 45 s 內肱動脈二位及多普勒血流圖像。血流介導的血管舒張功能（FMD）=（動脈反應性充血后內徑–動脈基礎內徑）/動脈基礎內徑×100%。
1.2.4 臍靜脈內皮細胞的培養及實驗
臍靜脈內皮細胞由西安交通大學醫學部心血管研究中心贈予。在西安市胸科醫院轉化醫學中心進行復蘇、培養及實驗，方法見參考文獻[6]。分別用非 OSAHS 組患者血清和重度 OSAHS 組血清作用于內皮細胞 24 h，倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態變化。提取總 RNA，RNA 濃度用紫外分光光度計檢測。取 2 μg 總 RNA 進行反轉錄。逆轉錄得到的 cDNA 進行實時定量 PCR 反應，觀察 miRNA-92a 的靶基因 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的表達情況。PCR 引物序列見表 1。提取總蛋白質，采用蛋白免疫印跡（Western blot）分析 KLF-2、KLF-4、eNOS 和 p-eNOS 的表達變化。
表1
實時定量 PCR 引物序列
1.2.5 JC-1 染色及激光共聚焦顯微鏡檢測
將 JC-1 粉劑溶于 DMSO 中配成 5 mg/mL 的儲存液，–20 ℃ 保存。染色時使用 M199 培養基稀釋使終濃度為 10 μg/mL（稀釋前培養基 37 ℃ 水浴鍋先預熱，加入 JC-1 儲存液時邊加入邊震動混勻，室溫以 13000 r/min 離心，取上清液備用）。臍靜脈內皮細胞傳代接種至激光共聚焦培養皿中，待細胞長至 70% 培養皿時，分別用非 OSAHS 組患者血清和重度 OSAHS 組血清作用于內皮細胞 24 h。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞 2 次，每皿加入 JC-1 工作液 500 μL，37 ℃ 避光孵育 15～30 min，PBS 清洗 2 次，DAPI 染細胞核。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 11.5 統計軟件。呈正態分布的計量資料用均數±標準差（
±s）表示，計數資料用例數和百分構成比表示。組間比較，計量指標用方差分析，計數資料用 χ2 檢驗，正態性檢驗采用 Shapiro-Wilk 檢驗，方差齊性檢驗采用 Levene 檢驗。多組均數間采用單因素方差分析，兩兩均數間比較采用 LSD-t 檢驗。相關分析采用 Spearman 分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平檢測
OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平顯著升高（非 OSAHS 組 1.002±1.151 比 OSAHS 組 8.564±9.560，P=0.0005；圖 1a）。且隨著 OSAHS 嚴重程度的增加，miRNA-92a 水平亦有升高的趨勢（輕度組 5.333±6.242，中度組 9.114±6.901，重度組 11.100±12.140，圖 1b）。
圖1
各組患者血清中 miRNA-92a 水平
與非 OSAHS 組比較，*
2.2 血清中一般生化指標
各組之間年齡、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、BUN 和 Cr、血漿總膽固醇（TC）、TG 及 HDL-C 差異均無統計學意義。非 OSAHS 組女性偏多而重度 OSAHS 組男性偏多。與非 OSAHS 組相比，OSAHS 組 LDL-C 及炎癥指標高敏 C 反應蛋白（hs-CRP）明顯升高（P<0.01）。結果見表 2。
表2
各組一般情況及生化指標［（
）/例］
2.3 血清 miRNA-92a 水平與 OSAHS 相關性分析
多元線性回歸分析結果顯示血清 miRNA-92a 水平與 OSAHS 嚴重程度相關。血清 miRNA-92a 與 AHI、LDL-C 有高度相關，與 BMI 及 hs-CRP 無明顯相關性。結果見表 3。
表3
多元線性回歸分析結果
2.4 肱動脈 FMD 檢測
OSAHS 患者中 32 例行肱動脈 FMD 檢查。結果提示 OSAHS 患者肱動脈 FMD 較健康對照組顯著降低（11.34±2.62 比 8.21±2.67，P<0.01）；Spearman 相關分析結果顯示 OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平與其肱動脈 FMD 值呈高度相關性（R=0.8052）。結果見圖 2。
圖2
OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平與其肱動脈 FMD 相關性分析
2.5 臍靜脈內皮細胞形態學觀察
分別用非 OSAHS 組患者血清和重度 OSAHS 組血清作用于內皮細胞 24 h，倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態變化，可見非 OSAHS 血清組內皮細胞形態規則呈梭形，邊界清楚，鋪路石樣排列。而重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞腫脹排列紊亂，邊界不清楚，脫落細胞數增多。結果見圖 3。
圖3
臍靜脈內皮細胞形態學改變（倒置熒光顯微鏡）
與正常血清刺激組相比，OSAHS 血清刺激組內皮細胞腫脹排列紊亂，邊界不清楚，脫落細胞數增多。
2.6 臍靜脈內皮細胞 JC-1 染色結果
可見非 OSAHS 血清組內皮細胞染色以紅色熒光（聚合物）為主，而重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞染色以綠色熒光（單體）為主。結果見圖 4。
圖4
內皮細胞 JC-1 染色結果（×10）
與非 OSAHS 血清刺激組相比，OSAHS 血清刺激組內皮細胞紅色熒光染色減弱，綠色熒光染色增強。
2.7 miRNA-92a 的靶基因 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的表達情況
RT-PCR 結果顯示與非 OSAHS 血清組比較，重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的 mRNA 表達顯著降低。Western blot 結果顯示與非 OSAHS 血清組比較，重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的蛋白表達顯著降低，且 p-eNOS 亦減少。結果見圖 5。
圖5
miRNA-92a 的靶基因 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的表達情況
a. 重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的 mRNA 表達；與正常血清刺激組比較，*
3 討論
1976 年，Guilleminault 等[7]首次提出了阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS ）的概念。OSAHS 有高發病率、致殘率和病死率，未經治療的 OSAHS 患者 5 年病死率達 11%～13%[8]。而由于低氧血癥導致多系統損害中，以心血管系統損害發生率最高，我國 OSAHS 患者高血壓患病率為 49.3%[9-10]。OSAHS 導致心血管疾病是多方面因素共同作用下的結果[11-13]，其中內皮細胞功能損傷機制值得進一步深入研究。miRNA-92a 在內皮細胞特異性高表達[14]，在心血管疾病的發生及發展過程中有重要作用[15-19]。
本研究發現 OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平較正常對照組明顯升高，且隨著 OSAHS 嚴重程度的增加 miRNA-92a 水平亦顯著升高。細胞實驗中用患者血清作用于體外培養的內皮細胞可見 miRNA-92a 的靶基因 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的 mRNA 表達均顯著降低，證實血清中的 miRNA-92a 可以被血管內皮吸收發揮血管內皮細胞損傷作用。此外，Khalyfa 等[20]對兒童 OSAHS 患者內皮功能障礙的研究發現 miRNA-630 的表達降低。亦有研究發現在 OSAHS 并發內皮功能障礙的過程中，miRNA-30a 通過介導 Beclin-1 的翻譯控制，進而引起的內皮細胞功能障礙和損傷，促使心血管疾病發生發展[21]。因此 miRNA 在 OSAHS 所致血管內皮細胞功能損傷過程中的研究仍需進一步深入。
本研究中 JC-1 染色結果顯示非 OSAHS 血清組內皮細胞染色以紅色熒光（聚合物）為主，而重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞染色以綠色熒光（單體）為主，提示內皮細胞膜電位變化，線粒體功能損傷。OSAHS 患者夜間處于間歇缺氧狀態，間歇缺氧可對多種細胞的線粒體代謝產生影響，包括心肌、腦細胞、肝臟細胞等。而對內皮細胞線粒體功能的影響僅有少量報道[22-23]。Zhu 等[22]研究證實慢性間歇缺氧導致血中內皮素-1、血管性血友病因子、環氧化酶-2、核轉錄因子-κB、血漿纖維蛋白原和纖溶蛋白酶原激活劑抑制物-1 等一系列指標上升，同時觀察到胸主動脈內皮細胞線粒體超微結構變化。Haslip 等[23]研究顯示內皮解偶聯蛋白 2 調節缺氧所致肺動脈內皮細胞吞噬能力引起線粒體生物合成不足，誘發肺高壓。本研究觀察到其膜電位的變化，但是進一步線粒體形態變化及代謝變化機制仍需深入探討。
本研究顯示對內皮細胞功能有重要影響的 miRNA-92a 在 OSAHS 患者血清中明顯升高引起內皮功能障礙，這為研究 OSAHS 并發心血管疾病的病理生理機制提供部分理論依據。此研究不足之處是我們沒有深入闡明是什么因素導致 miRNA-92a表達增多，而且 JC-1 染色提示內皮細胞線粒體功能障礙，仍需進一步探討 miRNA-92a 與內皮細胞線粒體功能障礙之間的內在作用機制。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是一種常見的但很容易忽視的疾病，由于呼吸暫停引起反復發作的夜間低氧和高碳酸血癥，可導致多個系統損害，其中以心血管系統損害發生率最高，而血管內皮功能障礙為心血管疾病主要的病理基礎[1]。微小 RNA（miRNA）-92a 在內皮細胞特異性高表達，研究表明高血壓、高血脂、高血糖及高同型半胱氨酸等危險因素均可導致 miRNA-92a 表達增加[2-3]。miRNA-92a 的靶基因 Krüppel 樣因子-2（KLF-2）、Krüppel 樣因子-4（KLF-4）、NAD-依賴性去乙酰化酶 Sirtuin-1（SIRT1）及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）等均與內皮細胞功能密切相關，miRNA-92a 與其靶基因結合抑制其表達從而影響血管內功能，與動脈粥樣硬化及冠心病密切相關[4]。本研究收集 OSAHS 患者血清，觀察血清中 miRNA-92a 水平變化、內皮細胞中相關靶基因變化以及內皮功能變化情況，進一步明確 OSAHS 誘導心血管疾病發展的病理生理機制，為防治此類疾病提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 病例收集
收集 2018 年 1 月至 12 月在西安市第一醫院睡眠呼吸監測中心行睡眠呼吸檢測的患者共 72 例，其中男 52 例，女 20 例。根據 OSAHS 診斷標準進行分組：非 OSAHS 組 22 例，輕度 OSAHS 組 18 例，中度 OSAHS 組 10 例，重度 OSAHS 組 22 例。排除標準：上呼吸道顯著梗阻、心腦血管疾病史、嚴重心力衰竭、甲狀腺功能減退、嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤等。本研究經西安市第一醫院倫理委員會審核通過（編號 NO.xadyyy2018028）。所有受試者均知情同意。
1.1.2 主要試劑
Trizol 試劑購自 Invitrogen 公司，HiScriptTM qPCR SuperMix 逆轉錄試劑盒及 PCR DNA 聚合酶購自 Vazyme 公司。β-actin 抗體購自 Santa Cruz 公司，KLF-2 抗體、KLF-4 抗體、eNOS 抗體、磷酸化 eNOS（p-eNOS。S1177）抗體購自美國 Cell Signaling 公司，蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑購自德國 Roche 公司，ECL 發光液購自美國 Millipore 公司，JC-1 粉劑購自美國 Molecular Probes 公司，其余試劑為國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 睡眠呼吸監測
受試者使用 SOMNOlab 2 便攜式多導睡眠記錄儀（德國萬曼），由配套專用軟件分析監測數據。根據 2016 年美國睡眠醫學會阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診斷測試指南[5]，呼吸暫停低通氣指數（AHI）為主要觀察指標，判斷 OSAHS 嚴重程度：AHI<5 次/h 正常，5～15 次/h 輕度，16～30 次/h 中度，>30 次/h 重度。
1.2.2 血清 miRNA-92a 及相關指標的水平檢測
用血自動生化儀測定血清轉氨酶、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、膽固醇、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）等。采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法測定血清中 miRNA-92a 的含量，檢測過程參考 Taqman miRNA assay（Life Technologies，Carlsbad，CA）；具體操作方法見參考文獻[2]。
1.2.3 肱動脈內皮依賴性舒張功能檢測
受檢者取仰臥位，去枕平臥，雙臂置于身體兩側，選擇一側肱動脈作為受檢動脈，該側手臂輕度外展 15 ℃，手心向上。以縱切面掃描肱動脈，掃描位置取肘橫紋處至肘上 3 cm 之間，探頭輕壓在皮膚表面，以能夠清晰顯示動脈前后壁而不致令動脈受壓變形為準。首先記錄基礎肱動脈二維圖像及其多普勒血流頻譜。然后按照測量血壓標準方法將血壓計袖帶縛于該側上臂，袖帶下緣位于肘橫紋以上 2～3 cm 處，將袖帶充氣至高于收縮壓 50 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）并完全阻斷血流 10 min。血流阻斷過程中囑受檢者安靜體位不變。10 min 后迅速放氣，記錄放氣后 45 s 內肱動脈二位及多普勒血流圖像。血流介導的血管舒張功能（FMD）=（動脈反應性充血后內徑–動脈基礎內徑）/動脈基礎內徑×100%。
1.2.4 臍靜脈內皮細胞的培養及實驗
臍靜脈內皮細胞由西安交通大學醫學部心血管研究中心贈予。在西安市胸科醫院轉化醫學中心進行復蘇、培養及實驗，方法見參考文獻[6]。分別用非 OSAHS 組患者血清和重度 OSAHS 組血清作用于內皮細胞 24 h，倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態變化。提取總 RNA，RNA 濃度用紫外分光光度計檢測。取 2 μg 總 RNA 進行反轉錄。逆轉錄得到的 cDNA 進行實時定量 PCR 反應，觀察 miRNA-92a 的靶基因 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的表達情況。PCR 引物序列見表 1。提取總蛋白質，采用蛋白免疫印跡（Western blot）分析 KLF-2、KLF-4、eNOS 和 p-eNOS 的表達變化。
表1
實時定量 PCR 引物序列
1.2.5 JC-1 染色及激光共聚焦顯微鏡檢測
將 JC-1 粉劑溶于 DMSO 中配成 5 mg/mL 的儲存液，–20 ℃ 保存。染色時使用 M199 培養基稀釋使終濃度為 10 μg/mL（稀釋前培養基 37 ℃ 水浴鍋先預熱，加入 JC-1 儲存液時邊加入邊震動混勻，室溫以 13000 r/min 離心，取上清液備用）。臍靜脈內皮細胞傳代接種至激光共聚焦培養皿中，待細胞長至 70% 培養皿時，分別用非 OSAHS 組患者血清和重度 OSAHS 組血清作用于內皮細胞 24 h。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞 2 次，每皿加入 JC-1 工作液 500 μL，37 ℃ 避光孵育 15～30 min，PBS 清洗 2 次，DAPI 染細胞核。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 11.5 統計軟件。呈正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，計數資料用例數和百分構成比表示。組間比較，計量指標用方差分析，計數資料用 χ2 檢驗，正態性檢驗采用 Shapiro-Wilk 檢驗，方差齊性檢驗采用 Levene 檢驗。多組均數間采用單因素方差分析，兩兩均數間比較采用 LSD-t 檢驗。相關分析采用 Spearman 分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平檢測
OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平顯著升高（非 OSAHS 組 1.002±1.151 比 OSAHS 組 8.564±9.560，P=0.0005；圖 1a）。且隨著 OSAHS 嚴重程度的增加，miRNA-92a 水平亦有升高的趨勢（輕度組 5.333±6.242，中度組 9.114±6.901，重度組 11.100±12.140，圖 1b）。
圖1
各組患者血清中 miRNA-92a 水平
與非 OSAHS 組比較，*
2.2 血清中一般生化指標
各組之間年齡、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、BUN 和 Cr、血漿總膽固醇（TC）、TG 及 HDL-C 差異均無統計學意義。非 OSAHS 組女性偏多而重度 OSAHS 組男性偏多。與非 OSAHS 組相比，OSAHS 組 LDL-C 及炎癥指標高敏 C 反應蛋白（hs-CRP）明顯升高（P<0.01）。結果見表 2。
表2
各組一般情況及生化指標［（）/例］
2.3 血清 miRNA-92a 水平與 OSAHS 相關性分析
多元線性回歸分析結果顯示血清 miRNA-92a 水平與 OSAHS 嚴重程度相關。血清 miRNA-92a 與 AHI、LDL-C 有高度相關，與 BMI 及 hs-CRP 無明顯相關性。結果見表 3。
表3
多元線性回歸分析結果
2.4 肱動脈 FMD 檢測
OSAHS 患者中 32 例行肱動脈 FMD 檢查。結果提示 OSAHS 患者肱動脈 FMD 較健康對照組顯著降低（11.34±2.62 比 8.21±2.67，P<0.01）；Spearman 相關分析結果顯示 OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平與其肱動脈 FMD 值呈高度相關性（R=0.8052）。結果見圖 2。
圖2
OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平與其肱動脈 FMD 相關性分析
2.5 臍靜脈內皮細胞形態學觀察
分別用非 OSAHS 組患者血清和重度 OSAHS 組血清作用于內皮細胞 24 h，倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態變化，可見非 OSAHS 血清組內皮細胞形態規則呈梭形，邊界清楚，鋪路石樣排列。而重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞腫脹排列紊亂，邊界不清楚，脫落細胞數增多。結果見圖 3。
圖3
臍靜脈內皮細胞形態學改變（倒置熒光顯微鏡）
與正常血清刺激組相比，OSAHS 血清刺激組內皮細胞腫脹排列紊亂，邊界不清楚，脫落細胞數增多。
2.6 臍靜脈內皮細胞 JC-1 染色結果
可見非 OSAHS 血清組內皮細胞染色以紅色熒光（聚合物）為主，而重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞染色以綠色熒光（單體）為主。結果見圖 4。
圖4
內皮細胞 JC-1 染色結果（×10）
與非 OSAHS 血清刺激組相比，OSAHS 血清刺激組內皮細胞紅色熒光染色減弱，綠色熒光染色增強。
2.7 miRNA-92a 的靶基因 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的表達情況
RT-PCR 結果顯示與非 OSAHS 血清組比較，重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的 mRNA 表達顯著降低。Western blot 結果顯示與非 OSAHS 血清組比較，重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的蛋白表達顯著降低，且 p-eNOS 亦減少。結果見圖 5。
圖5
miRNA-92a 的靶基因 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的表達情況
a. 重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的 mRNA 表達；與正常血清刺激組比較，*
3 討論
1976 年，Guilleminault 等[7]首次提出了阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSAS ）的概念。OSAHS 有高發病率、致殘率和病死率，未經治療的 OSAHS 患者 5 年病死率達 11%～13%[8]。而由于低氧血癥導致多系統損害中，以心血管系統損害發生率最高，我國 OSAHS 患者高血壓患病率為 49.3%[9-10]。OSAHS 導致心血管疾病是多方面因素共同作用下的結果[11-13]，其中內皮細胞功能損傷機制值得進一步深入研究。miRNA-92a 在內皮細胞特異性高表達[14]，在心血管疾病的發生及發展過程中有重要作用[15-19]。
本研究發現 OSAHS 患者血清 miRNA-92a 水平較正常對照組明顯升高，且隨著 OSAHS 嚴重程度的增加 miRNA-92a 水平亦顯著升高。細胞實驗中用患者血清作用于體外培養的內皮細胞可見 miRNA-92a 的靶基因 KLF-2、KLF-4 及 eNOS 的 mRNA 表達均顯著降低，證實血清中的 miRNA-92a 可以被血管內皮吸收發揮血管內皮細胞損傷作用。此外，Khalyfa 等[20]對兒童 OSAHS 患者內皮功能障礙的研究發現 miRNA-630 的表達降低。亦有研究發現在 OSAHS 并發內皮功能障礙的過程中，miRNA-30a 通過介導 Beclin-1 的翻譯控制，進而引起的內皮細胞功能障礙和損傷，促使心血管疾病發生發展[21]。因此 miRNA 在 OSAHS 所致血管內皮細胞功能損傷過程中的研究仍需進一步深入。
本研究中 JC-1 染色結果顯示非 OSAHS 血清組內皮細胞染色以紅色熒光（聚合物）為主，而重度 OSAHS 血清刺激后的內皮細胞染色以綠色熒光（單體）為主，提示內皮細胞膜電位變化，線粒體功能損傷。OSAHS 患者夜間處于間歇缺氧狀態，間歇缺氧可對多種細胞的線粒體代謝產生影響，包括心肌、腦細胞、肝臟細胞等。而對內皮細胞線粒體功能的影響僅有少量報道[22-23]。Zhu 等[22]研究證實慢性間歇缺氧導致血中內皮素-1、血管性血友病因子、環氧化酶-2、核轉錄因子-κB、血漿纖維蛋白原和纖溶蛋白酶原激活劑抑制物-1 等一系列指標上升，同時觀察到胸主動脈內皮細胞線粒體超微結構變化。Haslip 等[23]研究顯示內皮解偶聯蛋白 2 調節缺氧所致肺動脈內皮細胞吞噬能力引起線粒體生物合成不足，誘發肺高壓。本研究觀察到其膜電位的變化，但是進一步線粒體形態變化及代謝變化機制仍需深入探討。
本研究顯示對內皮細胞功能有重要影響的 miRNA-92a 在 OSAHS 患者血清中明顯升高引起內皮功能障礙，這為研究 OSAHS 并發心血管疾病的病理生理機制提供部分理論依據。此研究不足之處是我們沒有深入闡明是什么因素導致 miRNA-92a表達增多，而且 JC-1 染色提示內皮細胞線粒體功能障礙，仍需進一步探討 miRNA-92a 與內皮細胞線粒體功能障礙之間的內在作用機制。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
