引用本文： 徐靈彬, 韓新鵬, 吳昌歸. 二甲雙胍抑制哮喘模型大鼠氣道重塑的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(2): 95-100. doi: 10.7507/1671-6205.202008031 復制
支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病[1]，雖然有多種抗炎藥物以及支氣管舒張劑用于治療，但部分患者病情持續進展并出現氣道重塑，從而導致不完全可逆的阻塞性通氣功能障礙，因此尋找可預防或治療氣道重塑的藥物對這些患者的預后及生活質量的提升非常關鍵。二甲雙胍是廣泛使用的治療 2 型糖尿病的藥物，其在體外可抑制多種細胞的增殖，機制與一磷酸腺苷活化的蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（AMPK/mTOR）信號通路有關[2]。目前尚無關于二甲雙胍用于預防哮喘患者氣道重塑的研究，為了解二甲雙胍對哮喘患者氣道重塑的影響及作用機制，我們對哮喘大鼠模型給予二甲雙胍和雷帕霉素干預，觀察其對氣道重塑的影響，以期為哮喘氣道重塑尋求新的治療方法。
1 材料與方法
1.1 動物及分組
無特定病原（SPF）級別的 6～8 周齡雄性 B/N 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司并飼養在空軍軍醫大學藥物基因研究所動物中心（達 SPF 級別）。所有實驗遵從空軍軍醫大學動物倫理委員會制定的“實驗室動物管理原則”。實驗動物在安靜、無抗原、通風良好的環境中飼養，實驗室按晝夜節律采光 12 h，室溫保持 20～25 ℃，濕度保持在 40%～70%，動物可自由攝食、飲水。在適應性喂養 1 周后，28 只 B/N 大鼠隨機分為四組（每組 7 只）：對照組、哮喘組、二甲雙胍干預組（簡稱二甲雙胍組）和雷帕霉素干預組（簡稱雷帕霉素組）。
1.2 方法
1.2.1 致敏、激發及藥物干預
依照參考文獻[3]的方法利用卵清蛋白（OVA，V 級，Sigma-Aldrich 公司）制備哮喘模型方法。在適應性喂養大鼠 1 周后，哮喘組、二甲雙胍組和雷帕霉素組大鼠腹腔內注射 1 mL OVA 和 ImjectTM Alum Adjuvant（Thermo Scientific）的混合液進行致敏，混合液中 OVA 濃度為 100 mg/mL，氫氧化鋁濃度為 20 mg/mL，氫氧化鎂濃度為 20 mg/mL，對照組大鼠腹腔內注射等容積的 0.9% 的氯化鈉注射液。致敏共 3 次，每次間隔 7 d。從第 21 天開始對哮喘組、二甲雙胍組和雷帕霉素組大鼠使用壓縮空氣式霧化器霧化 10% 的 OVA 氯化鈉溶液 30 min 進行激發，激發每周 3 次，共 25 次；對照組使用壓縮空氣式霧化器霧化 0.9% 的氯化鈉注射液 30 min。二甲雙胍組在霧化激發干預前 30 min 根據體重予腹腔內注射 100 mg/kg 的二甲雙胍（溶媒 0.9% 氯化鈉注射液）和等體積二甲基亞砜（DMSO）溶液；雷帕霉素組在霧化激發干預前 30 min 根據體重分別予腹腔內注射 2 mg/kg 的雷帕霉素（溶媒為 DMSO）和等體積的 0.9% 氯化鈉注射液；哮喘組和對照組在霧化激發干預前予等體積的 0.9% 氯化鈉注射液和 DMSO 溶液。
1.2.2 大鼠氣道阻力及氣道反應性測定
在最后一次激發完成 48 h 后，使用 30 mg/kg 巴比妥腹腔注射麻醉后將大鼠固定在恒溫板上，并監測其直腸溫度。解剖大鼠氣管后在第二氣管環行氣管切開，置入直徑 2 mm 的聚乙烯導管并連接呼吸機，設置潮氣量 8 mL/kg，呼吸頻率 80 次/min，吸氣時間 0.25 s。腹腔內注射 10 mg/kg 的泮庫溴銨對大鼠進行肌松，使用吸氣阻斷法[4]測定大鼠的初始氣道阻力后，按梯度遞增吸入氯乙酰膽堿（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L 的乙酰膽堿）溶液后分別測試氣道阻力。每次測試前大鼠進行機械通氣 3～5 min，斷開呼吸機氣管插管連接恒速泵（設置潮氣量 3 mL，氣體流速 4 mL/s）同時監測并記錄氣管插管處的壓力，每次測試時間不超過 20 s。根據監測到的氣道峰壓與平臺壓等數據計算氣道阻力。
1.2.3 肺組織病理學檢查
測定完大鼠氣道阻力和氣道反應性后使用放血法處死大鼠，取大鼠的左肺組織進行固定、包埋、切片，分別使用蘇木精–伊紅染色觀察氣道炎癥細胞浸潤、過碘酸希夫（PAS）染色觀察氣道壁杯狀細胞增生、馬松三色染色觀察氣道壁纖維化和重塑情況。采用半定量評分（0～4）評價支氣管周圍炎癥細胞浸潤情況，0 分為正常；1 分是少量細胞浸潤；2 分為一層細胞環狀浸潤；3 分為 2～4 層細胞形成環狀浸潤；4 分是多于 4 層的細胞浸潤環。使用每高倍視野 PAS 陽性杯狀細胞面積定量氣道壁杯狀細胞增生情況；使用膠原纖維面積占高倍鏡視野面積的百分比表示肺組織中膠原纖維的沉積程度。
1.2.4 氣道平滑肌定量測量
對切片使用免疫組織化學 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）染色法測定氣道平滑肌增殖情況[5]。使用 Iamge-pro plus 6.0 軟件測量每一細支氣管壁 α-SMA 染色的面積，并測量每一細支氣管基底膜的長度。以單位長度的支氣管基底膜所含的 α-SMA 染色面積表示氣道壁的平滑肌增殖程度，每一張切片最少計數 10 個細支氣管。
1.2.5 蛋白印跡法檢測 AMPK/mTOR 通路蛋白、S 相激酶關聯蛋白 2 和 p21 表達
提取組織蛋白并定量后使用蛋白印跡法分別檢測組織中總 mTOR（t-mTOR）、磷酸化 mTOR（p-mTOR）、總核糖體蛋白質 S6 激酶 1（t-p70s6k1）、磷酸化核糖體蛋白質 S6 激酶 1（p-p70s6k1）、S 相激酶關聯蛋白 2（SKP2）及 p21 的表達，其中 p-mTOR 和 p-p70s6k1 的表達分別以 t-mTOR 和 t-p70s6k1 為參照，而 SKP2 和 p21 的表達以 β-actin 為參照。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 18.0 統計軟件。數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示，多組間比較分析采用單因素方差分析，均數間多重比較采用 Turkey 法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 氣道反應性測定
如圖 1 所示，吸入氯乙酰膽堿后氣道阻力逐漸升高。二甲雙胍或雷帕霉素干預可使氣道阻力降低（P<0.05），兩者具有相似的干預效果（P>0.05）。
圖1
各組大鼠的氣道阻力
與對照組比較，哮喘組大鼠在乙酰膽堿濃度為 0.01、0.1 和 1 mmol/L 時氣道阻力明顯增加（
2.2 肺組織病理學改變
對照組、哮喘組、雷帕霉素組和二甲雙胍組的肺組織炎癥程度評分分別為（0.4±0.1）、（3.5±0.2）、（2.1±0.2）和（1.9±0.1）分。與對照組比較，哮喘組上皮下、支氣管周圍以及血管周圍均出現了明顯的炎細胞浸潤，同時出現了氣道管徑狹窄、上皮下纖維化等改變，兩組的肺組織炎癥程度評分比較，差異有統計學意義（P<0.05）。與對照組比較，二甲雙胍組和雷帕霉素組肺組織中炎細胞浸潤以及氣道壁結構的變化明顯減輕（P<0.05），二甲雙胍組和雷帕霉素組間肺組織炎癥程度評分差異無統計學意義（P>0.05），兩者具有相似作用。結果見圖 2。
圖2
各組大鼠肺組織病理檢查像（蘇木精–伊紅×100）
反復的 OVA 激發可導致大鼠細支氣管壁上皮下、細支氣管周圍以及小血管周圍的炎癥反應，而二甲雙胍和雷帕霉素的干預能明顯減輕上述炎癥反應
2.3 氣道上皮中杯狀細胞增生
在 PAS 染色后，對照組、哮喘組、雷帕霉素組和二甲雙胍組的每高倍鏡下 PAS 陽性細胞面積分別為（0.65±0.11）、（30.36±6.46）、（9.88±2.60）和（11.85±3.43）μm2。哮喘組的細支氣管上皮細胞中 PAS 陽性的杯狀細胞較對照組明顯增加（P<0.01），而二甲雙胍組和雷帕霉素組 PAS 陽性細胞面積與哮喘組相比明顯減少（P<0.05）。結果見圖 3。
圖3
各組大鼠肺組織病理檢查像（PAS ×200）
反復的 OVA 激發可導致大鼠細支氣管上皮杯狀細胞明顯增生，而二甲雙胍和雷帕霉素的干預能明顯減少杯狀細胞增生
2.4 肺組織中膠原纖維的沉積
馬松三色染色后，對照組、哮喘組、雷帕霉素組和二甲雙胍組肺組織中膠原纖維的比例分別為（5.41±2.95）%、（22.94±4.12）%、（13.11±1.05）% 和（8.40±1.30）%。與對照組相比，哮喘組肺組織中膠原纖維沉積明顯增加（P<0.01），而在激發前腹腔內注射二甲雙胍或雷帕霉素，可明顯減輕肺組織中膠原纖維沉積（P<0.05）。結果見圖 4。
圖4
各組大鼠肺組織病理檢查像（馬松三色×200）
反復的 OVA 激發可導致大鼠肺組織中膠原纖維沉積，而二甲雙胍和雷帕霉素的干預能明顯減少肺組織中膠原纖維沉積
2.5 支氣管平滑肌增生
對照組、哮喘組、雷帕霉素組和二甲雙胍組肺組織中細支氣管壁的 α-SMA 染色陽性區域分別為（4.60±0.21）、（7.20±0.28）、（5.82±0.28）和（6.05±0.38）μm2/μm。與對照組相比，哮喘組中細支氣管壁的 α-SMA 染色陽性區域明顯增加（P<0.01），二甲雙胍組細支氣管壁的 α-SMA 染色陽性區域較哮喘組減少（P<0.05），使用雷帕霉素干預亦具有相似效應，二甲雙胍組與雷帕霉素組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 5。
圖5
各組大鼠肺組織病理檢查像（α-SMA ×200）
反復的 OVA 激發可導致大鼠細支氣管壁氣道平滑肌明顯增生，而二甲雙胍和雷帕霉素的治療能明顯減少氣道平滑肌增生
2.6 肺組織中 AMPK/mTOR 通路相關蛋白表達情況
與對照組相比，哮喘組肺組織中 p-mTOR、p-p70s6k1 蛋白表達明顯增加，其中 p-mTOR 表達增加了（1.40±0.04）倍（P<0.01），而 p-p70s6k1 表達增加了（1.55±0.10）倍（P<0.01）。與哮喘組比較，二甲雙胍組 p-mTOR 和 p-p70s6k1 表達顯著降低（圖 6），與對照組相似。與對照組相比，哮喘組 SKP2 表達明顯增加，而 p21 蛋白表達明顯減少。二甲雙胍干預后，SKP2 表達較哮喘組明顯減少，而 p21 蛋白表達明顯增加（均 P <0.05）。雷帕霉素干預后對上述分子的表達具有類似影響，二甲雙胍組與雷帕霉素組比較，差異均無統計學意義（均 P>0.05）。
圖6
p-mTOR、p-p70s6k1、SKP2 和 p21 蛋白在各組大鼠肺組織中的表達情況
3 討論
有關哮喘發病機制的研究、新治療方法的評價都依賴于動物實驗，但動物自發形成的哮喘很少見，哮喘動物模型都需外源性抗原反復刺激才能建立[3]。B/N 大鼠是常用的模擬人類支氣管哮喘的一種動物，其致敏常用的方法有 OVA 致敏、塵螨致敏等，其中 OVA 致敏方案是使用最廣泛的構建哮喘模型動物的方法[3, 6-7]，在本研究中哮喘組大鼠的氣道反應性測定和肺組織病理學檢查均證實了哮喘模型動物的建立是成功的。
氣道慢性炎癥是哮喘的主要病理改變，氣道高反應性是哮喘的主要病理生理特征。氣道炎癥反復發作或持續存在，可能導致氣道重塑，而氣道重塑使哮喘患者對現有抗炎藥和支氣管舒張劑反應不佳，肺功能表現為不完全可逆的氣道阻塞[8]。氣道重塑涉及整個氣道壁的結構，包括細胞外基質蛋白沉積增加、上皮下纖維化、杯狀細胞化生、黏液腺肥大、平滑肌增生和肥大以及上皮受損，其中支氣管平滑肌細胞的肥大、增殖是哮喘患者氣道重塑的重要特征[8-9]。文獻報道二甲雙胍可以通過降低趨化因子和炎癥因子的表達，從而減少炎性細胞浸潤，發揮抗炎的作用。Calixto 等[10]發現二甲雙胍能抑制高脂誘導的肥胖型哮喘小鼠 BALF 中炎性細胞的滲出；Park 等[11]在 OVA 和真菌相關變應原蛋白誘導哮喘小鼠中也觀察到此現象，并且對 AMPK 缺陷的模型哮喘小鼠與野生型哮喘小鼠進行比較，同時給予二甲雙胍干預后發現，AMPK 缺陷小鼠肺部嗜酸性粒細胞浸潤及氣道重塑加重，提示二甲雙胍的作用依賴于 AMPK 的活化。本研究亦證實：哮喘組大鼠氣道周圍和血管周圍的炎性細胞浸潤較對照組明顯增加，二甲雙胍能明顯緩解哮喘模型動物氣道周圍和血管周圍的炎性細胞浸潤。而氣道反應性的測定提示哮喘組大鼠吸入高濃度的氯乙酰膽堿后氣道阻力較對照組明顯增加，使用二甲雙胍干預后，大鼠在吸入高濃度氯乙酰膽堿后，氣道阻力較哮喘組明顯降低，提示二甲雙胍可有效地降低模型大鼠的氣道高反應性。因此有理由推測二甲雙胍是通過激活 AMPK 導致的抗炎作用減輕了哮喘模型動物的氣道周圍炎癥，從而改善了其氣道反應性。
氣道平滑肌的增生和肥大是哮喘氣道重塑的一個重要特征改變。在體外細胞培養中發現二甲雙胍可抑制包括多種腫瘤細胞系在內的細胞增殖，動物實驗也證實二甲雙胍存在明顯的抗炎、抑制血管壁重塑等多重作用且與激活 AMPK 通路有關[12-13]。AMPK 抑制細胞的增殖可能與其負性調控 mTOR 通路有關，當細胞內 AMP/ATP 比例增高時，AMPK 被激活，AMPK 活化使結節硬化性復合體 2 磷酸化，從而負性調控 mTOR1，使蛋白合成受阻，從而抑制細胞生長、增殖[14]。本研究證實：二甲雙胍與雷帕霉素能抑制支氣管氣道上皮細胞中杯狀細胞增生、黏液腺的分泌、內皮下及細支氣管周圍膠原蛋白沉積、纖維化等變化，同時也減輕細支氣管中膜平滑肌細胞增生和肥大。為進一步研究二甲雙胍抑制哮喘模型動物氣道重塑的作用機制，我們使用蛋白印跡法測定了肺組織中 mTOR 及其磷酸化水平以及 mTOR 下游的 p70s6k1 及其磷酸化水平。結果表明：肺組織中 t-mTOR 和 t-p70s6k1 無明顯變化，而哮喘組 p-mTOR 及其下游的 p-p70s6k1 表達較對照組明顯增加，表明哮喘模型動物肺組織中 mTOR 通路被激活，可能是導致氣道重塑的重要環節。在本研究中，雷帕霉素通過抑制 mTOR 的磷酸化，明顯減輕了哮喘模型大鼠氣道上皮中杯狀細胞的增生、氣道壁及肺組織中膠原纖維的沉積以及細支氣管平滑肌的增生、肥大。而二甲雙胍干預組亦得到了雷帕霉素干預相似的結果，推測二甲雙胍干預可能通過激活 AMPK，進而負性調控 mTOR 通路，達到減輕氣道重塑的效果。
p21 蛋白是有效的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑。p21 結合并抑制 cyclin-CDK2、cyclin-CDK1 和 cyclin-CDK4/6 復合物的活性，從而起到 G1 和 S 期細胞周期進程調節的作用。而 p21 蛋白水平的調節是通過泛素化和蛋白酶體降解而下調[15]。SKP2 是一種能與 S 期激酶 cyclinA-CDK1 相互作用的蛋白，作為 F-box 蛋白家族中的一員，SKP2 是構成泛素連接酶復合物的主要成分之一，能特異性識別磷酸化底物并介導其泛素化降解，從而參與細胞周期的調控。泛素連接酶可使泛素連接至 p21 及 p27 等蛋白分子上，介導 p21 及 p27 蛋白的降解[16]。研究報道，激活 mTOR 信號通路可以上調 SKP2 表達，從而降低 p21 和 p27 的濃度，并使細胞從 G1 期進入 S 期，促進細胞增殖[17]。在本實驗中，哮喘模型大鼠的肺組織中 SKP2 表達增加，而 p21 蛋白表達減少，而通過抑制 mTOR 活性（雷帕霉素直接抑制或通過激活 AMPK 后抑制 mTOR 活性），SKP2 表達下調伴隨有 p21 蛋白表達的上調。以上結果提示在哮喘模型動物中，SKP2 表達增強，使 p21 降解增加，細胞從 G1 期向 S 期的轉換，促進細胞增殖，從而造成氣道的重塑。
綜上所述，二甲雙胍可以通過激活 AMPK、進而抑制 mTOR 通路來緩解哮喘模型動物的氣道高反應性，并抑制其氣道的重塑，二甲雙胍有可能成為治療哮喘和預防氣道重塑新的選擇，但二甲雙胍是否能夠有效緩解哮喘患者的氣道反應性并抑制氣道重塑尚需進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病[1]，雖然有多種抗炎藥物以及支氣管舒張劑用于治療，但部分患者病情持續進展并出現氣道重塑，從而導致不完全可逆的阻塞性通氣功能障礙，因此尋找可預防或治療氣道重塑的藥物對這些患者的預后及生活質量的提升非常關鍵。二甲雙胍是廣泛使用的治療 2 型糖尿病的藥物，其在體外可抑制多種細胞的增殖，機制與一磷酸腺苷活化的蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（AMPK/mTOR）信號通路有關[2]。目前尚無關于二甲雙胍用于預防哮喘患者氣道重塑的研究，為了解二甲雙胍對哮喘患者氣道重塑的影響及作用機制，我們對哮喘大鼠模型給予二甲雙胍和雷帕霉素干預，觀察其對氣道重塑的影響，以期為哮喘氣道重塑尋求新的治療方法。
1 材料與方法
1.1 動物及分組
無特定病原（SPF）級別的 6～8 周齡雄性 B/N 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司并飼養在空軍軍醫大學藥物基因研究所動物中心（達 SPF 級別）。所有實驗遵從空軍軍醫大學動物倫理委員會制定的“實驗室動物管理原則”。實驗動物在安靜、無抗原、通風良好的環境中飼養，實驗室按晝夜節律采光 12 h，室溫保持 20～25 ℃，濕度保持在 40%～70%，動物可自由攝食、飲水。在適應性喂養 1 周后，28 只 B/N 大鼠隨機分為四組（每組 7 只）：對照組、哮喘組、二甲雙胍干預組（簡稱二甲雙胍組）和雷帕霉素干預組（簡稱雷帕霉素組）。
1.2 方法
1.2.1 致敏、激發及藥物干預
依照參考文獻[3]的方法利用卵清蛋白（OVA，V 級，Sigma-Aldrich 公司）制備哮喘模型方法。在適應性喂養大鼠 1 周后，哮喘組、二甲雙胍組和雷帕霉素組大鼠腹腔內注射 1 mL OVA 和 ImjectTM Alum Adjuvant（Thermo Scientific）的混合液進行致敏，混合液中 OVA 濃度為 100 mg/mL，氫氧化鋁濃度為 20 mg/mL，氫氧化鎂濃度為 20 mg/mL，對照組大鼠腹腔內注射等容積的 0.9% 的氯化鈉注射液。致敏共 3 次，每次間隔 7 d。從第 21 天開始對哮喘組、二甲雙胍組和雷帕霉素組大鼠使用壓縮空氣式霧化器霧化 10% 的 OVA 氯化鈉溶液 30 min 進行激發，激發每周 3 次，共 25 次；對照組使用壓縮空氣式霧化器霧化 0.9% 的氯化鈉注射液 30 min。二甲雙胍組在霧化激發干預前 30 min 根據體重予腹腔內注射 100 mg/kg 的二甲雙胍（溶媒 0.9% 氯化鈉注射液）和等體積二甲基亞砜（DMSO）溶液；雷帕霉素組在霧化激發干預前 30 min 根據體重分別予腹腔內注射 2 mg/kg 的雷帕霉素（溶媒為 DMSO）和等體積的 0.9% 氯化鈉注射液；哮喘組和對照組在霧化激發干預前予等體積的 0.9% 氯化鈉注射液和 DMSO 溶液。
1.2.2 大鼠氣道阻力及氣道反應性測定
在最后一次激發完成 48 h 后，使用 30 mg/kg 巴比妥腹腔注射麻醉后將大鼠固定在恒溫板上，并監測其直腸溫度。解剖大鼠氣管后在第二氣管環行氣管切開，置入直徑 2 mm 的聚乙烯導管并連接呼吸機，設置潮氣量 8 mL/kg，呼吸頻率 80 次/min，吸氣時間 0.25 s。腹腔內注射 10 mg/kg 的泮庫溴銨對大鼠進行肌松，使用吸氣阻斷法[4]測定大鼠的初始氣道阻力后，按梯度遞增吸入氯乙酰膽堿（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L 的乙酰膽堿）溶液后分別測試氣道阻力。每次測試前大鼠進行機械通氣 3～5 min，斷開呼吸機氣管插管連接恒速泵（設置潮氣量 3 mL，氣體流速 4 mL/s）同時監測并記錄氣管插管處的壓力，每次測試時間不超過 20 s。根據監測到的氣道峰壓與平臺壓等數據計算氣道阻力。
1.2.3 肺組織病理學檢查
測定完大鼠氣道阻力和氣道反應性后使用放血法處死大鼠，取大鼠的左肺組織進行固定、包埋、切片，分別使用蘇木精–伊紅染色觀察氣道炎癥細胞浸潤、過碘酸希夫（PAS）染色觀察氣道壁杯狀細胞增生、馬松三色染色觀察氣道壁纖維化和重塑情況。采用半定量評分（0～4）評價支氣管周圍炎癥細胞浸潤情況，0 分為正常；1 分是少量細胞浸潤；2 分為一層細胞環狀浸潤；3 分為 2～4 層細胞形成環狀浸潤；4 分是多于 4 層的細胞浸潤環。使用每高倍視野 PAS 陽性杯狀細胞面積定量氣道壁杯狀細胞增生情況；使用膠原纖維面積占高倍鏡視野面積的百分比表示肺組織中膠原纖維的沉積程度。
1.2.4 氣道平滑肌定量測量
對切片使用免疫組織化學 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）染色法測定氣道平滑肌增殖情況[5]。使用 Iamge-pro plus 6.0 軟件測量每一細支氣管壁 α-SMA 染色的面積，并測量每一細支氣管基底膜的長度。以單位長度的支氣管基底膜所含的 α-SMA 染色面積表示氣道壁的平滑肌增殖程度，每一張切片最少計數 10 個細支氣管。
1.2.5 蛋白印跡法檢測 AMPK/mTOR 通路蛋白、S 相激酶關聯蛋白 2 和 p21 表達
提取組織蛋白并定量后使用蛋白印跡法分別檢測組織中總 mTOR（t-mTOR）、磷酸化 mTOR（p-mTOR）、總核糖體蛋白質 S6 激酶 1（t-p70s6k1）、磷酸化核糖體蛋白質 S6 激酶 1（p-p70s6k1）、S 相激酶關聯蛋白 2（SKP2）及 p21 的表達，其中 p-mTOR 和 p-p70s6k1 的表達分別以 t-mTOR 和 t-p70s6k1 為參照，而 SKP2 和 p21 的表達以 β-actin 為參照。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 18.0 統計軟件。數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示，多組間比較分析采用單因素方差分析，均數間多重比較采用 Turkey 法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 氣道反應性測定
如圖 1 所示，吸入氯乙酰膽堿后氣道阻力逐漸升高。二甲雙胍或雷帕霉素干預可使氣道阻力降低（P<0.05），兩者具有相似的干預效果（P>0.05）。
圖1
各組大鼠的氣道阻力
與對照組比較，哮喘組大鼠在乙酰膽堿濃度為 0.01、0.1 和 1 mmol/L 時氣道阻力明顯增加（
2.2 肺組織病理學改變
對照組、哮喘組、雷帕霉素組和二甲雙胍組的肺組織炎癥程度評分分別為（0.4±0.1）、（3.5±0.2）、（2.1±0.2）和（1.9±0.1）分。與對照組比較，哮喘組上皮下、支氣管周圍以及血管周圍均出現了明顯的炎細胞浸潤，同時出現了氣道管徑狹窄、上皮下纖維化等改變，兩組的肺組織炎癥程度評分比較，差異有統計學意義（P<0.05）。與對照組比較，二甲雙胍組和雷帕霉素組肺組織中炎細胞浸潤以及氣道壁結構的變化明顯減輕（P<0.05），二甲雙胍組和雷帕霉素組間肺組織炎癥程度評分差異無統計學意義（P>0.05），兩者具有相似作用。結果見圖 2。
圖2
各組大鼠肺組織病理檢查像（蘇木精–伊紅×100）
反復的 OVA 激發可導致大鼠細支氣管壁上皮下、細支氣管周圍以及小血管周圍的炎癥反應，而二甲雙胍和雷帕霉素的干預能明顯減輕上述炎癥反應
2.3 氣道上皮中杯狀細胞增生
在 PAS 染色后，對照組、哮喘組、雷帕霉素組和二甲雙胍組的每高倍鏡下 PAS 陽性細胞面積分別為（0.65±0.11）、（30.36±6.46）、（9.88±2.60）和（11.85±3.43）μm2。哮喘組的細支氣管上皮細胞中 PAS 陽性的杯狀細胞較對照組明顯增加（P<0.01），而二甲雙胍組和雷帕霉素組 PAS 陽性細胞面積與哮喘組相比明顯減少（P<0.05）。結果見圖 3。
圖3
各組大鼠肺組織病理檢查像（PAS ×200）
反復的 OVA 激發可導致大鼠細支氣管上皮杯狀細胞明顯增生，而二甲雙胍和雷帕霉素的干預能明顯減少杯狀細胞增生
2.4 肺組織中膠原纖維的沉積
馬松三色染色后，對照組、哮喘組、雷帕霉素組和二甲雙胍組肺組織中膠原纖維的比例分別為（5.41±2.95）%、（22.94±4.12）%、（13.11±1.05）% 和（8.40±1.30）%。與對照組相比，哮喘組肺組織中膠原纖維沉積明顯增加（P<0.01），而在激發前腹腔內注射二甲雙胍或雷帕霉素，可明顯減輕肺組織中膠原纖維沉積（P<0.05）。結果見圖 4。
圖4
各組大鼠肺組織病理檢查像（馬松三色×200）
反復的 OVA 激發可導致大鼠肺組織中膠原纖維沉積，而二甲雙胍和雷帕霉素的干預能明顯減少肺組織中膠原纖維沉積
2.5 支氣管平滑肌增生
對照組、哮喘組、雷帕霉素組和二甲雙胍組肺組織中細支氣管壁的 α-SMA 染色陽性區域分別為（4.60±0.21）、（7.20±0.28）、（5.82±0.28）和（6.05±0.38）μm2/μm。與對照組相比，哮喘組中細支氣管壁的 α-SMA 染色陽性區域明顯增加（P<0.01），二甲雙胍組細支氣管壁的 α-SMA 染色陽性區域較哮喘組減少（P<0.05），使用雷帕霉素干預亦具有相似效應，二甲雙胍組與雷帕霉素組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 5。
圖5
各組大鼠肺組織病理檢查像（α-SMA ×200）
反復的 OVA 激發可導致大鼠細支氣管壁氣道平滑肌明顯增生，而二甲雙胍和雷帕霉素的治療能明顯減少氣道平滑肌增生
2.6 肺組織中 AMPK/mTOR 通路相關蛋白表達情況
與對照組相比，哮喘組肺組織中 p-mTOR、p-p70s6k1 蛋白表達明顯增加，其中 p-mTOR 表達增加了（1.40±0.04）倍（P<0.01），而 p-p70s6k1 表達增加了（1.55±0.10）倍（P<0.01）。與哮喘組比較，二甲雙胍組 p-mTOR 和 p-p70s6k1 表達顯著降低（圖 6），與對照組相似。與對照組相比，哮喘組 SKP2 表達明顯增加，而 p21 蛋白表達明顯減少。二甲雙胍干預后，SKP2 表達較哮喘組明顯減少，而 p21 蛋白表達明顯增加（均 P <0.05）。雷帕霉素干預后對上述分子的表達具有類似影響，二甲雙胍組與雷帕霉素組比較，差異均無統計學意義（均 P>0.05）。
圖6
p-mTOR、p-p70s6k1、SKP2 和 p21 蛋白在各組大鼠肺組織中的表達情況
3 討論
有關哮喘發病機制的研究、新治療方法的評價都依賴于動物實驗，但動物自發形成的哮喘很少見，哮喘動物模型都需外源性抗原反復刺激才能建立[3]。B/N 大鼠是常用的模擬人類支氣管哮喘的一種動物，其致敏常用的方法有 OVA 致敏、塵螨致敏等，其中 OVA 致敏方案是使用最廣泛的構建哮喘模型動物的方法[3, 6-7]，在本研究中哮喘組大鼠的氣道反應性測定和肺組織病理學檢查均證實了哮喘模型動物的建立是成功的。
氣道慢性炎癥是哮喘的主要病理改變，氣道高反應性是哮喘的主要病理生理特征。氣道炎癥反復發作或持續存在，可能導致氣道重塑，而氣道重塑使哮喘患者對現有抗炎藥和支氣管舒張劑反應不佳，肺功能表現為不完全可逆的氣道阻塞[8]。氣道重塑涉及整個氣道壁的結構，包括細胞外基質蛋白沉積增加、上皮下纖維化、杯狀細胞化生、黏液腺肥大、平滑肌增生和肥大以及上皮受損，其中支氣管平滑肌細胞的肥大、增殖是哮喘患者氣道重塑的重要特征[8-9]。文獻報道二甲雙胍可以通過降低趨化因子和炎癥因子的表達，從而減少炎性細胞浸潤，發揮抗炎的作用。Calixto 等[10]發現二甲雙胍能抑制高脂誘導的肥胖型哮喘小鼠 BALF 中炎性細胞的滲出；Park 等[11]在 OVA 和真菌相關變應原蛋白誘導哮喘小鼠中也觀察到此現象，并且對 AMPK 缺陷的模型哮喘小鼠與野生型哮喘小鼠進行比較，同時給予二甲雙胍干預后發現，AMPK 缺陷小鼠肺部嗜酸性粒細胞浸潤及氣道重塑加重，提示二甲雙胍的作用依賴于 AMPK 的活化。本研究亦證實：哮喘組大鼠氣道周圍和血管周圍的炎性細胞浸潤較對照組明顯增加，二甲雙胍能明顯緩解哮喘模型動物氣道周圍和血管周圍的炎性細胞浸潤。而氣道反應性的測定提示哮喘組大鼠吸入高濃度的氯乙酰膽堿后氣道阻力較對照組明顯增加，使用二甲雙胍干預后，大鼠在吸入高濃度氯乙酰膽堿后，氣道阻力較哮喘組明顯降低，提示二甲雙胍可有效地降低模型大鼠的氣道高反應性。因此有理由推測二甲雙胍是通過激活 AMPK 導致的抗炎作用減輕了哮喘模型動物的氣道周圍炎癥，從而改善了其氣道反應性。
氣道平滑肌的增生和肥大是哮喘氣道重塑的一個重要特征改變。在體外細胞培養中發現二甲雙胍可抑制包括多種腫瘤細胞系在內的細胞增殖，動物實驗也證實二甲雙胍存在明顯的抗炎、抑制血管壁重塑等多重作用且與激活 AMPK 通路有關[12-13]。AMPK 抑制細胞的增殖可能與其負性調控 mTOR 通路有關，當細胞內 AMP/ATP 比例增高時，AMPK 被激活，AMPK 活化使結節硬化性復合體 2 磷酸化，從而負性調控 mTOR1，使蛋白合成受阻，從而抑制細胞生長、增殖[14]。本研究證實：二甲雙胍與雷帕霉素能抑制支氣管氣道上皮細胞中杯狀細胞增生、黏液腺的分泌、內皮下及細支氣管周圍膠原蛋白沉積、纖維化等變化，同時也減輕細支氣管中膜平滑肌細胞增生和肥大。為進一步研究二甲雙胍抑制哮喘模型動物氣道重塑的作用機制，我們使用蛋白印跡法測定了肺組織中 mTOR 及其磷酸化水平以及 mTOR 下游的 p70s6k1 及其磷酸化水平。結果表明：肺組織中 t-mTOR 和 t-p70s6k1 無明顯變化，而哮喘組 p-mTOR 及其下游的 p-p70s6k1 表達較對照組明顯增加，表明哮喘模型動物肺組織中 mTOR 通路被激活，可能是導致氣道重塑的重要環節。在本研究中，雷帕霉素通過抑制 mTOR 的磷酸化，明顯減輕了哮喘模型大鼠氣道上皮中杯狀細胞的增生、氣道壁及肺組織中膠原纖維的沉積以及細支氣管平滑肌的增生、肥大。而二甲雙胍干預組亦得到了雷帕霉素干預相似的結果，推測二甲雙胍干預可能通過激活 AMPK，進而負性調控 mTOR 通路，達到減輕氣道重塑的效果。
p21 蛋白是有效的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑。p21 結合并抑制 cyclin-CDK2、cyclin-CDK1 和 cyclin-CDK4/6 復合物的活性，從而起到 G1 和 S 期細胞周期進程調節的作用。而 p21 蛋白水平的調節是通過泛素化和蛋白酶體降解而下調[15]。SKP2 是一種能與 S 期激酶 cyclinA-CDK1 相互作用的蛋白，作為 F-box 蛋白家族中的一員，SKP2 是構成泛素連接酶復合物的主要成分之一，能特異性識別磷酸化底物并介導其泛素化降解，從而參與細胞周期的調控。泛素連接酶可使泛素連接至 p21 及 p27 等蛋白分子上，介導 p21 及 p27 蛋白的降解[16]。研究報道，激活 mTOR 信號通路可以上調 SKP2 表達，從而降低 p21 和 p27 的濃度，并使細胞從 G1 期進入 S 期，促進細胞增殖[17]。在本實驗中，哮喘模型大鼠的肺組織中 SKP2 表達增加，而 p21 蛋白表達減少，而通過抑制 mTOR 活性（雷帕霉素直接抑制或通過激活 AMPK 后抑制 mTOR 活性），SKP2 表達下調伴隨有 p21 蛋白表達的上調。以上結果提示在哮喘模型動物中，SKP2 表達增強，使 p21 降解增加，細胞從 G1 期向 S 期的轉換，促進細胞增殖，從而造成氣道的重塑。
綜上所述，二甲雙胍可以通過激活 AMPK、進而抑制 mTOR 通路來緩解哮喘模型動物的氣道高反應性，并抑制其氣道的重塑，二甲雙胍有可能成為治療哮喘和預防氣道重塑新的選擇，但二甲雙胍是否能夠有效緩解哮喘患者的氣道反應性并抑制氣道重塑尚需進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
