引用本文： 拉周措毛, 李玲義, 高瑞, 劉虹. 藏、漢族OSAHS患者血液流變學指標以及PI3K/AKT/NF-κB p65信號通路中HIF-1α/2α表達的差異性研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(7): 471-477. doi: 10.7507/1671-6205.202007070 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是一種常見的慢性病，臨床表現為夜間打鼾、白天嗜睡、認知功能衰退等[1]。男性OSAHS患病率為2%～4%，女性患病率為1%～2%。研究發現世代居住在高原的藏族在氧的攝取、運輸與利用方面明顯優于漢族[2]，在呼吸暫停低通氣指數（apnea-hypopnea index，AHI）相近的情況下，藏族中重度OSAHS患者睡眠時平均血氧飽和度和睡眠期最低血氧飽和度明顯低于漢族[3]。OSAHS易導致心血管疾病以及代謝性疾病，是缺血性腦卒中[4]、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[5]、肺動脈栓塞[6]等血栓性疾病的獨立危險因素。間歇性缺氧是OSAHS的標志性表現，低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/低氧誘導因子2α（hypoxia-inducible factor-2α，HIF-2α）是調節間歇性缺氧的關鍵基因，也是目前臨床上較為認可的OSAHS的診斷標志物[7-8]，其上游的PI3K/AKT/NF-κB p65是參與多種慢性炎癥疾病病理的重要通路，其中包括OSAHS[9]。本研究擬探討藏族和漢族OSAHS患者血液流變學以及血液代謝中HIF-1α/2α表達水平的差異性。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 臨床資料
納入2017年1月—2019年12月在青海大學附屬醫院經多導睡眠圖（polysomnography，PSG）確診的藏族OSAHS患者（簡稱T-OSAHS組）、漢族OSAHS患者（簡稱H-OSAHS組），以及接受體檢的藏族健康人（簡稱T-HP組）、漢族健康人（簡稱H-HP組），每組30例。AHI是每小時睡眠中呼吸暫停和低通氣的總和，已被廣泛用作OSAHS的診斷和評估標準[10]。本研究中健康人的AHI<5次/h，重度OSAHS患者的AHI>20次/h。OSAHS診斷標準參照我國2009年制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診斷和外科治療指南》及美國睡眠醫學會2009年制定的《成人阻塞性睡眠呼吸暫停評價、管理與長期治療臨床指南》。藏族受試者納入標準：（1）長期生活于海拔2260 m至少3年的藏族人；（2）家人3代以內與其他民族均未通婚。排除標準：（1）有其他睡眠障礙［國際睡眠障礙分類（ICSD-II）診斷］或接受過與睡眠有關的呼吸障礙治療的病史；（2）合并有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、肺血栓栓塞癥、深靜脈血栓形成、缺血性腦卒中、近期有感染、手術或創傷的患者；（3）懷孕或者哺乳期的女性。該研究得到了青海大學附屬醫院醫學倫理委員會和生物安全管理委員會的審查和批準（AF-RHEC-0062-01號）。所有參與者均簽署知情同意書并積極配合該項研究。
1.1.2 試劑
TRIzol、逆轉錄試劑盒、實時逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）試劑均購自大連Takara公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；人外周血單核細胞分離液試劑盒購自上海研謹生物科技公司；一抗兔抗磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K；ab32089，英國Abcam公司）；一抗兔抗絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT；ab38449，英國Abcam公司）；一抗兔抗核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65抗體（ab32536，英國Abcam公司）；一抗兔抗HIF-1α抗體（ab51608，英國Abcam公司）；一抗兔抗HIF-2α抗體（ab109616，英國Abcam公司）；二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718，英國Abcam公司）；RIPA裂解液、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體和鼠源IgG抗體購自康為世紀生物科技有限公司。
1.1.3 主要儀器設備
全自動血液分析儀（日本Sysmex XE 21000，Hysenmek）；全自動清洗旋轉式錐板式全血黏度儀（北京宏潤達科技發展有限公司）；超凈臺（山東博科生物產業有限公司）；實時熒光定量PCR儀和凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；多導睡眠檢測儀（美國飛利浦Alex 6）。
1.2 方法
1.2.1 基線觀察指標
對參與者的性別、年齡、體重指數（body mass index，BMI）進行采集和比較，對OSAHS患者的睡眠進行監測。睡眠監測采用便攜式多導睡眠圖檢測儀，主要檢測夜間連續的呼吸、動脈血氧飽和度、腦電圖、心電圖、心率等指標。PSG記錄睡眠狀態人體的多種電生理活動，如眼球運動波、腦電波、肌肉活動電波、呼吸動作等，綜合分析以上活動，對睡眠質量和異常情況進行評估。監測前患者應避免劇烈運動，保持情緒穩定，監測當日白天盡量少睡，以保證夜間睡眠質量。
1.2.2 血樣的采集與處理
所有受試者在入院次日或體檢當日早晨7點，抽取肘前靜脈血15 mL，其中10 mL置于肝素抗凝試管中，另外5 mL加入乙二胺四乙酸抗凝管中用于分離細胞。5 mL的血漿送至青海大學附屬醫院檢驗科用全自動血液分析儀進行血常規檢測，測定受試者靜脈血中紅細胞計數、血紅蛋白的含量及紅細胞比容。另外5 mL血漿采用全自動清洗旋轉式錐板式全血黏度儀檢測血樣的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血漿黏度比和紅細胞聚集指數。
1.2.3 受試者外周血單個核細胞的分離
將乙二胺四乙酸抗凝管中的血液，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，–80 ℃保存備用。
1.2.4 RNA提取及RT-qPCR檢測受試者外周血單個核細胞中PI3K、AKT、NF-κB p65、HIF-1α和HIF-2α mRNA水平
使用TRIzol試劑提取外周血單個核細胞總RNA，操作過程嚴格按照制造商的說明書進行。測定總RNA濃度，通過反轉錄合成cDNA，將其作為模板進行RT-qPCR。反轉錄條件為：95 ℃預變性1 min；94 ℃變性1 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，總共35個循環。以GAPDH作為內參，采用2–△△Ct法對結果進行計算。引物序列見表1。
表1
引物序列
1.2.5 蛋白免疫印跡檢測外周血單個核細胞中PI3K、AKT、NF-κB p65、HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平
采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達水平。使用RIPA裂解液提取外周血單個核細胞的總蛋白，通過BCA試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，將其轉移到PVDF膜上，隨后用5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，分別用相應的抗PI3K（稀釋比1∶400）、抗AKT（稀釋比1∶300）、抗NF-κB p65（稀釋比1∶400）、抗HIF-1α（稀釋比1∶300）、抗HIF-2α（稀釋比1∶300）抗體4 ℃孵育過夜，用含吐溫20的Tris鹽緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）漂洗之后，與HRP標記的IgG抗體（稀釋比1∶1000）室溫孵育1 h。TBST漂洗，ECL顯影液顯影。基于每種蛋白質與GAPDH的灰度比，使用Image J軟件進行蛋白質定量分析。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件。符合正態分布的計量數據均用均數±標準差（
±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，三組及三組以上比較采用ANOVA方差分析，隨后采用Tukey-Kramer校正進行多重比較。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人的基本資料比較
由表2可見本調查中藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人性別和年齡的基本情況：H-OSAHS組的BMI與H-HP組相比差異無統計學意義（P>0.05），H-OSAHS組的BMI與T-OSAHS組相比差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
四組受試者基本情況［例/（
）］
2.2 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人的血液指標比較
藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人血液中的紅細胞數目差異均不顯著（P>0.05）。與藏族健康人相比，藏族OSAHS患者血液中的血紅蛋白含量顯著增加（P<0.05）；與漢族健康人相比，漢族OSAHS患者血液中的血紅蛋白含量顯著增加（P<0.05）；與藏族OSAHS患者相比，漢族OSAHS患者血液中的血紅蛋白含量無顯著改變（P>0.05）。結果見表3。
表3
各組血液指標比較（
）
2.3 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人血液流變學指標的比較
與藏族健康人相比，藏族OSAHS患者的全血黏度高剪切率（圖1a）、全血黏度低剪切率（圖1b）、血漿黏度比（圖1c）、紅細胞聚集指數（圖1d）和紅細胞比容（圖1e）均顯著增加（均 P<0.05），且漢族OSAHS患者的上述血液流變學指標均顯著高于漢族健康人（均 P<0.05）。但是，與藏族OSAHS患者相比，漢族OSAHS患者的上述5種血液流變學指標均顯著降低（均 P<0.05）。
圖1
四組受試者的血液流變學指標比較
a. 全血黏度高剪切率；b. 全血黏度低剪切率；c. 血漿黏度比；d. 紅細胞聚集指數；e. 紅細胞比容。與T-HP組比較，*
2.4 藏、漢族OSAHS患者血紅蛋白與血流變指標的相關性關系
藏族OSAHS患者和漢族OSAHS患者血紅蛋白與全血黏度高剪切率和紅細胞聚集指數均呈正相關性（P<0.05），而與全血黏度剪切率、血漿黏度比和紅細胞比容均無顯著相關性（P>0.05）。結果見表4。
表4
藏族和漢族OSAHS患者血紅蛋白與血液流變學指標的相關性
2.5 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人外周血單個核細胞中基因mRNA水平的比較
藏族OSAHS患者外周血單個核細胞中PI3K（圖2a）、AKT（圖2b）、NF-κB p65（圖2c）和HIF-1α（圖2d）水平顯著高于藏族健康人（均 P<0.05），而HIF-2α（圖2e）的mRNA水平顯著低于藏族健康人（P<0.05）。漢族OSAHS患者的外周血單個核細胞中PI3K、AKT、NF-κB p65和HIF-1α基因的mRNA水平顯著高于漢族健康人（均 P<0.05），而HIF-2α的mRNA水平顯著低于漢族健康人（P<0.05）。另外，與藏族OSAHS患者相比，漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中PI3K、AKT、NF-κB p65和HIF-1α基因的mRNA水平顯著降低（均 P<0.05），而HIF-2α的mRNA水平顯著增加（均 P<0.05）。
圖2
四組受試者外周血單個核細胞基因mRNA水平比較
a. PI3K；b. AKT；c. NF-κB p65；d. HIF-1α；e. HIF-2α。與T-HP組比較，*
2.6 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人外周血單個核細胞中基因蛋白水平的比較
藏族OSAHS患者外周血單個核細胞中PI3K（圖3a）、p-AKT（圖3b）、NF-κB p65（圖3c）和HIF-1α（圖3d）的蛋白水平顯著高于藏族健康人（均P<0.05），而藏族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-2α（圖3e）的蛋白水平顯著低于藏族健康人（P<0.05）。與漢族健康人相比，漢族OSAHS患者的外周血單個核細胞中PI3K、p-AKT、NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達量顯著增加（P<0.05），而漢族OSAHS患者的外周血單個核細胞中HIF-2α的蛋白表達量顯著減少（P<0.05）。此外，藏族OSAHS患者的外周血單個核細胞中PI3K、p-AKT、NF-κB p65和HIF-1α的蛋白表達量顯著高于漢族OSAHS患者（P<0.05），而HIF-2α的蛋白表達量顯著低于漢族OSAHS患者（P<0.05）。
圖3
四組受試者外周血單個核細胞蛋白水平比較
a. PI3K；b. p-AKT/t-AKT；c. NF-κB p65；d. HIF-1α；e. HIF-2α。與T-HP組比較，*
2.7 藏、漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-1α/2α的蛋白表達與血液流變學的相關性
藏、漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-1α的蛋白表達與全血黏度高剪切率、血漿黏度比、紅細胞聚集指數和血紅蛋白含量呈正相關（P<0.05），而與紅細胞計數呈負相關（P<0.05）。但是，藏、漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-1α的蛋白表達與全血黏度低剪切率和紅細胞比容無顯著相關性（P>0.05）。結果見表5。藏、漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-2α的蛋白表達與上述這7種指標均無顯著相關性（P>0.05）。結果見表6。
表5
OSAHS組中HIF-1α蛋白表達與血液流變學的相關性
表6
OSAHS組中HIF-2α蛋白表達與血液流變學的相關性
3 討論
我們的研究結果表明，藏族重度OSAHS患者的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血漿黏度比、紅細胞聚集指數、紅細胞比容均顯著高于藏族健康人，且漢族重度OSAHS患者的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血漿黏度比、紅細胞聚集指數、紅細胞比容均顯著高于漢族健康人。此外，研究結果證明OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-1α的mRNA和蛋白水平上調，HIF-2α的mRNA和蛋白水平下調。
OSAHS易并發各種心腦血管和代謝疾病。病理生理學上，該病的特征是反復完全或部分上氣道塌陷，導致氣流中斷和睡眠中持續吸氣。盡管呼吸壓力增加，但上氣道塌陷會導致阻塞性低通氣或呼吸暫停，通過即時和長期機制影響睡眠結構和全身。OSAHS患者血漿黏度和纖維蛋白原的升高以及早晨血小板聚集的普遍增加可能是導致心血管事件發生率增加的原因[11]。血管系統中的血流模式和血流動力不均勻，高切應力可上調抗動脈粥樣硬化的基因，而低切應力不均勻和不規則的血液分布誘導了促進內皮異常和動脈粥樣硬化的基因[11]。本研究中，我們發現OSAHS患者全血中的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血漿黏度比均增加。血液黏度增高會引起血流阻力增加，使血流速度減慢，最后導致血流停滯，直接影響臟器血液供應，導致疾病。全血黏度增加，可引起巨球蛋白血癥、先天性高纖維蛋白血癥等血漿蛋白異常疾病，也可造成血細胞聚集性增加、膜的流動性和穩定性下降引起血液在流動時阻力增加。血液的流動性與血液的粘滯性有關，影響血液黏度的因素眾多，紅細胞比容是影響血液黏度最主要的因素，紅細胞比容越高血液黏度越大[12]。紅細胞聚集性增高，多見于紅細胞膜的性質結構異常性疾病如高血壓、冠心病、糖尿病等，可導致低剪切率下血液黏度增高。OSAHS引發血液流變學指標改變的機制可能主要有兩點：由于夜間反復低通氣或者呼吸暫停導致缺氧，促紅細胞生成素生成增多，引起血液中紅細胞增多，全血黏度增加；夜間缺氧刺激交感神經興奮升高，排汗、排尿以及呼吸頻率增多，引起血液黏度增加[13]。
HIF蛋白家族由α和β亞單位組成，通過形成異二聚體發揮作用。HIF-1α和HIF-2α兩種主要亞型介導了所有細胞對缺氧的反應[14-15]。先前研究報道間歇性缺氧后HIF-1α表達增加[16]，HIF靶基因表達增加，包括糖酵解、缺氧途徑和細胞外基質重塑[17]。這些基因的表達作為一個“缺氧”信號，與更壞的預后相關。本研究結果表明藏族OSAHS患者HIF-1α的mRNA和蛋白表達量顯著高于藏族健康人和漢族OSAHS患者，漢族OSAHS患者HIF-1α的mRNA和蛋白表達量顯著低于漢族健康人；同時，藏族OSAHS患者的HIF-2α的mRNA和蛋白表達量顯著低于藏族健康人和漢族OSAHS患者，漢族OSAHS患者的HIF-2α的mRNA和蛋白表達量顯著低于藏族OSAHS患者。這與先前報道結果相一致[3]。在慢性間歇低氧的大鼠動物模型中，HIF-1α的蛋白水平和轉錄活性顯著增加，HIF-2α的表達下降[18]。而HIF-1α受主要炎癥反應性轉錄因子NF-κB的調節[19-20]，在缺乏NF-κB的情況下，HIF-1α基因不能有效轉錄，因此即使長時間暴露于缺氧環境中，也看不到穩定或活性。研究發現OSAHS患者通過激活NF-κB炎癥信號通路發揮作用[18]。缺氧大鼠腦內HIF-1α、NF-κB的mRNA表達明顯上調，并可出現明顯的腦病，表現為胞漿嗜酸性、空泡形成和腦充血的致密神經元[18]。NF-κB通過HIF-1α的轉錄調控將先天免疫與缺氧反應聯系起來。在缺血過程中，營養物質和氧氣向受損組織的流動減少，HIF-1α激活誘導恢復血液供應、營養和能量生產的基因，從而維持組織的完整性和穩態[21]。研究表明，間歇性缺氧增加頸動脈球中HIF-1α蛋白表達量，并降低HIF-2α蛋白表達量[22-23]。間歇性缺氧降低HIF-2α的表達是由于依賴性鈣蛋白酶增加蛋白質降解[22, 24]，而鈣蛋白酶對HIF-2α的降解涉及HIF-2α蛋白的C端部分[24]。
綜上所述，本研究發現OSAHS患者的外周血單個核細胞中NF-κB p65依賴的炎癥通路被激活，上調HIF-1α的基因和蛋白表達量，同時下調HIF-2α的基因和蛋白表達量，且藏族OSAHS患者的血液流變學指標的含量均大于漢族OSAHS患者。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是一種常見的慢性病，臨床表現為夜間打鼾、白天嗜睡、認知功能衰退等[1]。男性OSAHS患病率為2%～4%，女性患病率為1%～2%。研究發現世代居住在高原的藏族在氧的攝取、運輸與利用方面明顯優于漢族[2]，在呼吸暫停低通氣指數（apnea-hypopnea index，AHI）相近的情況下，藏族中重度OSAHS患者睡眠時平均血氧飽和度和睡眠期最低血氧飽和度明顯低于漢族[3]。OSAHS易導致心血管疾病以及代謝性疾病，是缺血性腦卒中[4]、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[5]、肺動脈栓塞[6]等血栓性疾病的獨立危險因素。間歇性缺氧是OSAHS的標志性表現，低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/低氧誘導因子2α（hypoxia-inducible factor-2α，HIF-2α）是調節間歇性缺氧的關鍵基因，也是目前臨床上較為認可的OSAHS的診斷標志物[7-8]，其上游的PI3K/AKT/NF-κB p65是參與多種慢性炎癥疾病病理的重要通路，其中包括OSAHS[9]。本研究擬探討藏族和漢族OSAHS患者血液流變學以及血液代謝中HIF-1α/2α表達水平的差異性。
1 資料與方法
1.1 一般資料
1.1.1 臨床資料
納入2017年1月—2019年12月在青海大學附屬醫院經多導睡眠圖（polysomnography，PSG）確診的藏族OSAHS患者（簡稱T-OSAHS組）、漢族OSAHS患者（簡稱H-OSAHS組），以及接受體檢的藏族健康人（簡稱T-HP組）、漢族健康人（簡稱H-HP組），每組30例。AHI是每小時睡眠中呼吸暫停和低通氣的總和，已被廣泛用作OSAHS的診斷和評估標準[10]。本研究中健康人的AHI<5次/h，重度OSAHS患者的AHI>20次/h。OSAHS診斷標準參照我國2009年制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診斷和外科治療指南》及美國睡眠醫學會2009年制定的《成人阻塞性睡眠呼吸暫停評價、管理與長期治療臨床指南》。藏族受試者納入標準：（1）長期生活于海拔2260 m至少3年的藏族人；（2）家人3代以內與其他民族均未通婚。排除標準：（1）有其他睡眠障礙［國際睡眠障礙分類（ICSD-II）診斷］或接受過與睡眠有關的呼吸障礙治療的病史；（2）合并有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、肺血栓栓塞癥、深靜脈血栓形成、缺血性腦卒中、近期有感染、手術或創傷的患者；（3）懷孕或者哺乳期的女性。該研究得到了青海大學附屬醫院醫學倫理委員會和生物安全管理委員會的審查和批準（AF-RHEC-0062-01號）。所有參與者均簽署知情同意書并積極配合該項研究。
1.1.2 試劑
TRIzol、逆轉錄試劑盒、實時逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）試劑均購自大連Takara公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；人外周血單核細胞分離液試劑盒購自上海研謹生物科技公司；一抗兔抗磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K；ab32089，英國Abcam公司）；一抗兔抗絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT；ab38449，英國Abcam公司）；一抗兔抗核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65抗體（ab32536，英國Abcam公司）；一抗兔抗HIF-1α抗體（ab51608，英國Abcam公司）；一抗兔抗HIF-2α抗體（ab109616，英國Abcam公司）；二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718，英國Abcam公司）；RIPA裂解液、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體和鼠源IgG抗體購自康為世紀生物科技有限公司。
1.1.3 主要儀器設備
全自動血液分析儀（日本Sysmex XE 21000，Hysenmek）；全自動清洗旋轉式錐板式全血黏度儀（北京宏潤達科技發展有限公司）；超凈臺（山東博科生物產業有限公司）；實時熒光定量PCR儀和凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；多導睡眠檢測儀（美國飛利浦Alex 6）。
1.2 方法
1.2.1 基線觀察指標
對參與者的性別、年齡、體重指數（body mass index，BMI）進行采集和比較，對OSAHS患者的睡眠進行監測。睡眠監測采用便攜式多導睡眠圖檢測儀，主要檢測夜間連續的呼吸、動脈血氧飽和度、腦電圖、心電圖、心率等指標。PSG記錄睡眠狀態人體的多種電生理活動，如眼球運動波、腦電波、肌肉活動電波、呼吸動作等，綜合分析以上活動，對睡眠質量和異常情況進行評估。監測前患者應避免劇烈運動，保持情緒穩定，監測當日白天盡量少睡，以保證夜間睡眠質量。
1.2.2 血樣的采集與處理
所有受試者在入院次日或體檢當日早晨7點，抽取肘前靜脈血15 mL，其中10 mL置于肝素抗凝試管中，另外5 mL加入乙二胺四乙酸抗凝管中用于分離細胞。5 mL的血漿送至青海大學附屬醫院檢驗科用全自動血液分析儀進行血常規檢測，測定受試者靜脈血中紅細胞計數、血紅蛋白的含量及紅細胞比容。另外5 mL血漿采用全自動清洗旋轉式錐板式全血黏度儀檢測血樣的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血漿黏度比和紅細胞聚集指數。
1.2.3 受試者外周血單個核細胞的分離
將乙二胺四乙酸抗凝管中的血液，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，–80 ℃保存備用。
1.2.4 RNA提取及RT-qPCR檢測受試者外周血單個核細胞中PI3K、AKT、NF-κB p65、HIF-1α和HIF-2α mRNA水平
使用TRIzol試劑提取外周血單個核細胞總RNA，操作過程嚴格按照制造商的說明書進行。測定總RNA濃度，通過反轉錄合成cDNA，將其作為模板進行RT-qPCR。反轉錄條件為：95 ℃預變性1 min；94 ℃變性1 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，總共35個循環。以GAPDH作為內參，采用2–△△Ct法對結果進行計算。引物序列見表1。
表1
引物序列
1.2.5 蛋白免疫印跡檢測外周血單個核細胞中PI3K、AKT、NF-κB p65、HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平
采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達水平。使用RIPA裂解液提取外周血單個核細胞的總蛋白，通過BCA試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，將其轉移到PVDF膜上，隨后用5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，分別用相應的抗PI3K（稀釋比1∶400）、抗AKT（稀釋比1∶300）、抗NF-κB p65（稀釋比1∶400）、抗HIF-1α（稀釋比1∶300）、抗HIF-2α（稀釋比1∶300）抗體4 ℃孵育過夜，用含吐溫20的Tris鹽緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）漂洗之后，與HRP標記的IgG抗體（稀釋比1∶1000）室溫孵育1 h。TBST漂洗，ECL顯影液顯影。基于每種蛋白質與GAPDH的灰度比，使用Image J軟件進行蛋白質定量分析。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件。符合正態分布的計量數據均用均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，三組及三組以上比較采用ANOVA方差分析，隨后采用Tukey-Kramer校正進行多重比較。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人的基本資料比較
由表2可見本調查中藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人性別和年齡的基本情況：H-OSAHS組的BMI與H-HP組相比差異無統計學意義（P>0.05），H-OSAHS組的BMI與T-OSAHS組相比差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
四組受試者基本情況［例/（）］
2.2 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人的血液指標比較
藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人血液中的紅細胞數目差異均不顯著（P>0.05）。與藏族健康人相比，藏族OSAHS患者血液中的血紅蛋白含量顯著增加（P<0.05）；與漢族健康人相比，漢族OSAHS患者血液中的血紅蛋白含量顯著增加（P<0.05）；與藏族OSAHS患者相比，漢族OSAHS患者血液中的血紅蛋白含量無顯著改變（P>0.05）。結果見表3。
表3
各組血液指標比較（）
2.3 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人血液流變學指標的比較
與藏族健康人相比，藏族OSAHS患者的全血黏度高剪切率（圖1a）、全血黏度低剪切率（圖1b）、血漿黏度比（圖1c）、紅細胞聚集指數（圖1d）和紅細胞比容（圖1e）均顯著增加（均 P<0.05），且漢族OSAHS患者的上述血液流變學指標均顯著高于漢族健康人（均 P<0.05）。但是，與藏族OSAHS患者相比，漢族OSAHS患者的上述5種血液流變學指標均顯著降低（均 P<0.05）。
圖1
四組受試者的血液流變學指標比較
a. 全血黏度高剪切率；b. 全血黏度低剪切率；c. 血漿黏度比；d. 紅細胞聚集指數；e. 紅細胞比容。與T-HP組比較，*
2.4 藏、漢族OSAHS患者血紅蛋白與血流變指標的相關性關系
藏族OSAHS患者和漢族OSAHS患者血紅蛋白與全血黏度高剪切率和紅細胞聚集指數均呈正相關性（P<0.05），而與全血黏度剪切率、血漿黏度比和紅細胞比容均無顯著相關性（P>0.05）。結果見表4。
表4
藏族和漢族OSAHS患者血紅蛋白與血液流變學指標的相關性
2.5 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人外周血單個核細胞中基因mRNA水平的比較
藏族OSAHS患者外周血單個核細胞中PI3K（圖2a）、AKT（圖2b）、NF-κB p65（圖2c）和HIF-1α（圖2d）水平顯著高于藏族健康人（均 P<0.05），而HIF-2α（圖2e）的mRNA水平顯著低于藏族健康人（P<0.05）。漢族OSAHS患者的外周血單個核細胞中PI3K、AKT、NF-κB p65和HIF-1α基因的mRNA水平顯著高于漢族健康人（均 P<0.05），而HIF-2α的mRNA水平顯著低于漢族健康人（P<0.05）。另外，與藏族OSAHS患者相比，漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中PI3K、AKT、NF-κB p65和HIF-1α基因的mRNA水平顯著降低（均 P<0.05），而HIF-2α的mRNA水平顯著增加（均 P<0.05）。
圖2
四組受試者外周血單個核細胞基因mRNA水平比較
a. PI3K；b. AKT；c. NF-κB p65；d. HIF-1α；e. HIF-2α。與T-HP組比較，*
2.6 藏、漢族OSAHS患者和藏、漢族健康人外周血單個核細胞中基因蛋白水平的比較
藏族OSAHS患者外周血單個核細胞中PI3K（圖3a）、p-AKT（圖3b）、NF-κB p65（圖3c）和HIF-1α（圖3d）的蛋白水平顯著高于藏族健康人（均P<0.05），而藏族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-2α（圖3e）的蛋白水平顯著低于藏族健康人（P<0.05）。與漢族健康人相比，漢族OSAHS患者的外周血單個核細胞中PI3K、p-AKT、NF-κB p65和HIF-1α蛋白表達量顯著增加（P<0.05），而漢族OSAHS患者的外周血單個核細胞中HIF-2α的蛋白表達量顯著減少（P<0.05）。此外，藏族OSAHS患者的外周血單個核細胞中PI3K、p-AKT、NF-κB p65和HIF-1α的蛋白表達量顯著高于漢族OSAHS患者（P<0.05），而HIF-2α的蛋白表達量顯著低于漢族OSAHS患者（P<0.05）。
圖3
四組受試者外周血單個核細胞蛋白水平比較
a. PI3K；b. p-AKT/t-AKT；c. NF-κB p65；d. HIF-1α；e. HIF-2α。與T-HP組比較，*
2.7 藏、漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-1α/2α的蛋白表達與血液流變學的相關性
藏、漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-1α的蛋白表達與全血黏度高剪切率、血漿黏度比、紅細胞聚集指數和血紅蛋白含量呈正相關（P<0.05），而與紅細胞計數呈負相關（P<0.05）。但是，藏、漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-1α的蛋白表達與全血黏度低剪切率和紅細胞比容無顯著相關性（P>0.05）。結果見表5。藏、漢族OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-2α的蛋白表達與上述這7種指標均無顯著相關性（P>0.05）。結果見表6。
表5
OSAHS組中HIF-1α蛋白表達與血液流變學的相關性
表6
OSAHS組中HIF-2α蛋白表達與血液流變學的相關性
3 討論
我們的研究結果表明，藏族重度OSAHS患者的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血漿黏度比、紅細胞聚集指數、紅細胞比容均顯著高于藏族健康人，且漢族重度OSAHS患者的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血漿黏度比、紅細胞聚集指數、紅細胞比容均顯著高于漢族健康人。此外，研究結果證明OSAHS患者外周血單個核細胞中HIF-1α的mRNA和蛋白水平上調，HIF-2α的mRNA和蛋白水平下調。
OSAHS易并發各種心腦血管和代謝疾病。病理生理學上，該病的特征是反復完全或部分上氣道塌陷，導致氣流中斷和睡眠中持續吸氣。盡管呼吸壓力增加，但上氣道塌陷會導致阻塞性低通氣或呼吸暫停，通過即時和長期機制影響睡眠結構和全身。OSAHS患者血漿黏度和纖維蛋白原的升高以及早晨血小板聚集的普遍增加可能是導致心血管事件發生率增加的原因[11]。血管系統中的血流模式和血流動力不均勻，高切應力可上調抗動脈粥樣硬化的基因，而低切應力不均勻和不規則的血液分布誘導了促進內皮異常和動脈粥樣硬化的基因[11]。本研究中，我們發現OSAHS患者全血中的全血黏度高剪切率、全血黏度低剪切率、血漿黏度比均增加。血液黏度增高會引起血流阻力增加，使血流速度減慢，最后導致血流停滯，直接影響臟器血液供應，導致疾病。全血黏度增加，可引起巨球蛋白血癥、先天性高纖維蛋白血癥等血漿蛋白異常疾病，也可造成血細胞聚集性增加、膜的流動性和穩定性下降引起血液在流動時阻力增加。血液的流動性與血液的粘滯性有關，影響血液黏度的因素眾多，紅細胞比容是影響血液黏度最主要的因素，紅細胞比容越高血液黏度越大[12]。紅細胞聚集性增高，多見于紅細胞膜的性質結構異常性疾病如高血壓、冠心病、糖尿病等，可導致低剪切率下血液黏度增高。OSAHS引發血液流變學指標改變的機制可能主要有兩點：由于夜間反復低通氣或者呼吸暫停導致缺氧，促紅細胞生成素生成增多，引起血液中紅細胞增多，全血黏度增加；夜間缺氧刺激交感神經興奮升高，排汗、排尿以及呼吸頻率增多，引起血液黏度增加[13]。
HIF蛋白家族由α和β亞單位組成，通過形成異二聚體發揮作用。HIF-1α和HIF-2α兩種主要亞型介導了所有細胞對缺氧的反應[14-15]。先前研究報道間歇性缺氧后HIF-1α表達增加[16]，HIF靶基因表達增加，包括糖酵解、缺氧途徑和細胞外基質重塑[17]。這些基因的表達作為一個“缺氧”信號，與更壞的預后相關。本研究結果表明藏族OSAHS患者HIF-1α的mRNA和蛋白表達量顯著高于藏族健康人和漢族OSAHS患者，漢族OSAHS患者HIF-1α的mRNA和蛋白表達量顯著低于漢族健康人；同時，藏族OSAHS患者的HIF-2α的mRNA和蛋白表達量顯著低于藏族健康人和漢族OSAHS患者，漢族OSAHS患者的HIF-2α的mRNA和蛋白表達量顯著低于藏族OSAHS患者。這與先前報道結果相一致[3]。在慢性間歇低氧的大鼠動物模型中，HIF-1α的蛋白水平和轉錄活性顯著增加，HIF-2α的表達下降[18]。而HIF-1α受主要炎癥反應性轉錄因子NF-κB的調節[19-20]，在缺乏NF-κB的情況下，HIF-1α基因不能有效轉錄，因此即使長時間暴露于缺氧環境中，也看不到穩定或活性。研究發現OSAHS患者通過激活NF-κB炎癥信號通路發揮作用[18]。缺氧大鼠腦內HIF-1α、NF-κB的mRNA表達明顯上調，并可出現明顯的腦病，表現為胞漿嗜酸性、空泡形成和腦充血的致密神經元[18]。NF-κB通過HIF-1α的轉錄調控將先天免疫與缺氧反應聯系起來。在缺血過程中，營養物質和氧氣向受損組織的流動減少，HIF-1α激活誘導恢復血液供應、營養和能量生產的基因，從而維持組織的完整性和穩態[21]。研究表明，間歇性缺氧增加頸動脈球中HIF-1α蛋白表達量，并降低HIF-2α蛋白表達量[22-23]。間歇性缺氧降低HIF-2α的表達是由于依賴性鈣蛋白酶增加蛋白質降解[22, 24]，而鈣蛋白酶對HIF-2α的降解涉及HIF-2α蛋白的C端部分[24]。
綜上所述，本研究發現OSAHS患者的外周血單個核細胞中NF-κB p65依賴的炎癥通路被激活，上調HIF-1α的基因和蛋白表達量，同時下調HIF-2α的基因和蛋白表達量，且藏族OSAHS患者的血液流變學指標的含量均大于漢族OSAHS患者。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
