引用本文： 黃海濤, 方靜, 曾春暉, 銀錫靖, 洪正善, 譚柳萍, 楊柯. 雙氫楊梅樹皮素對博來霉素誘導小鼠肺纖維化的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(3): 270-275. doi: 10.7507/1671-6205.201903086 復制
肺纖維化是一種進行性肺部疾病，其特點是發病周期長，氣道阻力大，呼吸抑制[1]。其發病機制至今尚未完全清楚，因此治療藥物少，治療手段缺乏，導致死亡率高居不下[1-2]。近年來，構建肺纖維化動物模型的研究較為成熟，其中關鍵的技術、因素、手段以及優缺點等都有研究成果[3]，但是目前構造模型的主要造模途徑是氣管內給藥，雖然使用手術進行可以使造模成功率大幅度上升，但是手術伴隨的感染以及死亡對實驗的進行十分不利。因此，本實驗采用無創氣管內多次給藥法，在提高生存率的同時又能保證造模的成功，十分有利于實驗的推進。藤茶［Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang］，顯齒蛇葡萄的嫩莖葉，為廣西一種資源豐富的野生中草藥，其主要成分為黃酮類化合物，其中以楊梅樹皮素與雙氫楊梅樹皮素（亦稱二氫楊梅樹皮素，Ampelopsin，APS）為主[4-6]。APS 為黃酮類化合物，相對分子質量為 318，具體結構見圖 1[7]。本實驗擬明確藤茶成分中 APS 的抗肺纖維化效果，同時為找尋肺纖維化疾病的治療措施而提供研究基礎。
圖1
APS 的分子結構
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
BALB/c 小鼠，SPF 級，雌雄各半，體重（20±2）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號［SCXK（湘）2016-0002］，廣西中醫藥大學實驗動物中心［資質號（SYXK 桂 2019-0001）］。本實驗經過廣西中醫藥大學動物倫理委員會許可（批準號 DW20170922-31）。
1.1.2 實驗藥品
注射用鹽酸博來霉素（海正輝瑞制藥有限公司，17001311），醋酸地塞米松片（遂成藥業股份有限公司，160517），APS 由廣西中醫藥大學中藥化學教研室提供并鑒定。
1.1.3 實驗試劑
羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所，20180930），4% 多聚甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，20180112），無分析純水乙醇（江蘇海興化工有限公司，GB678-90），蘇木精染液（珠海貝索生物技術有限公司，BA-4097），伊紅染液（珠海貝索生物技術有限公司，BA-4099），甲苯胺藍（上海如吉生物科技發展有限公司，180118），麗春紅（成都市科龍化工試劑廠，20170915）。
1.1.4 實驗儀器
AniRes2005 動物肺功能分析系統，北京貝蘭博科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 小鼠肺纖維化模型構建
取健康 BALB/c 小鼠 60 只，雌雄各半，按體重隨機數表法隨機分為 6 組，每組 10 只，即生理鹽水空白對照組、博來霉素模型組（3 mg/kg）、地塞米松組（2.5 mg/kg）、APS 干預組（200、100、50 mg/kg）。博來霉素模型組、地塞米松組與 APS 干預組小鼠腹腔注射 0.4% 戊巴比妥鈉溶液，給藥容量為 15 mL/kg，麻醉后，氣管內給予 40 μL 鹽酸博來霉素溶液，待其蘇醒后給予水和飼料；14 d 后同法給予同劑量博來霉素溶液，相同條件下繼續飼養 14 d 即模型建立完畢。空白對照組兩次均同法滴入 40 μL 無菌生理鹽水，其余處理相同。
1.2.2 APS 藥物干預
參考文獻[8]的方法設定干預劑量。各組小鼠第 1 次滴注博來霉素 24 h 后，開始給予藥物：地塞米松組小鼠每日灌胃醋酸地塞米松溶液 1 次，APS 干預組小鼠每日灌胃對應劑量的 APS 藥物 1 次，空白對照組小鼠與模型組小鼠均灌胃無菌生理鹽水 1 次。給藥容量均為 20 mL/kg，干預周期為 28 d。
1.2.3 檢測指標
（1）小鼠呼吸功能檢測：各組小鼠給藥后第 28 d 分別腹腔注射 0.4% 戊巴比妥鈉溶液進行麻醉（20 mL/kg），待麻醉后取小鼠仰臥位，進行氣管插管手術，然后連接至 AniRes2005 動物肺功能分析系統，調整呼吸機呼吸頻率為 90 次/min，呼吸比為 2∶1，檢測指標為吸氣阻力（inspiratory resistance，RI）、肺動態順應性（pulmonary dynamic compliance，Cdyn）、每分鐘最大通氣量（maximum voluntary ventilation，MVV）。（2）肺臟器系數測定：各組小鼠于肺功能檢測完成后摘取肺臟，稱取全肺重計算肺系數，肺臟器系數=全肺重/體重×100%。（3）小鼠肺組織羥脯氨酸含量的測定：取小鼠肺臟制作 10% 的組織勻漿液，4 000 r/min 低溫離心 5 min，按照羥脯氨酸試劑盒說明書檢測肺組織中羥脯氨酸的含量。（4）肺組織病理學檢查：行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色檢測肺部炎癥，取各組小鼠肺組織于 4% 多聚甲醛溶液固定后，進行 HE 染色檢查，確定肺泡炎的程度，將其分為 4 級。Ⅰ級為無肺泡炎（0 分）；Ⅱ級為輕度肺泡炎（1 分）：單核細胞浸潤使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的 30%，肺泡結構正常；Ⅲ級為中度肺泡炎（2～3 分）：受累面積占全肺的 30%～70%，近胸膜部較重；Ⅳ級為重度肺泡炎（4 分）：面積大于 70%，偶見肺泡腔內有單核細胞及出血造成的實變。行 Masson 染色檢測肺部纖維化，取各組小鼠肺組織于 4% 多聚甲醛溶液固定后，進行 Masson 三色染色實驗，參考文獻[9]的方法進行肺組織纖維化情況評分。
1.3 統計學方法
呈正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，使用 Graphpad prism 6.0 軟件中均值比較一維方差分析方法進行統計分析；等級資料采用非參數檢驗法統計分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠一般情況
各組動物在造模 24 h 后均沒有死亡，模型組在第 16 d 死亡 1 只；地塞米松組在第 3 周內死亡 2 只，高、中、低劑量干預組在第 3 周以后分別死亡 2、1、3 只。死亡原因均為呼吸功能衰竭，體重減少。
2.2 小鼠肺臟器系數
解剖小鼠后摘取全肺稱重，模型組小鼠肺肺臟器系數明顯高于空白對照組（P<0.01），且肺臟增生嚴重，邊緣質地松脆，出現纖維化樣。地塞米松組與 APS 干預組重量均低于模型組（P<0.05），增生較模型組減輕，質地不如模型組松脆，邊緣纖維化樣少見。地塞米松組與 APS 干預組的肺臟重量沒有明顯變化（P>0.05），增生程度相差小，質地沒有變化，邊緣纖維化程度一致。結果見表 1。
表1
小鼠肺臟器系數情況（
）
2.3 肺功能
模型組 RI 明顯高于空白對照組（P<0.01），APS 高劑量干預組明顯低于模型組（P<0.05），其余各組與模型組比較無明顯變化（P>0.05）。模型組的 Cdyn 與 MVV 均明顯低于空白對照組（P<0.01），APS 高、中劑量干預組的 Cdyn 均高于模型組（P<0.01，P<0.05），APS 高劑量干預組的 MVV 明顯高于模型組（P<0.05）。結果見表 2。
表2
小鼠肺功能、肺組織羥脯氨酸水平和病理評分（
）
2.4 肺組織中羥脯氨胺酸水平
取小鼠肺臟進行羥脯氨酸的檢測，發現模型組的羥脯氨酸明顯高于空白對照組（P<0.01），地塞米松組與 APS 高劑量干預組羥脯氨酸含量均低于模型組（P<0.05）。結果見表 2。
2.5 肺部病理學變化
小鼠肺組織進行 HE 染色分析肺部炎癥情況。空白對照組肺臟各級支氣管分支結構較為正常，肺臟支氣管纖毛上皮細胞排列整齊，未見明顯肺泡炎。模型組肺臟發生中度肺泡炎癥，肺泡Ⅱ型上皮細胞明顯增生，大量巨噬細胞和淋巴細胞等炎性浸潤使肺泡隔發生明顯增寬增厚，個別發生重度肺泡炎癥，有大量巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，幾乎掩蓋所有正常肺泡結構造成肺實變。地塞米松組肺臟發生輕度肺泡炎癥，肺泡結構相對正常，少量巨噬細胞和淋巴細胞浸潤使肺泡隔發生輕微增寬，個別肺泡隔發生明顯增寬增厚。APS 高劑量干預組大部分肺臟發生中度肺泡炎癥，大量巨噬細胞和淋巴細胞等炎性浸潤；中劑量干預組部分肺臟發生中度肺泡炎癥，肺泡隔增厚，肺泡隔和肺泡腔中可見大量巨噬細胞和淋巴細胞等炎性浸潤；低劑量干預組肺臟各級支氣管分支結構較為正常，支氣管纖毛上皮排列整齊，發生輕度肺泡炎癥，個別出現中度肺泡炎癥。病理評分結果見表 2，病理結果見圖 2。
圖2
小鼠肺組織病理像（HE×400）
a. 空白對照組：肺結構完好，未見明顯肺炎；b. 模型組：炎性細胞大量聚集（紅箭），上皮細胞增生嚴重；c. 地塞米松組：肺結構完好，出現輕微炎癥；d. APS 高劑量干預組：上皮細胞出現輕微增生，炎性細胞聚集；e. APS 中劑量干預組：上皮細胞出現增生，有炎性細胞聚集；f. APS 低劑量干預組：有炎性細胞聚集（紅箭），上皮細胞出現增生
小鼠肺組織進行 Masson 三色染色分析肺纖維化情況。空白對照組肺臟各級支氣管分支結構較為正常，未發現肺泡壁或支氣管壁纖維化樣，肺組織結構未見明顯損傷。模型組肺臟發現中度肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁纖維化程度增加，膠原纖維明顯增多，個別肺組織結構嚴重變形，呈現大面積變形。地塞米松組發現輕微肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁輕微增厚，個別膠原纖維增多，未見肺組織結構變形。APS 高劑量干預組部分發生肺纖維化，個別發生中度肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁增厚，肺組織結構輕微變形，未見嚴重受損，個別變形嚴重，膠原纖維增多；APS 中劑量干預組發現輕微肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁未見明顯增厚，個別肺組織膠原纖維明顯增多，肺組織結構出現嚴重變形，呈現局部纖維化；APS 低劑量干預組發現中度肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁明顯增厚，膠原纖維明顯增加，個別發現肺組織結構嚴重變形，出現大面積纖維化。結果見表 2 和圖 3。
圖3
小鼠肺組織病理像（Masson×400）
a. 空白對照組：肺結構完好，未見明顯纖維化；b. 模型組：膠原蛋白大量出現且聚集（紅箭），上皮細胞增生嚴重；c. 地塞米松組：肺結構完好，少量膠原蛋白聚集；d. APS 高劑量干預組：上皮細胞出現輕微增生，少量膠原蛋白聚集；e. APS 中劑量干預組：上皮細胞出現增生，有膠原蛋白聚集；f. APS 低劑量干預組：大量膠原蛋白聚集（紅箭），上皮細胞出現增生
3 討論
肺纖維化進程一般分為三個階段，即初期急性損傷階段、炎癥反應階段以及自我修復階段，這三個階段的影響因素和信號調控通路眾多且復雜[10]。肺纖維化治療目前仍以糖皮質激素抗炎治療為主要手段，但療效并不確切，且長期使用不良反應較大[11]。肺纖維化主要特征是肺泡上皮細胞不可逆損傷，炎癥細胞水平上升，成纖維細胞異常活化且迅速增殖，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）大量沉積聚集，形成成纖維細胞灶[12]。其病理表現為早期呈現急性肺損傷樣，肺泡內液體與血漿蛋白漏出，隨時間推移肺內膠原蛋白異常增加[13]。
隨著肺纖維化疾病的發展，隨著肺炎的消失，表觀指標也會隨之減弱。劉虹等[14]研究發現，肺功能檢測對于評價藥物對肺纖維化疾病的關系十分重要，藥物是否能改善肺功能中的相關指標顯得十分關鍵。因此，本研究從檢測呼吸功能這方面入手，對實驗小鼠進行呼吸功能的檢測，檢測的指標為 RI、Cdyn 和 MVV。目前，國內對肺纖維化動物模型進行肺功能檢測的研究較少，本實驗對今后研究肺纖維化模型提供了一種研究手段。其中，肺通氣量包括分鐘靜息通氣量（minute ventilation，VE）與 MVV，肺纖維化造成的彈性消失與氣道阻塞主要表現為 MVV 的下降[15]。在此基礎上，Cdyn 則是肺彈性水平的表現指標。而氣道阻力（Raw）分為 RI 與呼氣阻力（expiratory resistance，RE），是臨床評價肺通氣功能下降是否來自于氣道的指標[16-17]。RI 是指肺臟在吸入氣體時所受到的阻力，其大小可以反映肺臟換氣能力，纖維化后肺泡壁增厚，主要表現為 RI 升高，而 RE 影響基本不變。
本實驗發現，模型組的 RI 明顯高于空白對照組，證明模型組小鼠肺臟的氣體交換功能是受到阻礙的，而 APS 高劑量干預組較模型組而言 RI 是明顯下降的，也說明 APS 提高了肺換氣能力。Cdyn 是檢測肺臟在氣流未阻斷時的肺順應性，反映了由于單位壓力的改變對肺容積的改變，代表了胸腔壓力改變對肺容積的影響。在肺纖維化疾病中，由于肺泡壁增生會使彈性阻力變大，導致肺 Cdyn 下降[17]。在本實驗中，模型組的肺 Cdyn 比空白對照組明顯下降，而 APS 的高中劑量干預組均能改善 Cdyn，這說明，APS 能抵抗肺纖維化周期中博來霉素對肺泡壁的影響，減輕肺泡壁的增生，降低彈性阻力，恢復肺順應性。MVV 是反映每分鐘進或出肺的氣體總量[18]。肺纖維化后，肺容積會減少，導致氣體交換速度上升，但是換氣總量卻下降，實驗中模型組的 MVV 較空白對照組顯著性下降，而 APS 高劑量干預組能提高 MVV，說明 APS 能通過增大肺臟的 MVV 來對抗肺纖維化周期中換氣總量的下降。綜合以上三個方面，證明模型組存在氣道阻力高、順應性低與肺通氣總量低等特征，符合由于肺泡壁增厚產生的肺纖維化的特征，從呼吸功能方面表明模型制造成功；而使用 200 mg/kg 的 APS 能有效緩解因肺纖維化帶來的呼吸功能的下降的癥狀。
在肺纖維化形成階段中，羥脯氨酸會大量增加，羥脯氨酸在彈性蛋白中存在極少量，其余存在于膠原蛋白中，占比為 13.4%，其他蛋白則均不存在，而膠原蛋白主要分布在皮膚、軟骨、結締組織等地方[19]。謝偉娜等[20]和 Chen 等[21]研究發現，肺纖維化后肺組織中羥脯氨酸的含量大幅上升。在本實驗中，模型組非組織羥脯氨酸的含量明顯高于空白對照組，證明模型組中膠原纖維大量生成，導致纖維化的產生，說明博來霉素誘導小鼠肺纖維化模型是成功的，符合肺纖維化的特征。地塞米松組的羥脯氨酸含量顯著性低于模型組，證明地塞米松能發揮減少肺纖維化進程中膠原纖維形成的作用，猜測是其抗炎作用使得肺上皮細胞損傷減少，導致異常修復的發生率下降，延緩上皮細胞的轉換。不同劑量 APS 干預均能減少膠原纖維的含量，對比模型組均有不同程度的降低，尤其以高劑量干預組效果最為明顯，這進一步證明 APS 具有減少膠原纖維的形成、延緩肺纖維化進程的作用。
評價肺纖維化的重要指標之一就是組織病理學觀察，林藝凱等[22]和馬愛平等[23]使用 HE 與 Masson 染色法分別對肺組織進行染色，發現纖維化后肺結構發生改變，出現不同程度炎癥與組織聚集增生情況。本研究對小鼠肺組織進行 HE 與 Masson 染色，發現模型組肺泡隔明顯增寬，肺組織大量增生，同時伴有炎性細胞的浸潤，個別出現肺實變。APS 干預組病理評分雖然與藥物濃度呈正比關系，但是高劑量干預組并未出現大量增生情況，更多是存在肺泡炎癥，巨噬細胞與淋巴細胞聚集。這提示 APS 延緩肺纖維化的機制是延緩早期炎癥階段對肺臟的損傷，導致肺上皮細胞異常修復的速度減緩，從而減少增生。本實驗中空白對照組的膠原纖維分布較少，結構完整，纖維化程度不高；相比之下，模型組出現膠原纖維堆積的情況，全部都有不同程度的結構異變，證明在博來霉素的誘導下的確發生了肺纖維化，這從病理學的角度證明了模型的成功。在 APS 干預組中發現，除了低劑量干預組的纖維化程度未能緩解之外，其余兩組均有不同程度的緩解肺纖維化，再次證明體內口服 APS 存在抗纖維化作用。
綜上所述，本研究采用無創氣管滴注的方法建立肺纖維化模型，選擇第 1 d 與第 14 d 分別滴注博來霉素 1 次，既避免了氣管插管手術帶來的死亡風險，又減低急性炎癥所導致的肺臟快速衰竭；采用呼吸功能測定的方法更加直觀地檢測肺臟由于病變導致的肺功能下降；同時從組織形態、生化因子與病理分析幾個方面全面驗證博來霉素誘導肺纖維化模型的成功建立。目前肺纖維化的治療手段為前期大劑量使用糖皮質激素治療早期炎癥，研究證明地塞米松確實能治療博來霉素引起的肺泡炎癥，也能減低肺組織中羥脯氨酸的含量。但是于糖皮質激素的長期使用會產生一系列的不良反應，對治療肺纖維化等慢性疾病并不是上策。而 APS 作為藤茶提取物，不良反應少，雖然治療炎癥的效果不如糖皮質激素，但中長期使用未見明顯不良反應，并能減緩肺纖維化的發展進程，可作為治療肺纖維化的潛在治療途徑，值得進一步深入研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺纖維化是一種進行性肺部疾病，其特點是發病周期長，氣道阻力大，呼吸抑制[1]。其發病機制至今尚未完全清楚，因此治療藥物少，治療手段缺乏，導致死亡率高居不下[1-2]。近年來，構建肺纖維化動物模型的研究較為成熟，其中關鍵的技術、因素、手段以及優缺點等都有研究成果[3]，但是目前構造模型的主要造模途徑是氣管內給藥，雖然使用手術進行可以使造模成功率大幅度上升，但是手術伴隨的感染以及死亡對實驗的進行十分不利。因此，本實驗采用無創氣管內多次給藥法，在提高生存率的同時又能保證造模的成功，十分有利于實驗的推進。藤茶［Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang］，顯齒蛇葡萄的嫩莖葉，為廣西一種資源豐富的野生中草藥，其主要成分為黃酮類化合物，其中以楊梅樹皮素與雙氫楊梅樹皮素（亦稱二氫楊梅樹皮素，Ampelopsin，APS）為主[4-6]。APS 為黃酮類化合物，相對分子質量為 318，具體結構見圖 1[7]。本實驗擬明確藤茶成分中 APS 的抗肺纖維化效果，同時為找尋肺纖維化疾病的治療措施而提供研究基礎。
圖1
APS 的分子結構
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
BALB/c 小鼠，SPF 級，雌雄各半，體重（20±2）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號［SCXK（湘）2016-0002］，廣西中醫藥大學實驗動物中心［資質號（SYXK 桂 2019-0001）］。本實驗經過廣西中醫藥大學動物倫理委員會許可（批準號 DW20170922-31）。
1.1.2 實驗藥品
注射用鹽酸博來霉素（海正輝瑞制藥有限公司，17001311），醋酸地塞米松片（遂成藥業股份有限公司，160517），APS 由廣西中醫藥大學中藥化學教研室提供并鑒定。
1.1.3 實驗試劑
羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所，20180930），4% 多聚甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，20180112），無分析純水乙醇（江蘇海興化工有限公司，GB678-90），蘇木精染液（珠海貝索生物技術有限公司，BA-4097），伊紅染液（珠海貝索生物技術有限公司，BA-4099），甲苯胺藍（上海如吉生物科技發展有限公司，180118），麗春紅（成都市科龍化工試劑廠，20170915）。
1.1.4 實驗儀器
AniRes2005 動物肺功能分析系統，北京貝蘭博科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 小鼠肺纖維化模型構建
取健康 BALB/c 小鼠 60 只，雌雄各半，按體重隨機數表法隨機分為 6 組，每組 10 只，即生理鹽水空白對照組、博來霉素模型組（3 mg/kg）、地塞米松組（2.5 mg/kg）、APS 干預組（200、100、50 mg/kg）。博來霉素模型組、地塞米松組與 APS 干預組小鼠腹腔注射 0.4% 戊巴比妥鈉溶液，給藥容量為 15 mL/kg，麻醉后，氣管內給予 40 μL 鹽酸博來霉素溶液，待其蘇醒后給予水和飼料；14 d 后同法給予同劑量博來霉素溶液，相同條件下繼續飼養 14 d 即模型建立完畢。空白對照組兩次均同法滴入 40 μL 無菌生理鹽水，其余處理相同。
1.2.2 APS 藥物干預
參考文獻[8]的方法設定干預劑量。各組小鼠第 1 次滴注博來霉素 24 h 后，開始給予藥物：地塞米松組小鼠每日灌胃醋酸地塞米松溶液 1 次，APS 干預組小鼠每日灌胃對應劑量的 APS 藥物 1 次，空白對照組小鼠與模型組小鼠均灌胃無菌生理鹽水 1 次。給藥容量均為 20 mL/kg，干預周期為 28 d。
1.2.3 檢測指標
（1）小鼠呼吸功能檢測：各組小鼠給藥后第 28 d 分別腹腔注射 0.4% 戊巴比妥鈉溶液進行麻醉（20 mL/kg），待麻醉后取小鼠仰臥位，進行氣管插管手術，然后連接至 AniRes2005 動物肺功能分析系統，調整呼吸機呼吸頻率為 90 次/min，呼吸比為 2∶1，檢測指標為吸氣阻力（inspiratory resistance，RI）、肺動態順應性（pulmonary dynamic compliance，Cdyn）、每分鐘最大通氣量（maximum voluntary ventilation，MVV）。（2）肺臟器系數測定：各組小鼠于肺功能檢測完成后摘取肺臟，稱取全肺重計算肺系數，肺臟器系數=全肺重/體重×100%。（3）小鼠肺組織羥脯氨酸含量的測定：取小鼠肺臟制作 10% 的組織勻漿液，4 000 r/min 低溫離心 5 min，按照羥脯氨酸試劑盒說明書檢測肺組織中羥脯氨酸的含量。（4）肺組織病理學檢查：行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色檢測肺部炎癥，取各組小鼠肺組織于 4% 多聚甲醛溶液固定后，進行 HE 染色檢查，確定肺泡炎的程度，將其分為 4 級。Ⅰ級為無肺泡炎（0 分）；Ⅱ級為輕度肺泡炎（1 分）：單核細胞浸潤使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積小于全肺的 30%，肺泡結構正常；Ⅲ級為中度肺泡炎（2～3 分）：受累面積占全肺的 30%～70%，近胸膜部較重；Ⅳ級為重度肺泡炎（4 分）：面積大于 70%，偶見肺泡腔內有單核細胞及出血造成的實變。行 Masson 染色檢測肺部纖維化，取各組小鼠肺組織于 4% 多聚甲醛溶液固定后，進行 Masson 三色染色實驗，參考文獻[9]的方法進行肺組織纖維化情況評分。
1.3 統計學方法
呈正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，使用 Graphpad prism 6.0 軟件中均值比較一維方差分析方法進行統計分析；等級資料采用非參數檢驗法統計分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠一般情況
各組動物在造模 24 h 后均沒有死亡，模型組在第 16 d 死亡 1 只；地塞米松組在第 3 周內死亡 2 只，高、中、低劑量干預組在第 3 周以后分別死亡 2、1、3 只。死亡原因均為呼吸功能衰竭，體重減少。
2.2 小鼠肺臟器系數
解剖小鼠后摘取全肺稱重，模型組小鼠肺肺臟器系數明顯高于空白對照組（P<0.01），且肺臟增生嚴重，邊緣質地松脆，出現纖維化樣。地塞米松組與 APS 干預組重量均低于模型組（P<0.05），增生較模型組減輕，質地不如模型組松脆，邊緣纖維化樣少見。地塞米松組與 APS 干預組的肺臟重量沒有明顯變化（P>0.05），增生程度相差小，質地沒有變化，邊緣纖維化程度一致。結果見表 1。
表1
小鼠肺臟器系數情況（）
2.3 肺功能
模型組 RI 明顯高于空白對照組（P<0.01），APS 高劑量干預組明顯低于模型組（P<0.05），其余各組與模型組比較無明顯變化（P>0.05）。模型組的 Cdyn 與 MVV 均明顯低于空白對照組（P<0.01），APS 高、中劑量干預組的 Cdyn 均高于模型組（P<0.01，P<0.05），APS 高劑量干預組的 MVV 明顯高于模型組（P<0.05）。結果見表 2。
表2
小鼠肺功能、肺組織羥脯氨酸水平和病理評分（）
2.4 肺組織中羥脯氨胺酸水平
取小鼠肺臟進行羥脯氨酸的檢測，發現模型組的羥脯氨酸明顯高于空白對照組（P<0.01），地塞米松組與 APS 高劑量干預組羥脯氨酸含量均低于模型組（P<0.05）。結果見表 2。
2.5 肺部病理學變化
小鼠肺組織進行 HE 染色分析肺部炎癥情況。空白對照組肺臟各級支氣管分支結構較為正常，肺臟支氣管纖毛上皮細胞排列整齊，未見明顯肺泡炎。模型組肺臟發生中度肺泡炎癥，肺泡Ⅱ型上皮細胞明顯增生，大量巨噬細胞和淋巴細胞等炎性浸潤使肺泡隔發生明顯增寬增厚，個別發生重度肺泡炎癥，有大量巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，幾乎掩蓋所有正常肺泡結構造成肺實變。地塞米松組肺臟發生輕度肺泡炎癥，肺泡結構相對正常，少量巨噬細胞和淋巴細胞浸潤使肺泡隔發生輕微增寬，個別肺泡隔發生明顯增寬增厚。APS 高劑量干預組大部分肺臟發生中度肺泡炎癥，大量巨噬細胞和淋巴細胞等炎性浸潤；中劑量干預組部分肺臟發生中度肺泡炎癥，肺泡隔增厚，肺泡隔和肺泡腔中可見大量巨噬細胞和淋巴細胞等炎性浸潤；低劑量干預組肺臟各級支氣管分支結構較為正常，支氣管纖毛上皮排列整齊，發生輕度肺泡炎癥，個別出現中度肺泡炎癥。病理評分結果見表 2，病理結果見圖 2。
圖2
小鼠肺組織病理像（HE×400）
a. 空白對照組：肺結構完好，未見明顯肺炎；b. 模型組：炎性細胞大量聚集（紅箭），上皮細胞增生嚴重；c. 地塞米松組：肺結構完好，出現輕微炎癥；d. APS 高劑量干預組：上皮細胞出現輕微增生，炎性細胞聚集；e. APS 中劑量干預組：上皮細胞出現增生，有炎性細胞聚集；f. APS 低劑量干預組：有炎性細胞聚集（紅箭），上皮細胞出現增生
小鼠肺組織進行 Masson 三色染色分析肺纖維化情況。空白對照組肺臟各級支氣管分支結構較為正常，未發現肺泡壁或支氣管壁纖維化樣，肺組織結構未見明顯損傷。模型組肺臟發現中度肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁纖維化程度增加，膠原纖維明顯增多，個別肺組織結構嚴重變形，呈現大面積變形。地塞米松組發現輕微肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁輕微增厚，個別膠原纖維增多，未見肺組織結構變形。APS 高劑量干預組部分發生肺纖維化，個別發生中度肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁增厚，肺組織結構輕微變形，未見嚴重受損，個別變形嚴重，膠原纖維增多；APS 中劑量干預組發現輕微肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁未見明顯增厚，個別肺組織膠原纖維明顯增多，肺組織結構出現嚴重變形，呈現局部纖維化；APS 低劑量干預組發現中度肺纖維化，肺泡壁或支氣管壁明顯增厚，膠原纖維明顯增加，個別發現肺組織結構嚴重變形，出現大面積纖維化。結果見表 2 和圖 3。
圖3
小鼠肺組織病理像（Masson×400）
a. 空白對照組：肺結構完好，未見明顯纖維化；b. 模型組：膠原蛋白大量出現且聚集（紅箭），上皮細胞增生嚴重；c. 地塞米松組：肺結構完好，少量膠原蛋白聚集；d. APS 高劑量干預組：上皮細胞出現輕微增生，少量膠原蛋白聚集；e. APS 中劑量干預組：上皮細胞出現增生，有膠原蛋白聚集；f. APS 低劑量干預組：大量膠原蛋白聚集（紅箭），上皮細胞出現增生
3 討論
肺纖維化進程一般分為三個階段，即初期急性損傷階段、炎癥反應階段以及自我修復階段，這三個階段的影響因素和信號調控通路眾多且復雜[10]。肺纖維化治療目前仍以糖皮質激素抗炎治療為主要手段，但療效并不確切，且長期使用不良反應較大[11]。肺纖維化主要特征是肺泡上皮細胞不可逆損傷，炎癥細胞水平上升，成纖維細胞異常活化且迅速增殖，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）大量沉積聚集，形成成纖維細胞灶[12]。其病理表現為早期呈現急性肺損傷樣，肺泡內液體與血漿蛋白漏出，隨時間推移肺內膠原蛋白異常增加[13]。
隨著肺纖維化疾病的發展，隨著肺炎的消失，表觀指標也會隨之減弱。劉虹等[14]研究發現，肺功能檢測對于評價藥物對肺纖維化疾病的關系十分重要，藥物是否能改善肺功能中的相關指標顯得十分關鍵。因此，本研究從檢測呼吸功能這方面入手，對實驗小鼠進行呼吸功能的檢測，檢測的指標為 RI、Cdyn 和 MVV。目前，國內對肺纖維化動物模型進行肺功能檢測的研究較少，本實驗對今后研究肺纖維化模型提供了一種研究手段。其中，肺通氣量包括分鐘靜息通氣量（minute ventilation，VE）與 MVV，肺纖維化造成的彈性消失與氣道阻塞主要表現為 MVV 的下降[15]。在此基礎上，Cdyn 則是肺彈性水平的表現指標。而氣道阻力（Raw）分為 RI 與呼氣阻力（expiratory resistance，RE），是臨床評價肺通氣功能下降是否來自于氣道的指標[16-17]。RI 是指肺臟在吸入氣體時所受到的阻力，其大小可以反映肺臟換氣能力，纖維化后肺泡壁增厚，主要表現為 RI 升高，而 RE 影響基本不變。
本實驗發現，模型組的 RI 明顯高于空白對照組，證明模型組小鼠肺臟的氣體交換功能是受到阻礙的，而 APS 高劑量干預組較模型組而言 RI 是明顯下降的，也說明 APS 提高了肺換氣能力。Cdyn 是檢測肺臟在氣流未阻斷時的肺順應性，反映了由于單位壓力的改變對肺容積的改變，代表了胸腔壓力改變對肺容積的影響。在肺纖維化疾病中，由于肺泡壁增生會使彈性阻力變大，導致肺 Cdyn 下降[17]。在本實驗中，模型組的肺 Cdyn 比空白對照組明顯下降，而 APS 的高中劑量干預組均能改善 Cdyn，這說明，APS 能抵抗肺纖維化周期中博來霉素對肺泡壁的影響，減輕肺泡壁的增生，降低彈性阻力，恢復肺順應性。MVV 是反映每分鐘進或出肺的氣體總量[18]。肺纖維化后，肺容積會減少，導致氣體交換速度上升，但是換氣總量卻下降，實驗中模型組的 MVV 較空白對照組顯著性下降，而 APS 高劑量干預組能提高 MVV，說明 APS 能通過增大肺臟的 MVV 來對抗肺纖維化周期中換氣總量的下降。綜合以上三個方面，證明模型組存在氣道阻力高、順應性低與肺通氣總量低等特征，符合由于肺泡壁增厚產生的肺纖維化的特征，從呼吸功能方面表明模型制造成功；而使用 200 mg/kg 的 APS 能有效緩解因肺纖維化帶來的呼吸功能的下降的癥狀。
在肺纖維化形成階段中，羥脯氨酸會大量增加，羥脯氨酸在彈性蛋白中存在極少量，其余存在于膠原蛋白中，占比為 13.4%，其他蛋白則均不存在，而膠原蛋白主要分布在皮膚、軟骨、結締組織等地方[19]。謝偉娜等[20]和 Chen 等[21]研究發現，肺纖維化后肺組織中羥脯氨酸的含量大幅上升。在本實驗中，模型組非組織羥脯氨酸的含量明顯高于空白對照組，證明模型組中膠原纖維大量生成，導致纖維化的產生，說明博來霉素誘導小鼠肺纖維化模型是成功的，符合肺纖維化的特征。地塞米松組的羥脯氨酸含量顯著性低于模型組，證明地塞米松能發揮減少肺纖維化進程中膠原纖維形成的作用，猜測是其抗炎作用使得肺上皮細胞損傷減少，導致異常修復的發生率下降，延緩上皮細胞的轉換。不同劑量 APS 干預均能減少膠原纖維的含量，對比模型組均有不同程度的降低，尤其以高劑量干預組效果最為明顯，這進一步證明 APS 具有減少膠原纖維的形成、延緩肺纖維化進程的作用。
評價肺纖維化的重要指標之一就是組織病理學觀察，林藝凱等[22]和馬愛平等[23]使用 HE 與 Masson 染色法分別對肺組織進行染色，發現纖維化后肺結構發生改變，出現不同程度炎癥與組織聚集增生情況。本研究對小鼠肺組織進行 HE 與 Masson 染色，發現模型組肺泡隔明顯增寬，肺組織大量增生，同時伴有炎性細胞的浸潤，個別出現肺實變。APS 干預組病理評分雖然與藥物濃度呈正比關系，但是高劑量干預組并未出現大量增生情況，更多是存在肺泡炎癥，巨噬細胞與淋巴細胞聚集。這提示 APS 延緩肺纖維化的機制是延緩早期炎癥階段對肺臟的損傷，導致肺上皮細胞異常修復的速度減緩，從而減少增生。本實驗中空白對照組的膠原纖維分布較少，結構完整，纖維化程度不高；相比之下，模型組出現膠原纖維堆積的情況，全部都有不同程度的結構異變，證明在博來霉素的誘導下的確發生了肺纖維化，這從病理學的角度證明了模型的成功。在 APS 干預組中發現，除了低劑量干預組的纖維化程度未能緩解之外，其余兩組均有不同程度的緩解肺纖維化，再次證明體內口服 APS 存在抗纖維化作用。
綜上所述，本研究采用無創氣管滴注的方法建立肺纖維化模型，選擇第 1 d 與第 14 d 分別滴注博來霉素 1 次，既避免了氣管插管手術帶來的死亡風險，又減低急性炎癥所導致的肺臟快速衰竭；采用呼吸功能測定的方法更加直觀地檢測肺臟由于病變導致的肺功能下降；同時從組織形態、生化因子與病理分析幾個方面全面驗證博來霉素誘導肺纖維化模型的成功建立。目前肺纖維化的治療手段為前期大劑量使用糖皮質激素治療早期炎癥，研究證明地塞米松確實能治療博來霉素引起的肺泡炎癥，也能減低肺組織中羥脯氨酸的含量。但是于糖皮質激素的長期使用會產生一系列的不良反應，對治療肺纖維化等慢性疾病并不是上策。而 APS 作為藤茶提取物，不良反應少，雖然治療炎癥的效果不如糖皮質激素，但中長期使用未見明顯不良反應，并能減緩肺纖維化的發展進程，可作為治療肺纖維化的潛在治療途徑，值得進一步深入研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
