引用本文： 陳乾華, 侯天芳, 竇志芳, 黃漢琮, 史宗明, 王廣發. 大氣細顆粒物引起小鼠肺組織 miR-146 表達上調及肺功能下降. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(6): 586-591. doi: 10.7507/1671-6205.201902010 復制
流行病學研究顯示大氣細顆粒物（PM2.5）與慢性炎癥性疾病的發病和死亡率增加密切相關[1]，最新研究發現長期暴露于大氣污染中引起肺功能快速下降，同時增加慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）的發病率[2]。然而國內對于長期重污染的慢性暴露研究仍缺乏。微小 RNA（MicroRNA, miRNA）是一類普遍存在于真核生物中、高度保守的長度約為 18～25 個核苷酸的小 RNA 分子，是一種可以在轉錄后調控基因表達的重要小分子。同時，更令人感興趣的是 PM2.5 能夠改變機體內 miRNA 的表達。研究發現大氣污染物能夠引起人體 miR-9、miR-10b、miR-21、miR-128、miR-155、miR-222、miR-223 和 miR-338 等 miRNA 的表達改變[3]。筆者既往結合北京 PM2.5 污染現狀，研究采用高劑量的多次 PM2.5 暴露相比于既往的單次暴露方式，更接近目前我國重污染地區自然暴露的特點，通過建立重污染暴露下的小鼠動物模型，研究發現包括 miR-146a、miR-146b 在內的 10 個 microRNAs 表達上調[4]，其中 microRNA-46a 及 microRNA-146b 與大氣污染暴露后的炎癥指標相關性比較顯著。肺通氣功能檢查是評價肺臟功能和診斷慢性氣道性疾病的主要指標，部分肺功能下降過快的人群，氣道功能已發生改變，患者已出現病理生理改變，如慢阻肺患者，由于肺功能指標第 1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second, FEV1）與用力肺活量（forced vital capacity, FVC）的比值（FEV1/FVC）仍可能高于 70%，未達到目前的診斷標準而被漏診[5-6]，有可能延誤病情，如不及時干預，疾病將迅速進展，喪失慢阻肺等肺功能下降疾病的最佳干預時期[7]。基于前期研究基礎，本研究試圖探究 miRNA-146 與大氣污染暴露后的肺功能改變是否相關，以期為大氣污染加重肺功能快速下降等疾病的早期預警提供有效的生物學標志物依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 PM2.5 顆粒的采集、提取和懸液制備
采樣點為北京大學第一醫院內科樓樓頂，應用 Staplex PM2.5 大流量采樣器，流量為 1.13 m3/min，流量精度 3%，玻璃纖維濾膜（20.3 cm×25.4 cm）收集顆粒物，于 2016 年 1 月連續采樣 96 h。將附有 PM2.5 顆粒的玻璃纖維濾膜剪成小塊，放入 250 mL 燒杯；加入無菌超純水，低溫超聲 1 h，每隔 5min 輕輕搖晃燒杯，以混勻懸浮液；將燒杯中的懸浮液倒至已稱重的離心管中；然后用超純水清洗留在燒杯中的膜 2～3 次，收集懸浮液至同一個離心管中；使用 6 層紗布過濾懸液，低溫冷凍干燥離心管，稱重，計算收獲顆粒物質量，回收顆粒于–20 ℃ 冰箱保存。根據實驗小鼠的體重稱取 PM2.5 顆粒物，于動物實驗前一天用生理鹽水配置不同濃度的細顆粒物混懸液，超聲振蕩混勻，4 ℃ 冰箱保存備用，使用前再次超聲振蕩混勻。
1.1.2 主要試劑和儀器
microRNA 提取、逆轉錄試劑盒以及實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）反應試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）ELISA 檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和 γ 干擾素（interferon-γ, IFN-γ）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測試劑盒購自美國 BD 公司；Ani Res2005 小鼠肺功能儀；ABI7500 熒光定量 PCR 儀；引物由上海生工設計合成，其中 mmu-miR-146a 5'-TgAgAACTgAATTCCATgggTT-3'，mmu-miR-146b 5'-TgAgAACTgAATTCCATAggCT-3'，內參基因為 U6（U6 正向引物：5'-CTCgCTTCggCAgCACA-3'；U6 反向引物：5'-AACgCTTCACgAATTTgCgT-3'）。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組和處理
實驗動物為北京維通利華實驗動物技術有限公司（使用許可證編號 SYXK（京）2014-0010）提供的 30 只 SPF 級 8 周齡雄性 BALB/c 小鼠，體重為（25±2）g，在北京大學第一醫院動物實驗中心飼養于清潔級屏障環境中，通過了實驗動物福利倫理審查（動物倫理編號：J201609）。小鼠自由進食消毒顆粒飼料及水。實驗環境無噪音，室溫 23～25 ℃，12 h 光亮/12 h 黑暗（8:00 至 20:00 開燈；20:00 至 8:00 熄燈）交替，濕度 25%～30%。小鼠適應性飼養 1 周后開始實驗。將小鼠隨機分成五組，每組 6 只，分別為空白對照組、生理鹽水組、PM2.5 低劑量組（2.5 mg/kg）、PM2.5 中劑量組（5.0 mg/kg）、PM2.5 高劑量組（10.0 mg/kg），建模方法采用氣管滴注，每次氣管滴注量為 50 μL，用 5% 水合氯醛麻醉處理，1 周滴注 2 次，氣管滴注 60 d。末次氣管滴注后次日采用小鼠肺功能儀檢測肺功能，行肺泡灌洗并收集灌洗液，操作完成后麻醉處死取材，制作肺組織石蠟塊和勻漿。
1.2.2 Ani Res2005 肺功能儀檢測
小鼠用 5% 水合氯醛麻醉處理，待其疼痛反射消失后。固定于小鼠體描箱內操作臺上，切開皮膚分離皮下組織，暴露氣管，連接動物呼吸機，插入氣管插管，呼吸比 15∶10，呼吸頻率 90 次/min。封閉體描箱，記錄波形及數據。
1.2.3 肺組織病理學觀察
采取肺組織，置福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后切片，作蘇木精–伊紅染色。光鏡下觀察肺組織的病理學改變，并進行肺組織光學顯微鏡病理學觀察：每只小鼠隨機選 2 張切片，對每張切片進行肺組織病理光鏡下定性分析。觀察指標包括：氣管及支氣管黏膜上皮的脫落，杯狀細胞的增生，嗜酸性粒細胞的浸潤；上皮基底膜的增厚；管壁及伴行小血管周圍炎細胞的浸潤；肺泡結構的改變，肺泡間隔的寬度，肺泡間隔及肺泡巨噬細胞內顆粒物質的沉積等。
1.2.4 ELISA 檢測
將所有采集的肺泡灌洗液及肺組織制備勻漿樣本同一時間進行 ELISA 檢測，操作步驟按照 ELISA 檢測試劑盒說明書進行。
1.2.5 RT-qPCR 分析
按照北京全式金生物技術有限公司操作說明書進行 microRNA 的提取，逆轉錄和 RT-qPCR 實驗。逆轉錄參數條件設置：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s 滅活。然后進行 miR-146a、miR-146b 和內參基因 U6 的 RT-qPCR 法檢測。設置反應條件: 50 ℃ 2 min 滅活 UNG 酶，94 ℃ 30 s 預變性，94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共 40 個循環。每個標本均采用三個復孔。以 U6snRNA 為內參基因，miR-146a、miR-146b 表達水平以 2–ΔΔCT表示（計算ΔΔCt 時，對照組ΔCt 取其中位數）。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件。所有數據均以均數±標準差（
±s），用 Levene’s 檢驗方差分析，對于方差齊的實驗數據采用單因素方差分析 ANOVA 及 LSD 檢對各指標的組間差別進行比較；方差不齊的數據采用獨立樣本的非參數檢驗和 Kruskal-Wallis H Test 對各指標的組間差別進行比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 冬季采集 PM2.5 細顆粒物成分分析
冬季收集 PM2.5 樣本，收集地位于北京中心城區近主干道。用于小鼠氣管滴注實驗的 PM2.5 細顆粒物的重金屬從 0.0039～3699.49976 ng/m3。主要成分為 Fe（3699.49976 ng/m3）、Al（2639.12008 ng/m3）、Cu（1 789.267 659 ng/m3）。重金屬含量比例如下：Fe（40%）、Al（29%）、Cu（19%）、Pb（3%）、Zn（3%）、Ba（2%）、Mo（2%）。結果見圖 1。
圖1
冬季采集 PM2.5 細顆粒物成分分析
2.2 PM2.5 氣管滴注小鼠后肺功能變化
PM2.5 處理組中小鼠吸氣阻力和呼氣阻力有升高趨勢（P=0.06；P=0.088），都高于空白對照組和生理鹽水組，但是差異沒有統計學意義。高劑量處理組小鼠最大吸氣流速（peak inspiratory flow, PIF）和最大呼氣流速（peak expiratory flow, PEF）比對照組下降，差異有統計學意義（P<0.05）。處理組和對照組動態肺順應性比較，差異沒有統計學意義，最大通氣量有下降趨勢（P=0.08），但差異沒有統計學意義。結果見圖 2。
圖2
各組小鼠肺功能指標比較（n=6）
a. 吸氣阻力和呼氣阻力；b. PIF 和 PEF；c. 動態肺順應性；d. 最大通氣量。*與生理鹽水組比較，
2.3 PM2.5 氣管滴注小鼠后肺組織病理變化
生理鹽水組小鼠細小支氣管和肺泡結構正常，支氣管黏膜上皮完整，支氣管腔和肺泡腔內未見吞噬顆粒物質的巨噬細胞和明顯的炎細胞浸潤（圖 3a）。小鼠在中高劑量 PM2.5 暴露后鏡下可見支氣管腔內可見脫落的黏膜上皮細胞，部分肺間隔增寬，細支氣管和血管周圍見炎性細胞浸潤（圖 3b）。中高劑量暴露 PM2.5 后鏡下可見細小支氣管黏膜上皮增生，支氣管腔內可見脫落的黏膜上皮，部分肺組織內見纖維母細胞增生，肺泡間隔增寬，內見淋巴細胞聚集，可見吞噬 PM2.5 的肺泡巨噬細胞（塵細胞）（圖 3c）。高劑量暴露組鏡下可見大量的淋巴細胞聚集浸潤（圖 3d）。
圖3
各組小鼠肺組織病理檢查像（蘇木精–伊紅×200）
a. 生理鹽水組肺組織結構正常；b. 中劑量暴露 PM2.5 后鏡下可見細支氣管周圍炎性細胞浸潤，部分肺間隔增寬，支氣管腔內可見脫落的黏膜上皮細胞（黑箭）；c. 高劑量暴露 PM2.5 后鏡下可見大量吞噬顆粒的巨噬細胞浸潤（黑箭）；d. 高劑量暴露 PM2.5 后鏡下肺間隔及肺泡腔內見大量淋巴細胞聚集（黑箭）
2.4 PM2.5 氣管滴注小鼠后炎癥因子表達水平變化
PM2.5 暴露組肺泡灌洗液的前炎癥因子 IL-6 表達水平高于明顯高于空白對照組和生理鹽水組，有劑量依賴性趨勢表現；PM2.5 暴露組肺組織勻漿中 TNF-α 和 IFN-γ 表達水平高于對照組；空白對照組和生理鹽水組的肺泡灌洗液和肺組織勻漿中炎癥因子表達水平比較，差異均無統計學意義。結果見圖 4。
圖4
各組小鼠炎癥因子表達水平比較（n=6）
a. 肺泡灌洗液中 IL-6 表達；b. 肺組織勻漿上清液中 TNF-α 表達；c. 肺組織勻漿上清液中 IFN-γ 表達。#與生理鹽水組比較，
2.5 RT-qPCR 檢測 PM2.5 處理組小鼠肺組織 miR-146a 和 miR-146b 表達量
圖 5a 顯示中高劑量組肺組織的 miR-146a 表達水平明顯高于對照組，其中隨著 PM2.5 各劑量組的增加，miR-146a 基因表達水平有上升趨勢；圖 5b 顯示只有 PM2.5 高劑量組的 miR-146b 基因表達水平高于對照組；空白對照組和生理鹽水組的 miR-146a 和 miR-146b 表達比較，差異均無統計學意義。
圖5
各組小鼠肺組織 miR-146a 和 miR-146b 基因表達（n=6）
a. miR-146a 基因表達；b. miR-146b 基因表達。*
2.6 microRNAs 與肺功能的關系
miRNAs（miR-146a 和 miR-146b）與肺功能（PIF 和 PEF）有明顯的負相關關系，miR-146b 更為顯著。結果見表 1。
表1
miRNAs 與肺功能的關系
3 討論
2013 年 IARC 證實 PM2.5 已經被認定為一級致癌物[8]。用于本實驗的 PM2.5 細顆粒物收集于北京中心城區近主干道區域，測定發現其所含重金屬成分主要為 Fe、Al、Cu、Pb、Zn 等，本實驗 PM2.5 重金屬成分明顯高于 2012 年所測重金屬成分[9]。由此可見近年來北京城區內 PM2.5 中主要重金屬成分明顯增多。研究證實富含金屬成分的 PM2.5 可引起 microRNAs 的表達水平變化，引起炎癥和氧化應激[10-11]。由于 PM2.5 化學特性極為復雜，其成分以及含量不同引起的生物毒理特性也不同[12]。PM2.5 暴露后小鼠肺組織的支氣管黏膜上皮出現不同程度的增生，氣道上皮不同程度的脫落，肺泡間隔增寬，以及不同程度的淋巴細胞聚集及吞噬顆粒的巨噬細胞浸潤。環境流行病學研究表明炎癥是大氣污染危害健康的主要機制之一，推測肺臟是炎癥反應的主要發源地，部分炎癥因子可溢出至全身，導致全身炎癥反應及損害[13]。既往研究顯示炎性細胞因子 IL-6 和 TNF-α 具有增強各種炎性介質及使炎性細胞聚集的作用，因此是反映機體早期炎性反應的敏感指標[14]，已有研究亦發現 PM2.5 啟動毒理作用中的一個重要假說就是誘導肺組織中促炎癥因子的釋放[15]，本研究對 PM2.5 誘發小鼠肺部的促炎癥因子進行測定，結果顯示 PM2.5 暴露處理后小鼠肺泡灌洗液中 IL-6 表達水平增高，并呈明顯的劑量依賴性，以高劑量組最為顯著。高劑量暴露 PM2.5 后肺組織勻漿中 TNF-α 及 IFN-γ 亦高于對照組。
Kirenga 等[16]通過對烏干達不同空氣污染水平地點的兒童進行肺功能橫截面比較研究，發現空氣污染嚴重的區域，兒童肺功能明顯低于輕度空氣污染區。進行監測的肺功能包括 FVC 占預計值百分比（101.4% 比 104.0%，P=0.043）、FEV 占預計值百分比（93.9% 比 98.0，P=0.001）和 25%～75% 用力呼氣流速（87.8 比 94.0，P=0.002）。本研究通過不同濃度劑量的 PM2.5 對小鼠進行慢性暴露，結果提示高劑量處理組小鼠 PIF 和 PEF 比對照組下降，差異有統計學意義。PM2.5 處理組中小鼠吸氣阻力和呼氣阻力有升高趨勢，最大通氣量有下降趨勢，但差異均沒有統計學意義。提示慢性 PM2.5 暴露引發小鼠肺功能下降，主要表現為 PIF 和 PEF 下降明顯。PM2.5 通過刺激氣道引起炎癥反應及誘發氣道氧化應激反應，從而引發或加重氣道阻塞，導致肺功能下降[17]。
研究發現 miRNA 不僅參與調節許多重要的生理過程，如發育、細胞分化、凋亡、細胞增殖、胚胎發育等，并且其介導的基因沉默也在多種疾病中起重要的作用[18-19]，一個 miRNA 可以和多個靶基因位點結合，參與多個靶基因的調控；同時同一個靶基因也可同時被多個 miRNA 調控，從而形成一個精確而復雜的調控網絡[20]。miRNA 作為基因調控功能的重要分子，當前在許多疾病中的致病機制已得到很好的闡述[21-22]，近年來，Yamamoto 等[23]發現空氣污染中柴油尾氣能夠引起 miR-21、miR-30e、miR-215 以及 miR-144 表達水平上調。筆者前期的研究通過 PM2.5 暴露后亦發現小鼠肺組織中多種 microRNAs 表達異常，其中包括 miR-146a 和 miR-146b 上調變化較為顯著[4]，本研究亦發現通過慢性暴露后小鼠肺組織亦有 miR-146a 和 miR-146b 上調表達，且與肺功能中 PIF 和 PEF 呈明顯負相關關系，miR-146b 更為顯著。提示 miRNA 參與了大氣污染誘發的呼吸系統疾病，且與肺功能下降相關。但其具體的參與機制還有待進一步研究。明確 miRNA 在肺功能下降這一過程中的具體致病機制，對將來干預及研發相關治療藥物具有重要意義，為建立大氣污染誘發的慢性氣道疾病的早期預警生物學標志物體系提供科學依據，為后續進一步研究 miRNA 在肺功能下降及慢性氣道疾病中的發病機制中的作用提供理論基礎。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
流行病學研究顯示大氣細顆粒物（PM2.5）與慢性炎癥性疾病的發病和死亡率增加密切相關[1]，最新研究發現長期暴露于大氣污染中引起肺功能快速下降，同時增加慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）的發病率[2]。然而國內對于長期重污染的慢性暴露研究仍缺乏。微小 RNA（MicroRNA, miRNA）是一類普遍存在于真核生物中、高度保守的長度約為 18～25 個核苷酸的小 RNA 分子，是一種可以在轉錄后調控基因表達的重要小分子。同時，更令人感興趣的是 PM2.5 能夠改變機體內 miRNA 的表達。研究發現大氣污染物能夠引起人體 miR-9、miR-10b、miR-21、miR-128、miR-155、miR-222、miR-223 和 miR-338 等 miRNA 的表達改變[3]。筆者既往結合北京 PM2.5 污染現狀，研究采用高劑量的多次 PM2.5 暴露相比于既往的單次暴露方式，更接近目前我國重污染地區自然暴露的特點，通過建立重污染暴露下的小鼠動物模型，研究發現包括 miR-146a、miR-146b 在內的 10 個 microRNAs 表達上調[4]，其中 microRNA-46a 及 microRNA-146b 與大氣污染暴露后的炎癥指標相關性比較顯著。肺通氣功能檢查是評價肺臟功能和診斷慢性氣道性疾病的主要指標，部分肺功能下降過快的人群，氣道功能已發生改變，患者已出現病理生理改變，如慢阻肺患者，由于肺功能指標第 1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second, FEV1）與用力肺活量（forced vital capacity, FVC）的比值（FEV1/FVC）仍可能高于 70%，未達到目前的診斷標準而被漏診[5-6]，有可能延誤病情，如不及時干預，疾病將迅速進展，喪失慢阻肺等肺功能下降疾病的最佳干預時期[7]。基于前期研究基礎，本研究試圖探究 miRNA-146 與大氣污染暴露后的肺功能改變是否相關，以期為大氣污染加重肺功能快速下降等疾病的早期預警提供有效的生物學標志物依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 PM2.5 顆粒的采集、提取和懸液制備
采樣點為北京大學第一醫院內科樓樓頂，應用 Staplex PM2.5 大流量采樣器，流量為 1.13 m3/min，流量精度 3%，玻璃纖維濾膜（20.3 cm×25.4 cm）收集顆粒物，于 2016 年 1 月連續采樣 96 h。將附有 PM2.5 顆粒的玻璃纖維濾膜剪成小塊，放入 250 mL 燒杯；加入無菌超純水，低溫超聲 1 h，每隔 5min 輕輕搖晃燒杯，以混勻懸浮液；將燒杯中的懸浮液倒至已稱重的離心管中；然后用超純水清洗留在燒杯中的膜 2～3 次，收集懸浮液至同一個離心管中；使用 6 層紗布過濾懸液，低溫冷凍干燥離心管，稱重，計算收獲顆粒物質量，回收顆粒于–20 ℃ 冰箱保存。根據實驗小鼠的體重稱取 PM2.5 顆粒物，于動物實驗前一天用生理鹽水配置不同濃度的細顆粒物混懸液，超聲振蕩混勻，4 ℃ 冰箱保存備用，使用前再次超聲振蕩混勻。
1.1.2 主要試劑和儀器
microRNA 提取、逆轉錄試劑盒以及實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）反應試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）ELISA 檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和 γ 干擾素（interferon-γ, IFN-γ）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測試劑盒購自美國 BD 公司；Ani Res2005 小鼠肺功能儀；ABI7500 熒光定量 PCR 儀；引物由上海生工設計合成，其中 mmu-miR-146a 5'-TgAgAACTgAATTCCATgggTT-3'，mmu-miR-146b 5'-TgAgAACTgAATTCCATAggCT-3'，內參基因為 U6（U6 正向引物：5'-CTCgCTTCggCAgCACA-3'；U6 反向引物：5'-AACgCTTCACgAATTTgCgT-3'）。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組和處理
實驗動物為北京維通利華實驗動物技術有限公司（使用許可證編號 SYXK（京）2014-0010）提供的 30 只 SPF 級 8 周齡雄性 BALB/c 小鼠，體重為（25±2）g，在北京大學第一醫院動物實驗中心飼養于清潔級屏障環境中，通過了實驗動物福利倫理審查（動物倫理編號：J201609）。小鼠自由進食消毒顆粒飼料及水。實驗環境無噪音，室溫 23～25 ℃，12 h 光亮/12 h 黑暗（8:00 至 20:00 開燈；20:00 至 8:00 熄燈）交替，濕度 25%～30%。小鼠適應性飼養 1 周后開始實驗。將小鼠隨機分成五組，每組 6 只，分別為空白對照組、生理鹽水組、PM2.5 低劑量組（2.5 mg/kg）、PM2.5 中劑量組（5.0 mg/kg）、PM2.5 高劑量組（10.0 mg/kg），建模方法采用氣管滴注，每次氣管滴注量為 50 μL，用 5% 水合氯醛麻醉處理，1 周滴注 2 次，氣管滴注 60 d。末次氣管滴注后次日采用小鼠肺功能儀檢測肺功能，行肺泡灌洗并收集灌洗液，操作完成后麻醉處死取材，制作肺組織石蠟塊和勻漿。
1.2.2 Ani Res2005 肺功能儀檢測
小鼠用 5% 水合氯醛麻醉處理，待其疼痛反射消失后。固定于小鼠體描箱內操作臺上，切開皮膚分離皮下組織，暴露氣管，連接動物呼吸機，插入氣管插管，呼吸比 15∶10，呼吸頻率 90 次/min。封閉體描箱，記錄波形及數據。
1.2.3 肺組織病理學觀察
采取肺組織，置福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后切片，作蘇木精–伊紅染色。光鏡下觀察肺組織的病理學改變，并進行肺組織光學顯微鏡病理學觀察：每只小鼠隨機選 2 張切片，對每張切片進行肺組織病理光鏡下定性分析。觀察指標包括：氣管及支氣管黏膜上皮的脫落，杯狀細胞的增生，嗜酸性粒細胞的浸潤；上皮基底膜的增厚；管壁及伴行小血管周圍炎細胞的浸潤；肺泡結構的改變，肺泡間隔的寬度，肺泡間隔及肺泡巨噬細胞內顆粒物質的沉積等。
1.2.4 ELISA 檢測
將所有采集的肺泡灌洗液及肺組織制備勻漿樣本同一時間進行 ELISA 檢測，操作步驟按照 ELISA 檢測試劑盒說明書進行。
1.2.5 RT-qPCR 分析
按照北京全式金生物技術有限公司操作說明書進行 microRNA 的提取，逆轉錄和 RT-qPCR 實驗。逆轉錄參數條件設置：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s 滅活。然后進行 miR-146a、miR-146b 和內參基因 U6 的 RT-qPCR 法檢測。設置反應條件: 50 ℃ 2 min 滅活 UNG 酶，94 ℃ 30 s 預變性，94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共 40 個循環。每個標本均采用三個復孔。以 U6snRNA 為內參基因，miR-146a、miR-146b 表達水平以 2–ΔΔCT表示（計算ΔΔCt 時，對照組ΔCt 取其中位數）。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件。所有數據均以均數±標準差（±s），用 Levene’s 檢驗方差分析，對于方差齊的實驗數據采用單因素方差分析 ANOVA 及 LSD 檢對各指標的組間差別進行比較；方差不齊的數據采用獨立樣本的非參數檢驗和 Kruskal-Wallis H Test 對各指標的組間差別進行比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 冬季采集 PM2.5 細顆粒物成分分析
冬季收集 PM2.5 樣本，收集地位于北京中心城區近主干道。用于小鼠氣管滴注實驗的 PM2.5 細顆粒物的重金屬從 0.0039～3699.49976 ng/m3。主要成分為 Fe（3699.49976 ng/m3）、Al（2639.12008 ng/m3）、Cu（1 789.267 659 ng/m3）。重金屬含量比例如下：Fe（40%）、Al（29%）、Cu（19%）、Pb（3%）、Zn（3%）、Ba（2%）、Mo（2%）。結果見圖 1。
圖1
冬季采集 PM2.5 細顆粒物成分分析
2.2 PM2.5 氣管滴注小鼠后肺功能變化
PM2.5 處理組中小鼠吸氣阻力和呼氣阻力有升高趨勢（P=0.06；P=0.088），都高于空白對照組和生理鹽水組，但是差異沒有統計學意義。高劑量處理組小鼠最大吸氣流速（peak inspiratory flow, PIF）和最大呼氣流速（peak expiratory flow, PEF）比對照組下降，差異有統計學意義（P<0.05）。處理組和對照組動態肺順應性比較，差異沒有統計學意義，最大通氣量有下降趨勢（P=0.08），但差異沒有統計學意義。結果見圖 2。
圖2
各組小鼠肺功能指標比較（n=6）
a. 吸氣阻力和呼氣阻力；b. PIF 和 PEF；c. 動態肺順應性；d. 最大通氣量。*與生理鹽水組比較，
2.3 PM2.5 氣管滴注小鼠后肺組織病理變化
生理鹽水組小鼠細小支氣管和肺泡結構正常，支氣管黏膜上皮完整，支氣管腔和肺泡腔內未見吞噬顆粒物質的巨噬細胞和明顯的炎細胞浸潤（圖 3a）。小鼠在中高劑量 PM2.5 暴露后鏡下可見支氣管腔內可見脫落的黏膜上皮細胞，部分肺間隔增寬，細支氣管和血管周圍見炎性細胞浸潤（圖 3b）。中高劑量暴露 PM2.5 后鏡下可見細小支氣管黏膜上皮增生，支氣管腔內可見脫落的黏膜上皮，部分肺組織內見纖維母細胞增生，肺泡間隔增寬，內見淋巴細胞聚集，可見吞噬 PM2.5 的肺泡巨噬細胞（塵細胞）（圖 3c）。高劑量暴露組鏡下可見大量的淋巴細胞聚集浸潤（圖 3d）。
圖3
各組小鼠肺組織病理檢查像（蘇木精–伊紅×200）
a. 生理鹽水組肺組織結構正常；b. 中劑量暴露 PM2.5 后鏡下可見細支氣管周圍炎性細胞浸潤，部分肺間隔增寬，支氣管腔內可見脫落的黏膜上皮細胞（黑箭）；c. 高劑量暴露 PM2.5 后鏡下可見大量吞噬顆粒的巨噬細胞浸潤（黑箭）；d. 高劑量暴露 PM2.5 后鏡下肺間隔及肺泡腔內見大量淋巴細胞聚集（黑箭）
2.4 PM2.5 氣管滴注小鼠后炎癥因子表達水平變化
PM2.5 暴露組肺泡灌洗液的前炎癥因子 IL-6 表達水平高于明顯高于空白對照組和生理鹽水組，有劑量依賴性趨勢表現；PM2.5 暴露組肺組織勻漿中 TNF-α 和 IFN-γ 表達水平高于對照組；空白對照組和生理鹽水組的肺泡灌洗液和肺組織勻漿中炎癥因子表達水平比較，差異均無統計學意義。結果見圖 4。
圖4
各組小鼠炎癥因子表達水平比較（n=6）
a. 肺泡灌洗液中 IL-6 表達；b. 肺組織勻漿上清液中 TNF-α 表達；c. 肺組織勻漿上清液中 IFN-γ 表達。#與生理鹽水組比較，
2.5 RT-qPCR 檢測 PM2.5 處理組小鼠肺組織 miR-146a 和 miR-146b 表達量
圖 5a 顯示中高劑量組肺組織的 miR-146a 表達水平明顯高于對照組，其中隨著 PM2.5 各劑量組的增加，miR-146a 基因表達水平有上升趨勢；圖 5b 顯示只有 PM2.5 高劑量組的 miR-146b 基因表達水平高于對照組；空白對照組和生理鹽水組的 miR-146a 和 miR-146b 表達比較，差異均無統計學意義。
圖5
各組小鼠肺組織 miR-146a 和 miR-146b 基因表達（n=6）
a. miR-146a 基因表達；b. miR-146b 基因表達。*
2.6 microRNAs 與肺功能的關系
miRNAs（miR-146a 和 miR-146b）與肺功能（PIF 和 PEF）有明顯的負相關關系，miR-146b 更為顯著。結果見表 1。
表1
miRNAs 與肺功能的關系
3 討論
2013 年 IARC 證實 PM2.5 已經被認定為一級致癌物[8]。用于本實驗的 PM2.5 細顆粒物收集于北京中心城區近主干道區域，測定發現其所含重金屬成分主要為 Fe、Al、Cu、Pb、Zn 等，本實驗 PM2.5 重金屬成分明顯高于 2012 年所測重金屬成分[9]。由此可見近年來北京城區內 PM2.5 中主要重金屬成分明顯增多。研究證實富含金屬成分的 PM2.5 可引起 microRNAs 的表達水平變化，引起炎癥和氧化應激[10-11]。由于 PM2.5 化學特性極為復雜，其成分以及含量不同引起的生物毒理特性也不同[12]。PM2.5 暴露后小鼠肺組織的支氣管黏膜上皮出現不同程度的增生，氣道上皮不同程度的脫落，肺泡間隔增寬，以及不同程度的淋巴細胞聚集及吞噬顆粒的巨噬細胞浸潤。環境流行病學研究表明炎癥是大氣污染危害健康的主要機制之一，推測肺臟是炎癥反應的主要發源地，部分炎癥因子可溢出至全身，導致全身炎癥反應及損害[13]。既往研究顯示炎性細胞因子 IL-6 和 TNF-α 具有增強各種炎性介質及使炎性細胞聚集的作用，因此是反映機體早期炎性反應的敏感指標[14]，已有研究亦發現 PM2.5 啟動毒理作用中的一個重要假說就是誘導肺組織中促炎癥因子的釋放[15]，本研究對 PM2.5 誘發小鼠肺部的促炎癥因子進行測定，結果顯示 PM2.5 暴露處理后小鼠肺泡灌洗液中 IL-6 表達水平增高，并呈明顯的劑量依賴性，以高劑量組最為顯著。高劑量暴露 PM2.5 后肺組織勻漿中 TNF-α 及 IFN-γ 亦高于對照組。
Kirenga 等[16]通過對烏干達不同空氣污染水平地點的兒童進行肺功能橫截面比較研究，發現空氣污染嚴重的區域，兒童肺功能明顯低于輕度空氣污染區。進行監測的肺功能包括 FVC 占預計值百分比（101.4% 比 104.0%，P=0.043）、FEV 占預計值百分比（93.9% 比 98.0，P=0.001）和 25%～75% 用力呼氣流速（87.8 比 94.0，P=0.002）。本研究通過不同濃度劑量的 PM2.5 對小鼠進行慢性暴露，結果提示高劑量處理組小鼠 PIF 和 PEF 比對照組下降，差異有統計學意義。PM2.5 處理組中小鼠吸氣阻力和呼氣阻力有升高趨勢，最大通氣量有下降趨勢，但差異均沒有統計學意義。提示慢性 PM2.5 暴露引發小鼠肺功能下降，主要表現為 PIF 和 PEF 下降明顯。PM2.5 通過刺激氣道引起炎癥反應及誘發氣道氧化應激反應，從而引發或加重氣道阻塞，導致肺功能下降[17]。
研究發現 miRNA 不僅參與調節許多重要的生理過程，如發育、細胞分化、凋亡、細胞增殖、胚胎發育等，并且其介導的基因沉默也在多種疾病中起重要的作用[18-19]，一個 miRNA 可以和多個靶基因位點結合，參與多個靶基因的調控；同時同一個靶基因也可同時被多個 miRNA 調控，從而形成一個精確而復雜的調控網絡[20]。miRNA 作為基因調控功能的重要分子，當前在許多疾病中的致病機制已得到很好的闡述[21-22]，近年來，Yamamoto 等[23]發現空氣污染中柴油尾氣能夠引起 miR-21、miR-30e、miR-215 以及 miR-144 表達水平上調。筆者前期的研究通過 PM2.5 暴露后亦發現小鼠肺組織中多種 microRNAs 表達異常，其中包括 miR-146a 和 miR-146b 上調變化較為顯著[4]，本研究亦發現通過慢性暴露后小鼠肺組織亦有 miR-146a 和 miR-146b 上調表達，且與肺功能中 PIF 和 PEF 呈明顯負相關關系，miR-146b 更為顯著。提示 miRNA 參與了大氣污染誘發的呼吸系統疾病，且與肺功能下降相關。但其具體的參與機制還有待進一步研究。明確 miRNA 在肺功能下降這一過程中的具體致病機制，對將來干預及研發相關治療藥物具有重要意義，為建立大氣污染誘發的慢性氣道疾病的早期預警生物學標志物體系提供科學依據，為后續進一步研究 miRNA 在肺功能下降及慢性氣道疾病中的發病機制中的作用提供理論基礎。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
