引用本文： 饒亞飛, 張輝, 包愛華, 王靜. 白細胞介素-26 對脂多糖所致晚期肺組織損傷的保護作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(3): 259-264. doi: 10.7507/1671-6205.201901040 復制
白細胞介素-26（interleukin 26，IL-26）是一種 IL-10 家族的細胞因子，同時也與 Th17 家族有關[1]。既往研究顯示 LPS 可以誘導 IL-26 表達于人類的支氣管肺泡上皮細胞[2]。國外研究利用重組人白細胞介素-26（recombinant human IL-26，rhIL-26）蛋白證實 IL-26 可以結合其位于中性粒細胞表面的受體，進一步誘導下游的信號通路分子信號轉導和轉錄激活因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）磷酸化，進而促進中性粒細胞的趨化[2]。我們前期研究表明，在 LPS 誘導小鼠急性肺部炎癥模型中，rhIL-26 蛋白具有時序性調控中性粒細胞在肺實質和氣道內募集的作用[3]。同時，我們發現在接受氣道內 rhIL-26 滴入的小鼠受到脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激 72 h 后，其肺組織內的炎癥損傷較正常小鼠刺激后的改變顯著減輕[3]。引起這一現象的原因目前尚不清楚，本研究對此進行了進一步的探討。
1 材料與方法
1.1 材料
無特定病原體級雌性 BALB/c 小鼠 32 只，體重 20 g 左右，8～10 周齡，購自上海史萊克實驗動物中心[scxk（滬 2017-0005）]，飼養于河南省醫藥科學研究院的無特定病原體級環境中。細胞離心機（Shandon Cytospin）購自美國 Thermo Fisher 公司。rhIL-26 蛋白購自美國 R&D 公司，LPS、May-Grunwald- Giemsa 染液購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，RNA 固定液、RNA-cDNA 試劑盒、Fast SYBR Green? Master Mix 購自加拿大 Life Technologies 公司，引物購自上海生工生物工程有限公司。本實驗得到鄭州大學醫學倫理委員會許可。
1.2 方法
1.2.1 動物分組及氣道內滴入
將 32 只 BALB/c 小鼠采用隨機數字表法分為 4 組，每組 8 只，分別為空白對照組、IL-26 對照組、LPS 模型組和 IL-26 干預組。各組小鼠異氟烷吸入麻醉后，對照組間隔 10 min 經鼻續貫滴入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS；40 μl）和 PBS（40 μl），IL-26 對照組間隔 10 min 經鼻續貫滴入 rhIL-26（50 μg/kg，溶于 40 μl PBS 中）和 PBS（40 μl），LPS 模型組間隔 10 min 經鼻滴入 PBS（40 μl）和 LPS（Escherichia coli 0127：B8，10 mg/kg，溶于 40 μl PBS 中），IL-26 干預組間隔 10 min 經鼻續貫滴入 rhIL-26 和 LPS[3]。
1.2.2 肺泡灌洗、細胞計數、細胞因子檢測及外周血細胞計數
經鼻序貫滴入藥物 72 h 后，麻醉小鼠，氣管切開，插入導管固定。用 0.8 ml 冰 PBS 灌洗 3 次，共回收約 1.8 ml 液體，離心后吸取上清液，分裝并 –80 ℃ 保存[4]，酶聯免疫吸附試驗檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中趨化因子（C-X-C 基序）配體 1[chemokine（C-X-C motif） ligand 1，KC][5]、粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）[6]、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）[7]、巨噬細胞炎癥蛋白-2（macrophage inflammatory proteins-2，MIP-2）[8]以及巨噬細胞炎癥蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）[9]的濃度。沉淀物用 0.5 ml 冷 PBS 重懸，進行細胞計數及分類。獲取 BALF 后迅速剪開胸腔，抽取心尖血，進行外周血涂片，用劉 A、B 液染色后每張載玻片上計數 300 個白細胞，進行細胞分類及計數。
1.2.3 肺組織病理染色
經鼻序貫滴入藥物 72 h 后，過量麻醉處死小鼠。取小鼠左肺放入 4% 中性甲醛溶液中固定，經脫水、包埋、切片后進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。根據美國胸科協會描述的方案，對 HE 染色切片進行炎癥評分[10]。由兩名獨立且合格的研究人員以盲法采用光學顯微鏡（200×）對 HE 染色切片拍照，按照以下四個部位進行炎癥評分：肺間質、肺泡腔、支氣管周圍區域和血管周圍區域。肺間質和肺泡腔的評分標準：0 分，未發現炎癥細胞；1 分，5 個及以下炎癥細胞；2 分，5 個以上炎癥細胞。支氣管周圍區域和血管周圍區域的評分標準：0 分，支氣管或血管周圍沒有炎癥；1 分，支氣管或血管周圍偶有少量炎癥細胞；2 分，支氣管或血管周圍被炎癥細胞包繞，但細胞層較薄，不超過 5 個細胞；3 分，支氣管或血管周圍被厚層細胞（>5 個）包繞。
1.2.4 實時熒光定量 PCR 檢測
Trizol 法提取肺組織總 RNA，測定其濃度，全自動 cDNA 合成（反轉錄儀 PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美國 MJ Research 公司）后進行 PCR 反應（qPCR 儀 AB7500，美國 Applied Biosystems 公司）。反應條件設置如下：95 ℃ 反應 15 min，循環 1 次；95 ℃ 15 s，50～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 循環 40 次。引物序列見表 1。使用 β 肌動蛋白（β-actin）mRNA 作為內參，采用比較 Ct 的相對定量方法，即將來自對照組的某一樣本的 Ct 值定為參照值，其他待測樣本的 Ct 值與之比較后的倍數關系為觀測值，進一步進行組間或組內比較。
表1
各檢測指標的引物序列
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件。數據用均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠血中炎癥細胞的改變
與空白對照組比較，LPS 模型組小鼠血中中性粒細胞明顯增高（P<0.05），IL-26 干預組白細胞、中性粒細胞明顯增高（均 P<0.05）；與 LPS 模型組比較，IL-26 干預組單核細胞明顯增高（P<0.05）。結果見表 2。
表2
各組小鼠血炎癥細胞比較（×105/ml，
）
2.2 rhIL-26 及 LPS 對小鼠肺部炎癥的影響
（1）BALF 炎癥細胞：與空白對照組比較，LPS 模型組總細胞數、淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞明顯增高（均 P<0.05），IL-26 干預組總細胞數、中性粒細胞、巨噬細胞顯著增高（均 P<0.05）；與 IL-26 對照組比較，IL-26 干預組總細胞、中性粒細胞、巨噬細胞明顯增加（均 P<0.05）；與 LPS 模型組比較，IL-26 干預組總細胞數、淋巴細胞明顯增多（均 P<0.05）。結果見表 3。
表3
各組小鼠 BALF 中炎癥細胞和炎癥因子比較（
）
（2）BALF 中炎癥因子：與空白對照組比較，LPS 模型組 KC、G-CSF、TNF-α、MIP-2、MIP-1α 明顯增高（均 P<0.05），IL-26 干預組 KC、G-CSF、MIP-2、MIP-1α 顯著增加（均 P<0.05）；IL-26 干預組 KC、G-CSF、MIP-2、MIP-1α 明顯高于 IL-26 對照組（均 P<0.05）；與 LPS 模型組比較，IL-26 干預組 MIP-1α 明顯增高（均 P<0.05）。結果見表 3。
2.3 肺組織 HE 染色及炎癥評分
與空白對照組比較，LPS 模型組和 IL-26 干預組總炎癥、間質、肺泡腔、血管周圍、支氣管周圍炎癥均較高（均 P<0.05）；IL-26 干預組總炎癥、間質、肺泡、血管周圍、支氣管周圍明顯高于 IL-26 對照組（均 P<0.05）；IL-26 干預組總炎癥、間質、支氣管周圍明顯低于 LPS 組（均 P<0.05）。結果見圖 1、表 4。
圖1
各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a. 空白對照組；b. IL-26 對照組；c. LPS 模型組；d. IL-26 干預組。圖上右下角黑色線條代表 50 μm。IL-26 對照組肺組織各部位炎癥細胞浸潤情況與空白對照組無明顯差異；LPS 模型組肺組織各部位炎癥細胞浸潤明顯，尤以支氣管周圍、肺間質部位為著；IL-26 干預組較 LPS 模型組肺部組織炎癥細胞浸潤明顯減輕，特別是支氣管周圍以及肺間質區域
表4
各組小鼠肺組織炎癥積分比較（分，
）
2.4 rhIL-26 及 LPS 對小鼠肺部炎癥相關通路分子 mRNA 表達的影響
與空白對照組比較，IL-26 對照組 TNF-α，ATF3 表達均明顯升高（均 P<0.05），LPS 組 TLR2、TNF-α 表達顯著增高（均 P<0.05），IL-26 干預組 TLR2、IP-10、TNF-α、NF-KB 表達明顯增加（均 P<0.05）；與 IL-26 對照組比較，IL-26 干預組 TLR4、TLR2、IP-10、TNF-α、NF-κB 表達顯著增加（均 P<0.05）；與 LPS 組比較，IL-26 干預組 TLR4、TLR2、IP-10、NF-κB 表達均明顯增高（均 P<0.05）。各組之間 GATA3、T-bet、RORγ 未見明顯差異。結果見表 5。
表5
各組小鼠肺組織炎癥相關通路分子 mRNA 比較（
）
3 討論
到目前為止，肺部細菌感染仍然是全世界發病率和死亡率的重要原因之一[11]。這些肺部細菌感染導致的疾病負擔已經成為全球醫療保健的主要問題[12]。因此，我們迫切需要尋找一種新的針對肺部先天免疫應答的有效治療策略[13]。作為 Th17 家族的一份子，IL-26 已經被證明是一個多能的細胞因子，不僅參與 Th2 免疫反應，而且在固有免疫反應中也發揮重要的作用[14]。其他領域研究表明 IL-26 在慢性炎癥性疾病，如類風濕性關節炎和克羅恩病中起到重要作用，rhIL-26 能夠刺激中性粒細胞的釋放。在肺部感染方面，rhIL-26 能夠刺激中性粒細胞上的受體，動員肺部聚集的免疫細胞[2]。我們在前期研究觀察了 IL-26 對 LPS 誘導的不同時相（6 h，24 h，72 h）肺部和氣道炎癥的影響，結果發現，經鼻滴入 rhIL-26 能夠顯著抑制 LPS 誘導的晚期（72 h）的肺部和氣道炎癥[3]。但是這一機制并不清楚，在本研究中我們進行了進一步的探索。
本研究利用動物模型，通過隨機對照分組，檢測各組小鼠 BALF 炎癥細胞（總細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞）的變化及炎癥因子（KC、G-CSF、TNF-α、MIP-2、MIP-1α）的分泌，同時進行肺組織炎癥評分，并檢測炎癥相關通路分子（TLR4、TLR2、GATA3、IP-10、T-bet、TNF-α、RORγ、ATF3、NF-κB）mRNA 的表達。本研究再次證實外源性 rhIL-26 可以顯著緩解 LPS 誘導的小鼠晚期肺部炎癥。從病理切片上可以發現，IL-26 干預組小鼠的肺組織病理評分顯著，尤其表現在血管周圍、支氣管周圍以及肺間質浸潤的炎癥細胞顯著減少，但是肺泡腔的炎癥細胞浸潤卻無明顯差異，這一結果與我們此前的研究報道相符合[3]。
與顯著抑制肺部炎癥反應不同，外源性 rhIL-26 卻不能降低 LPS 小鼠模型的氣道炎癥水平。主要表現為 IL-26 干預組小鼠 BALF 中的細胞計數與 LPS 模型組相比并無顯著降低，相反其總炎癥細胞、中性粒細胞和巨噬細胞均增高。這也提示，IL-26 抑制 LPS 所致晚期肺部炎癥的效應應該與抑制氣道炎癥效應無關。同時，血液相關檢驗結果表明，rhIL-26 并沒有改變小鼠血液細胞的數量和分布。因此，我們認為 IL-26 抑制 LPS 所致晚期肺部炎癥的效應應該與血液炎癥細胞的募集無關。我們推測，rhIL-26 減輕肺部炎癥的原因可能與其促進炎癥細胞從血管周圍、支氣管周圍及肺間質的區域進入肺泡腔有關。我們的研究結果也間接證實了這一點。
我們發現 IL-26 干預組小鼠 BALF 中 MIP-1α 的濃度顯著升高。MIP-1α 屬于趨化細胞因子家族，是巨噬細胞在受到內毒素刺激后產生的主要細胞因子，可以激活并誘導粒細胞，特別是中性粒細胞到急性損傷部位，在感染和炎癥的免疫反應中起到重要作用[15]。雖然 MIP-1α 可以促使激活后的粒細胞合成和分泌一些炎癥因子，例如 TNF-α[16]、IL-6 等，但是我們的研究發現 BALF 中 TNF-α 的濃度并未顯著升高。我們推測這一現象可能與這些氣道內的中性粒細胞大多是從肺組織中遷移而來，已屬于激活后期的細胞，合成和分泌炎癥因子的能力可能會降低有關。同時，我們對一些可以影響到氣道 TNF-α 水平的轉錄因子進行了檢測。我們的結果還發現，rhIL-26 能夠升高正常小鼠肺組織 ATF3 的表達，但是并不能增加 Th1 炎癥反應特異性轉錄因子 T-bet[17]，Th2 炎癥反應特異性轉錄因子 GATA3[18]，和 Th17 炎癥反應特異性轉錄因子 RORγ[19]的表達。ATF3 是一種 ATF/CREB 家族轉錄因子，受到體內外一些刺激特別是一些 TLR4[20]激動劑 LPS 的刺激后可被誘導表達，并反過來抑制該通路激活后產生的一系列前炎癥因子例如 IL-6、TNF-α 等的基因轉錄，因而具有抑炎效應。在 ATF3 基因敲除小鼠氣管內滴入 LPS 后 BALF 中前炎癥因子（IL-6、TNF-α）的水平明顯較野生型小鼠為高，肺組織炎癥滲出也更為嚴重[21]。綜合以上研究研究，rhIL-26 很可能通過促進 ATF3 的表達進而減輕 LPS 誘導的肺部炎癥反應和損傷。ATF3 對于 TNF-α 表達的抑制也可以解釋 rhIL-26 干預組小鼠 BALF 中的炎癥細胞雖然較 LPS 模型組小鼠增多，但是 TNF-α 的水平卻并未明顯升高這一現象。
LPS 的主要受體是 TLR4 和 TLR2[20]，IL-26 是否可能通過對這兩種受體的表達進行調控進而影響 LPS 誘導的肺部炎癥，目前尚不清楚，本研究對此進行了探討。通過檢測兩種受體在肺組織的 mRNA 表達水平發現，rhIL-26 可以顯著升高這兩種受體的 mRNA 在 LPS 模型小鼠肺組織的表達。同時這兩條通路的下游關鍵分子 NF-κB 的表達也是增高的，但是 NF-κB 的下游分子 TNF-α 在肺組織的 mRNA 的表達卻并未顯著升高[15]。這可能與其促進氣道內 MIP-1α 的表達、增強趨化后，炎癥細胞從肺組織的遷出有關；也可能與其增加 TLR4 和 TLR2 的表達，降低 LPS 誘導的炎癥時程有關；同時，也與 rhIL-26 誘導 ATF3 的表達增多，抑炎效應增強有關。
本研究尚存在一定的不足之處，例如未進一步檢測相關關鍵分子的蛋白表達，同時也未在體內行功能抑制試驗進一步驗證 IL-26 的生物學功能。總之，本研究發現 rhIL-26 可以減輕 LPS 誘導小鼠肺損傷模型的晚期肺部炎癥，可能與 IL-26 提高氣道 MIP-1α 濃度及誘導肺組織 ATF3 表達有關。
白細胞介素-26（interleukin 26，IL-26）是一種 IL-10 家族的細胞因子，同時也與 Th17 家族有關[1]。既往研究顯示 LPS 可以誘導 IL-26 表達于人類的支氣管肺泡上皮細胞[2]。國外研究利用重組人白細胞介素-26（recombinant human IL-26，rhIL-26）蛋白證實 IL-26 可以結合其位于中性粒細胞表面的受體，進一步誘導下游的信號通路分子信號轉導和轉錄激活因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）磷酸化，進而促進中性粒細胞的趨化[2]。我們前期研究表明，在 LPS 誘導小鼠急性肺部炎癥模型中，rhIL-26 蛋白具有時序性調控中性粒細胞在肺實質和氣道內募集的作用[3]。同時，我們發現在接受氣道內 rhIL-26 滴入的小鼠受到脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激 72 h 后，其肺組織內的炎癥損傷較正常小鼠刺激后的改變顯著減輕[3]。引起這一現象的原因目前尚不清楚，本研究對此進行了進一步的探討。
1 材料與方法
1.1 材料
無特定病原體級雌性 BALB/c 小鼠 32 只，體重 20 g 左右，8～10 周齡，購自上海史萊克實驗動物中心[scxk（滬 2017-0005）]，飼養于河南省醫藥科學研究院的無特定病原體級環境中。細胞離心機（Shandon Cytospin）購自美國 Thermo Fisher 公司。rhIL-26 蛋白購自美國 R&D 公司，LPS、May-Grunwald- Giemsa 染液購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，RNA 固定液、RNA-cDNA 試劑盒、Fast SYBR Green? Master Mix 購自加拿大 Life Technologies 公司，引物購自上海生工生物工程有限公司。本實驗得到鄭州大學醫學倫理委員會許可。
1.2 方法
1.2.1 動物分組及氣道內滴入
將 32 只 BALB/c 小鼠采用隨機數字表法分為 4 組，每組 8 只，分別為空白對照組、IL-26 對照組、LPS 模型組和 IL-26 干預組。各組小鼠異氟烷吸入麻醉后，對照組間隔 10 min 經鼻續貫滴入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS；40 μl）和 PBS（40 μl），IL-26 對照組間隔 10 min 經鼻續貫滴入 rhIL-26（50 μg/kg，溶于 40 μl PBS 中）和 PBS（40 μl），LPS 模型組間隔 10 min 經鼻滴入 PBS（40 μl）和 LPS（Escherichia coli 0127：B8，10 mg/kg，溶于 40 μl PBS 中），IL-26 干預組間隔 10 min 經鼻續貫滴入 rhIL-26 和 LPS[3]。
1.2.2 肺泡灌洗、細胞計數、細胞因子檢測及外周血細胞計數
經鼻序貫滴入藥物 72 h 后，麻醉小鼠，氣管切開，插入導管固定。用 0.8 ml 冰 PBS 灌洗 3 次，共回收約 1.8 ml 液體，離心后吸取上清液，分裝并 –80 ℃ 保存[4]，酶聯免疫吸附試驗檢測支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中趨化因子（C-X-C 基序）配體 1[chemokine（C-X-C motif） ligand 1，KC][5]、粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）[6]、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）[7]、巨噬細胞炎癥蛋白-2（macrophage inflammatory proteins-2，MIP-2）[8]以及巨噬細胞炎癥蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）[9]的濃度。沉淀物用 0.5 ml 冷 PBS 重懸，進行細胞計數及分類。獲取 BALF 后迅速剪開胸腔，抽取心尖血，進行外周血涂片，用劉 A、B 液染色后每張載玻片上計數 300 個白細胞，進行細胞分類及計數。
1.2.3 肺組織病理染色
經鼻序貫滴入藥物 72 h 后，過量麻醉處死小鼠。取小鼠左肺放入 4% 中性甲醛溶液中固定，經脫水、包埋、切片后進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。根據美國胸科協會描述的方案，對 HE 染色切片進行炎癥評分[10]。由兩名獨立且合格的研究人員以盲法采用光學顯微鏡（200×）對 HE 染色切片拍照，按照以下四個部位進行炎癥評分：肺間質、肺泡腔、支氣管周圍區域和血管周圍區域。肺間質和肺泡腔的評分標準：0 分，未發現炎癥細胞；1 分，5 個及以下炎癥細胞；2 分，5 個以上炎癥細胞。支氣管周圍區域和血管周圍區域的評分標準：0 分，支氣管或血管周圍沒有炎癥；1 分，支氣管或血管周圍偶有少量炎癥細胞；2 分，支氣管或血管周圍被炎癥細胞包繞，但細胞層較薄，不超過 5 個細胞；3 分，支氣管或血管周圍被厚層細胞（>5 個）包繞。
1.2.4 實時熒光定量 PCR 檢測
Trizol 法提取肺組織總 RNA，測定其濃度，全自動 cDNA 合成（反轉錄儀 PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美國 MJ Research 公司）后進行 PCR 反應（qPCR 儀 AB7500，美國 Applied Biosystems 公司）。反應條件設置如下：95 ℃ 反應 15 min，循環 1 次；95 ℃ 15 s，50～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 循環 40 次。引物序列見表 1。使用 β 肌動蛋白（β-actin）mRNA 作為內參，采用比較 Ct 的相對定量方法，即將來自對照組的某一樣本的 Ct 值定為參照值，其他待測樣本的 Ct 值與之比較后的倍數關系為觀測值，進一步進行組間或組內比較。
表1
各檢測指標的引物序列
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件。數據用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠血中炎癥細胞的改變
與空白對照組比較，LPS 模型組小鼠血中中性粒細胞明顯增高（P<0.05），IL-26 干預組白細胞、中性粒細胞明顯增高（均 P<0.05）；與 LPS 模型組比較，IL-26 干預組單核細胞明顯增高（P<0.05）。結果見表 2。
表2
各組小鼠血炎癥細胞比較（×105/ml，）
2.2 rhIL-26 及 LPS 對小鼠肺部炎癥的影響
（1）BALF 炎癥細胞：與空白對照組比較，LPS 模型組總細胞數、淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞明顯增高（均 P<0.05），IL-26 干預組總細胞數、中性粒細胞、巨噬細胞顯著增高（均 P<0.05）；與 IL-26 對照組比較，IL-26 干預組總細胞、中性粒細胞、巨噬細胞明顯增加（均 P<0.05）；與 LPS 模型組比較，IL-26 干預組總細胞數、淋巴細胞明顯增多（均 P<0.05）。結果見表 3。
表3
各組小鼠 BALF 中炎癥細胞和炎癥因子比較（）
（2）BALF 中炎癥因子：與空白對照組比較，LPS 模型組 KC、G-CSF、TNF-α、MIP-2、MIP-1α 明顯增高（均 P<0.05），IL-26 干預組 KC、G-CSF、MIP-2、MIP-1α 顯著增加（均 P<0.05）；IL-26 干預組 KC、G-CSF、MIP-2、MIP-1α 明顯高于 IL-26 對照組（均 P<0.05）；與 LPS 模型組比較，IL-26 干預組 MIP-1α 明顯增高（均 P<0.05）。結果見表 3。
2.3 肺組織 HE 染色及炎癥評分
與空白對照組比較，LPS 模型組和 IL-26 干預組總炎癥、間質、肺泡腔、血管周圍、支氣管周圍炎癥均較高（均 P<0.05）；IL-26 干預組總炎癥、間質、肺泡、血管周圍、支氣管周圍明顯高于 IL-26 對照組（均 P<0.05）；IL-26 干預組總炎癥、間質、支氣管周圍明顯低于 LPS 組（均 P<0.05）。結果見圖 1、表 4。
圖1
各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a. 空白對照組；b. IL-26 對照組；c. LPS 模型組；d. IL-26 干預組。圖上右下角黑色線條代表 50 μm。IL-26 對照組肺組織各部位炎癥細胞浸潤情況與空白對照組無明顯差異；LPS 模型組肺組織各部位炎癥細胞浸潤明顯，尤以支氣管周圍、肺間質部位為著；IL-26 干預組較 LPS 模型組肺部組織炎癥細胞浸潤明顯減輕，特別是支氣管周圍以及肺間質區域
表4
各組小鼠肺組織炎癥積分比較（分，）
2.4 rhIL-26 及 LPS 對小鼠肺部炎癥相關通路分子 mRNA 表達的影響
與空白對照組比較，IL-26 對照組 TNF-α，ATF3 表達均明顯升高（均 P<0.05），LPS 組 TLR2、TNF-α 表達顯著增高（均 P<0.05），IL-26 干預組 TLR2、IP-10、TNF-α、NF-KB 表達明顯增加（均 P<0.05）；與 IL-26 對照組比較，IL-26 干預組 TLR4、TLR2、IP-10、TNF-α、NF-κB 表達顯著增加（均 P<0.05）；與 LPS 組比較，IL-26 干預組 TLR4、TLR2、IP-10、NF-κB 表達均明顯增高（均 P<0.05）。各組之間 GATA3、T-bet、RORγ 未見明顯差異。結果見表 5。
表5
各組小鼠肺組織炎癥相關通路分子 mRNA 比較（）
3 討論
到目前為止，肺部細菌感染仍然是全世界發病率和死亡率的重要原因之一[11]。這些肺部細菌感染導致的疾病負擔已經成為全球醫療保健的主要問題[12]。因此，我們迫切需要尋找一種新的針對肺部先天免疫應答的有效治療策略[13]。作為 Th17 家族的一份子，IL-26 已經被證明是一個多能的細胞因子，不僅參與 Th2 免疫反應，而且在固有免疫反應中也發揮重要的作用[14]。其他領域研究表明 IL-26 在慢性炎癥性疾病，如類風濕性關節炎和克羅恩病中起到重要作用，rhIL-26 能夠刺激中性粒細胞的釋放。在肺部感染方面，rhIL-26 能夠刺激中性粒細胞上的受體，動員肺部聚集的免疫細胞[2]。我們在前期研究觀察了 IL-26 對 LPS 誘導的不同時相（6 h，24 h，72 h）肺部和氣道炎癥的影響，結果發現，經鼻滴入 rhIL-26 能夠顯著抑制 LPS 誘導的晚期（72 h）的肺部和氣道炎癥[3]。但是這一機制并不清楚，在本研究中我們進行了進一步的探索。
本研究利用動物模型，通過隨機對照分組，檢測各組小鼠 BALF 炎癥細胞（總細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞）的變化及炎癥因子（KC、G-CSF、TNF-α、MIP-2、MIP-1α）的分泌，同時進行肺組織炎癥評分，并檢測炎癥相關通路分子（TLR4、TLR2、GATA3、IP-10、T-bet、TNF-α、RORγ、ATF3、NF-κB）mRNA 的表達。本研究再次證實外源性 rhIL-26 可以顯著緩解 LPS 誘導的小鼠晚期肺部炎癥。從病理切片上可以發現，IL-26 干預組小鼠的肺組織病理評分顯著，尤其表現在血管周圍、支氣管周圍以及肺間質浸潤的炎癥細胞顯著減少，但是肺泡腔的炎癥細胞浸潤卻無明顯差異，這一結果與我們此前的研究報道相符合[3]。
與顯著抑制肺部炎癥反應不同，外源性 rhIL-26 卻不能降低 LPS 小鼠模型的氣道炎癥水平。主要表現為 IL-26 干預組小鼠 BALF 中的細胞計數與 LPS 模型組相比并無顯著降低，相反其總炎癥細胞、中性粒細胞和巨噬細胞均增高。這也提示，IL-26 抑制 LPS 所致晚期肺部炎癥的效應應該與抑制氣道炎癥效應無關。同時，血液相關檢驗結果表明，rhIL-26 并沒有改變小鼠血液細胞的數量和分布。因此，我們認為 IL-26 抑制 LPS 所致晚期肺部炎癥的效應應該與血液炎癥細胞的募集無關。我們推測，rhIL-26 減輕肺部炎癥的原因可能與其促進炎癥細胞從血管周圍、支氣管周圍及肺間質的區域進入肺泡腔有關。我們的研究結果也間接證實了這一點。
我們發現 IL-26 干預組小鼠 BALF 中 MIP-1α 的濃度顯著升高。MIP-1α 屬于趨化細胞因子家族，是巨噬細胞在受到內毒素刺激后產生的主要細胞因子，可以激活并誘導粒細胞，特別是中性粒細胞到急性損傷部位，在感染和炎癥的免疫反應中起到重要作用[15]。雖然 MIP-1α 可以促使激活后的粒細胞合成和分泌一些炎癥因子，例如 TNF-α[16]、IL-6 等，但是我們的研究發現 BALF 中 TNF-α 的濃度并未顯著升高。我們推測這一現象可能與這些氣道內的中性粒細胞大多是從肺組織中遷移而來，已屬于激活后期的細胞，合成和分泌炎癥因子的能力可能會降低有關。同時，我們對一些可以影響到氣道 TNF-α 水平的轉錄因子進行了檢測。我們的結果還發現，rhIL-26 能夠升高正常小鼠肺組織 ATF3 的表達，但是并不能增加 Th1 炎癥反應特異性轉錄因子 T-bet[17]，Th2 炎癥反應特異性轉錄因子 GATA3[18]，和 Th17 炎癥反應特異性轉錄因子 RORγ[19]的表達。ATF3 是一種 ATF/CREB 家族轉錄因子，受到體內外一些刺激特別是一些 TLR4[20]激動劑 LPS 的刺激后可被誘導表達，并反過來抑制該通路激活后產生的一系列前炎癥因子例如 IL-6、TNF-α 等的基因轉錄，因而具有抑炎效應。在 ATF3 基因敲除小鼠氣管內滴入 LPS 后 BALF 中前炎癥因子（IL-6、TNF-α）的水平明顯較野生型小鼠為高，肺組織炎癥滲出也更為嚴重[21]。綜合以上研究研究，rhIL-26 很可能通過促進 ATF3 的表達進而減輕 LPS 誘導的肺部炎癥反應和損傷。ATF3 對于 TNF-α 表達的抑制也可以解釋 rhIL-26 干預組小鼠 BALF 中的炎癥細胞雖然較 LPS 模型組小鼠增多，但是 TNF-α 的水平卻并未明顯升高這一現象。
LPS 的主要受體是 TLR4 和 TLR2[20]，IL-26 是否可能通過對這兩種受體的表達進行調控進而影響 LPS 誘導的肺部炎癥，目前尚不清楚，本研究對此進行了探討。通過檢測兩種受體在肺組織的 mRNA 表達水平發現，rhIL-26 可以顯著升高這兩種受體的 mRNA 在 LPS 模型小鼠肺組織的表達。同時這兩條通路的下游關鍵分子 NF-κB 的表達也是增高的，但是 NF-κB 的下游分子 TNF-α 在肺組織的 mRNA 的表達卻并未顯著升高[15]。這可能與其促進氣道內 MIP-1α 的表達、增強趨化后，炎癥細胞從肺組織的遷出有關；也可能與其增加 TLR4 和 TLR2 的表達，降低 LPS 誘導的炎癥時程有關；同時，也與 rhIL-26 誘導 ATF3 的表達增多，抑炎效應增強有關。
本研究尚存在一定的不足之處，例如未進一步檢測相關關鍵分子的蛋白表達，同時也未在體內行功能抑制試驗進一步驗證 IL-26 的生物學功能。總之，本研究發現 rhIL-26 可以減輕 LPS 誘導小鼠肺損傷模型的晚期肺部炎癥，可能與 IL-26 提高氣道 MIP-1α 濃度及誘導肺組織 ATF3 表達有關。
