引用本文： 郭璐, 鐘振東, 劉曉姝, 蔣才玉, 楊雁, 楊陽, 張靜, 蒲紅, 李為民. MUC5B 和 TOLLIP 基因多態性對特發性肺纖維化患者預后評估的臨床研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(6): 543-548. doi: 10.7507/1671-6205.201811081 復制
特發性肺間質纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的慢性進展性肺疾病，死亡率高，治療方案少[1]。一項 IPF 的多中心全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS）報道包括肺防御蛋白（如黏蛋白 5B、MUC5B）、受體調節蛋白（如 Toll 樣相互作用蛋白、TOLLIP）等與 IPF 易感性和生存率相關[2-3]。MUC5B 和 TOLLIP 的基因位點均位于染色體 11p15.5 的附近，兩者位置非常靠近卻具有明顯不同的生物學功能，MUC5B 對保護呼吸道表面上皮起著關鍵作用，其失調機制在 IPF 的發病機制中的作用尚不完全清楚，但可能與這一關聯基因對黏蛋白和（或）產黏蛋白細胞的致病作用相關[4-5]。TOLLIP 基因編碼 Toll 樣相互作用蛋白，是一種抑制性適配器蛋白質，作用下游 Toll 樣受體[6]。MUC5B 和 TOLLIP 這兩個基因多態性一直與 IPF 的易感性和生存率相關，對肺宿主防御至關重要，且與減緩疾病進展有關[7]。然而，基因多態性大約僅占與 IPF 發病相關的遺傳風險的 30%，且具有人種差異，異常調節的分子機制仍有待建立[8]。該基因多態性對中國 IPF 患者人群的相關性和臨床價值研究較少，仍需進一步明確。因此，本試驗旨在探索中國 IPF 患者 MUC5B 和 TOLLIP 的基因多態性變異狀況，識別與 IPF 易感性相關的遺傳變異，并為患者提供靶向治療的理論依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
2012 年 1 月 1 日至 2017 年 12 月 31 日期間在四川省醫學科學院·四川省人民醫院門診、住院部診斷和隨訪的 IPF 患者納入研究，納入研究的患者符合 2011 年 ATS/ERS/JRS/ALAT 提出的指南診斷標準[9]，即患者高分辨率計算機斷層掃描（high resolution computerized tomography，HRCT）上表現為典型的尋常性間質性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）；HRCT 表現不典型者接受外科肺活檢，且 HRCT 表現與肺活檢病理學表現符合 UIP 特定組合。納入研究患者共 126 例，其中男 95 例（75.4%），女 31 例（24.6%），年齡 50～92 歲，平均年齡（74.4±9.8）歲，對納入的 IPF 患者定期進行隨訪，排除患有其他類型間質性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）、肺移植、失去隨訪及伴有惡性腫瘤的 IPF 患者。本研究通過了四川省醫學科學院·四川省人民醫院醫學倫理委員會審查［編號：倫審（研）2017-171］，納入研究患者均自愿參加并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 資料收集
收集患者首診時的各項臨床指標，包括年齡、性別、吸煙史等人口學資料，以及臨床病史、肺功能、HRCT、外周血檢查資料等。非吸煙者是指一生中吸煙<100 支的患者。
1.2.2 隨訪方案
自 2012 年 1 月 1 日起，對納入的 IPF 患者定期進行隨訪，隨訪 5 年。患者死亡或者在我院就診的最后一次隨訪醫療行為，以及患者肺移植手術前的最后一次隨訪設定為隨訪終點。其中，急性加重期患者因病情急性加重就醫，采集臨床癥狀、肺功能、HRCT、外周血標本檢測血清生物標志物等；穩定期患者每隔 3 個月門診隨訪，采集臨床癥狀、肺功能、外周血標本檢測血清生物標志物，每間隔 6 個月做一次 HRCT。記錄末次隨訪具體時間，再次采集臨床癥狀、肺功能、HRCT 掃描、抽取外周血標本檢測血清生物標志物。
1.2.3 HRCT
所有納入研究的患者采用仰臥位，吸氣相末屏氣時行 HRCT，采用 64 多探頭 CT 掃描儀（SOMATOM Definition Flash，Siemens，德國；LightSpeed VCT，GM Medical Systems，美國），技術參數：120 kV，窗寬（window width，WW）1 000～1 200 HU；窗位（window level，WL）–700～–600 HU；厚度 1 mm，間隔 1 cm，高空間頻率（骨）算法重建。連續隨訪在同一品牌的掃描儀上進行。
1.2.4 計算機輔助系統組織量化
計算機輔助系統（采用軟件系統 MeVis PULMO 3D 3.11，MeVIS Research GmbH，Bremen，德國和 CALIPER 計算機分析技術軟件）自動分析 HRCT 掃描中的異常肺結構并加以標記和量化、根據氣道解剖特點進行肺段分析[10]。首先，CALIPER 計算機分析技術軟件自動根據像素不同將肺段分為正常或異常（肺氣腫、網格狀影和蜂窩病變）；其次，軟件自動計算各病變的絕對值和占肺總容積的百分比，并用不同的顏色編碼標識出來，使用三維成像進行演示。總體 ILD 病變容積被定義為磨玻璃影、網格狀影和蜂窩病變異常的體積總量。對比首次與末次的組織量化指標，結合觀察時限分析指標的差值，計算年變化程度。
1.2.5 肺功能測定
患者的首次肺功能測定在 HRCT 檢查前后 1 周內進行，由技術人員負責操作（MS PFT，VIASYS 系列，美國），操作遵循 ATS/ERS 的指南標準[11]。分別記錄肺總量（total lung capacity，TLC）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、一氧化碳彌散功能（carbon monoxide diffusion function，DLCO）。對比首次與末次的測定指標，結合觀察時限分析指標的差值，計算年變化程度。
1.2.6 MUC5B 和 TOLLIP 的單核苷酸多態性提取及檢測
納入研究的 126 例 IPF 患者均在入組時提取血標本做 DNA 檢測。血液經 10 000 r/min 離心，取血清在–80 ℃ 冰箱保存，血液 DNA 提取后采用實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），將 PCR 產物純化后測序，分別測試 MUC5B rs35705950 及 TOLLIP rs5743890、rs5743894 的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）。
PCR 引物設計使用 Primer 引物設計軟件設計篩選各基因特異性引物。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，并以 ULTRAPAGE 純化。rs5743890 引物序列上游：5′-TCGTCCAGTAGGGAGTCTCGTAGGTA-3′，下游：5′-AGAAGTAACATTCCGTCGGGAGCC-3′；rs5743894 引物序列上游：5′-TTCCGTTCCCGTAGTCACGTTCTCCA-3′，下游：5′-TCGTCGGTTCACGTGTGTCCGTAG-3′；rs35705950 引物序列上游：5′-AACCGGCGTGTTCCCTTTCCTTCCT-3′，下游：5′-GACTTGTCCCTCGTCCCTCCCACTA-3′。
PCR 反應體系為 20 μL，在 EP 管中分別加入 SYBR Primix Ex TaqⅡ（2×），10.0 μL；正向引物（0.4 μmol/L），0.8 μL；反向引物（0.4 μmol/L），0.8 μL；cDNA，2.0 μL；ddH2O，6.4 μL。將 EP 管放入離心機進行瞬時離心。PCR 反應程序：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 個循環，4 ℃ 保存。
1.2.7 血清 KL-6 和 CXCL13 的測定
采集外周血標本，經 3 000 r/min 離心，取血清在–80 ℃ 冰箱保存，分別采用化學發光酶免疫檢測法和酶聯免疫吸附法檢測血清涎液化糖鏈抗原-6（Krebs Von den Lungen-6，KL-6）和 B 淋巴細胞趨化因子 CXCL13（C-X-C motif chemokine ligand 13）水平[12-13]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；計數資料以率和構成比表示，采用 Pearson χ2 檢驗，利用 Kaplan-Meier 法對生存函數進行估計，并通過對數秩檢驗進行比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 IPF 患者 MUC5B SNP rs35705950 及 TOLLIP SNP rs5743890、rs5743894 基因亞型的表達
納入研究的 126 例 IPF 患者中，TOLLIP SNP rs5743890 和 rs5743894 均表達為具有兩個主要等位基因 A 的純合子（AA 型），占總人數的 100.0%，未檢測到次要等位基因 G；116 例患者的 MUC5B SNP rs35705950 表達為具有兩個主要等位基因 G 的純合子（GG 型），占總人數的 92.1%，攜帶一個次要等位基因 T 的雜合子（GT 型）類型的患者僅有 10 例，占總人數的 7.9%，而且均為男性，未檢測到攜帶兩個次要等位基因 T 的純合子類型（TT 型）。根據 MUC5B rs35705950 SNP 的不同，納入研究的 IPF 患者分為 G 組（基因表型為 GG）和 T 組（基因表型為 GT）。
2.2 不同 MUC5B rs35705950 SNP 表達的 IPF 患者臨床特征比較
兩組年齡和未吸煙者的分布趨勢無明顯差異（P>0.05）。與 G 組相比，T 組患者肺功能 DLCO 和 TCL 的年下降水平、血清生物標志物 KL-6 和 CXCL13 的基線水平、影像學的網格狀影和蜂窩病變病變年增加程度相對較低（P<0.05）。隨訪期間兩組死亡率比較，G 組明顯高于 T 組（χ2=29.069，P=0.02）。結果見表 1。
表1
不同 rs35705950 SNP 類型的 IPF 患者的臨床特征比較（
）
2.3 不同 MUC5B rs35705950 SNP 表達的 IPF 患者中位生存時間的比較
攜帶 MUC5B SNP rs35705950 次要等位基因（GT 型）雜合子的 IPF 患者的中位生存時間明顯高于基因表型均為 GG 的純合子 IPF 患者（45.3 個月，95% 可信區間 40.172～46.220 比 36.0 個月，95% 可信區間 35.659～43.341，P=0.02）。結果見圖 1。
圖1
不同 MUC5B rs35705950 SNP 的 IPF 患者 Kaplan-Meier 生存曲線比較
3 討論
IPF 是原因不明并以普通型間質性肺炎為特征性病理改變的一種慢性炎癥性間質性肺疾病。近年研究表明，IPF 是一種“二次打擊”疾病，是基因調控與環境壓力相結合的具有遺傳傾向疾病[14]。GWAS 研究采用候選基因及病例對照研究已證實 IPF 與黏蛋白基因 MUC5B 啟動子 rs35705950 及 TOLLIP 啟動子 rs5743890、rs5743894 基因多態性相關，具有遺傳易感傾向；基因變異參與宿主防御、細胞與細胞間的黏附和 DNA 修復，與 IPF 疾病進展風險相關[2]，這為研究 IPF 遺傳易感及發病機制探索了一條新的途徑。
美國華盛頓大學首次采用全基因組測序 1 例 61 歲臨床確診的 IPF 患者，發現在 MUC5B 啟動子區未發現除 rs35705950 以外的其他相鄰的序列，并發現 rs35705950 位于 MUC5B 啟動子區干擾 DNA 酶與轉錄因子結合位點，上調 MUC5B 表達，表明 MUC5B 啟動子區單核苷酸多態性可能是與 IPF 發病相關的重要遺傳因素[15]。此外，Scholand 等[16]研究發現咳嗽的嚴重程度與 MUC5B rs35705950 啟動子 G>T 多態性顯著相關，提示了 IPF 表型遺傳學異質性的可能機制。有研究納入 438 例 IPF 患者，被檢出攜帶 MUC5B 基因多態性的患者共 37%，且未校正 2 年累計死亡率低于未攜帶 MUC5B 多態性的患者[17]。TOLLIP 與 MUC5B 位于同一基因位點，rs5743890、rs5743894 位于非編碼的 TOLLIP 調控區域內，rs5743890 作為保護性的次要等位基因可降低 IPF 患病的易感性，但與 IPF 患者的死亡率增加相關[18]。提示 MUC5B、TOLLIP 多態性在統計學上仍是生存的顯著預測因素，對于患有亞臨床或早期疾病的患者，在肺功能明顯下降前，通過綜合 MUC5B 及其他因素的預測能力來預測預后可能有所幫助。本研究結果提示中國 IPF 患者中，對預后相關的 MUC5B SNP rs35705950 及 TOLLIP SNP rs5743890 和 rs5743894 的基因多態性分布上絕大多數是由主要基因位點組成的純合子類型；在 rs35705950 表達中，有少數 GT 雜合子分布，而以次要基因位點 T 為純合子的 SNP 出現概率最小。而一項多中心臨床研究中報道韓國 IPF 患者中 TOLLIP rs5743890 基因位點具有次要等位基因 G 的頻率為 6%，在歐美白種 IPF 患者中報道分別接近 11% 和 29%[19]，提示黃種 IPF 患者 TOLLIP 和 MUC5B 的 SNP 攜帶次要基因位點的概率明顯低于白種 IPF 患者。本研究中具有基因變異的人群均為男性，與吸煙史及年齡無相關性，提示這種基因變異的分布可能具有性別優勢，但本研究為單中心研究，因此，中國 IPF 患者間的差異尚需要多中心大樣本量的研究進一步證實。
許多肺功能測試的生理變量是用來評估 IPF 疾病嚴重程度和預測 IPF 生存的重要指標，其中與預后確切相關的指標有 FVC、TLC、DLCO[20]。研究表明 6～12 個月 FVC 和 DLCO 的動態變化與 IPF 的預后高度相關，且比大多數基線特征更能預測預后[21]。另有研究表明攜帶 rs35705950 SNP 主要和次要等位基因的 IPF 患者具有不同的纖維化影像模式，攜帶 T 等位基因（T 組）與 CT 影像和組織學 UIP 診斷一致的患者密切相關，GG 純合子亞型具有更顯著的磨玻璃影表現，T 組顯示更為顯著的胸膜下軸線分布的纖維化病變，G 組和 T 組對于蜂窩病變病變表現無差異[22]。提示 MUC5B 啟動子多態性可識別 UIP/IPF 模式而區別其他原因導致的肺纖維化的模式。但既往研究尚未提及 HRCT 病變的動態變化與 MUC5B 啟動子多態性的相關性，我們的研究表明，兩個基因組患者的影像學的網格狀和蜂窩病變病變進展及肺功能變化有差異。這一結論與 Best 等[23]的研究結論一致，提示基因型與預后存在相關性。
KL-6 在 IPF 中一直作為纖維化的非特異性標志物被研究，報道指出 IPF 患者血清 KL-6 水平比健康志愿者明顯升高，作為一種黏液樣糖蛋白表達于Ⅱ型肺泡細胞的細胞外表面和細支氣管上皮細胞，并作為一種趨化因子促進了肺成纖維細胞的遷移、增殖和存活[24]。CXCL13 是引導 B 細胞到炎性病灶的關鍵中介因子，循環 CXCL13 水平在許多自身免疫綜合征中有明顯升高，CXCL13 的 B 細胞配體 C-X-C 趨化因子受體 5 具有介導淋巴細胞趨化性的作用，其出現與 IPF 具有臨床相關性。此外，IPF 自身抗體直接促進纖維化增生，促進炎癥反應或細胞毒性效應并與患者的臨床表現和預后高度相關[25]。最近研究發現 IPF 發病機制中出現異常 B 細胞，提示 CXCL13 可能是一種與 IPF 病因相關，反映纖維化進程的生物標志物[26]。本研究結果顯示 GT 基因型患者血清 KL-6、CXCL13 水平明顯低于 GG 基因型患者，然而在 5 年的隨訪期間其隨著病情波動起伏，變化缺少規律，因此其臨床應用價值尚需進一步研究。
GWAS 研究顯示基因型為 GT 和 TT 的 IPF 患者死亡風險明顯低于基因型為 GG 的患者，MUC5B rs35705950 SNP 與 IPF 的患者死亡率減少有關[2]。Peljto 等[19]認為潛在的創傷修復等因素使 MUC5B 的基因突變，雖然可導致 IPF 發病風險增高但其危害程度較小，因而其攜帶者疾病發病率增高而死亡率相對較低。Jiang 等[27]研究同樣證實了 MUC5B rs35705950 基因多態性增加 IPF 的易感性，但卻發現攜帶次要基因組的 IPF 患者肺功能 FVC 和 DLCO 有明顯下降，其 5 年生存率也有所降低，攜帶不同 MUC5B rs35705950 基因多態性的 IPF 患者預后差異也符合疾病異質性特點。我們的研究表明 GT 基因型較 GG 基因型的 IPF 患者具有更長的中位生存期，死亡人數明顯低于 GG 組。由于臨床過程復雜，機制不清，MUC5B 啟動子的基因多態性可能具有特異的病理學過程，包括具有更高的疾病易感性風險和不同的生存狀態，基因參與程度亦有個體性和復雜性，因而識別基因多態性對 IPF 預后的相關性有助于制定患者精準化治療策略。
綜上所述，中國 IPF 患者存在基因多態性現象；MUC5B rs35705950 和 TOLLIP rs5743890、rs5743894 基因亞型在中國 IPF 患者中突變率較低，可能預示中國 IPF 患者死亡率高且靶向藥物治療效果不佳。然而，本研究系單中心研究，且基因多態性具有人種差異，其與 IPF 發病相關的遺傳風險仍需多中心及擴大病例數進一步證實，異常調節的分子機制仍有待建立，基因多態性對中國 IPF 患者的相關性和臨床價值研究仍需一步明確。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
特發性肺間質纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的慢性進展性肺疾病，死亡率高，治療方案少[1]。一項 IPF 的多中心全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS）報道包括肺防御蛋白（如黏蛋白 5B、MUC5B）、受體調節蛋白（如 Toll 樣相互作用蛋白、TOLLIP）等與 IPF 易感性和生存率相關[2-3]。MUC5B 和 TOLLIP 的基因位點均位于染色體 11p15.5 的附近，兩者位置非常靠近卻具有明顯不同的生物學功能，MUC5B 對保護呼吸道表面上皮起著關鍵作用，其失調機制在 IPF 的發病機制中的作用尚不完全清楚，但可能與這一關聯基因對黏蛋白和（或）產黏蛋白細胞的致病作用相關[4-5]。TOLLIP 基因編碼 Toll 樣相互作用蛋白，是一種抑制性適配器蛋白質，作用下游 Toll 樣受體[6]。MUC5B 和 TOLLIP 這兩個基因多態性一直與 IPF 的易感性和生存率相關，對肺宿主防御至關重要，且與減緩疾病進展有關[7]。然而，基因多態性大約僅占與 IPF 發病相關的遺傳風險的 30%，且具有人種差異，異常調節的分子機制仍有待建立[8]。該基因多態性對中國 IPF 患者人群的相關性和臨床價值研究較少，仍需進一步明確。因此，本試驗旨在探索中國 IPF 患者 MUC5B 和 TOLLIP 的基因多態性變異狀況，識別與 IPF 易感性相關的遺傳變異，并為患者提供靶向治療的理論依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
2012 年 1 月 1 日至 2017 年 12 月 31 日期間在四川省醫學科學院·四川省人民醫院門診、住院部診斷和隨訪的 IPF 患者納入研究，納入研究的患者符合 2011 年 ATS/ERS/JRS/ALAT 提出的指南診斷標準[9]，即患者高分辨率計算機斷層掃描（high resolution computerized tomography，HRCT）上表現為典型的尋常性間質性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）；HRCT 表現不典型者接受外科肺活檢，且 HRCT 表現與肺活檢病理學表現符合 UIP 特定組合。納入研究患者共 126 例，其中男 95 例（75.4%），女 31 例（24.6%），年齡 50～92 歲，平均年齡（74.4±9.8）歲，對納入的 IPF 患者定期進行隨訪，排除患有其他類型間質性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）、肺移植、失去隨訪及伴有惡性腫瘤的 IPF 患者。本研究通過了四川省醫學科學院·四川省人民醫院醫學倫理委員會審查［編號：倫審（研）2017-171］，納入研究患者均自愿參加并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 資料收集
收集患者首診時的各項臨床指標，包括年齡、性別、吸煙史等人口學資料，以及臨床病史、肺功能、HRCT、外周血檢查資料等。非吸煙者是指一生中吸煙<100 支的患者。
1.2.2 隨訪方案
自 2012 年 1 月 1 日起，對納入的 IPF 患者定期進行隨訪，隨訪 5 年。患者死亡或者在我院就診的最后一次隨訪醫療行為，以及患者肺移植手術前的最后一次隨訪設定為隨訪終點。其中，急性加重期患者因病情急性加重就醫，采集臨床癥狀、肺功能、HRCT、外周血標本檢測血清生物標志物等；穩定期患者每隔 3 個月門診隨訪，采集臨床癥狀、肺功能、外周血標本檢測血清生物標志物，每間隔 6 個月做一次 HRCT。記錄末次隨訪具體時間，再次采集臨床癥狀、肺功能、HRCT 掃描、抽取外周血標本檢測血清生物標志物。
1.2.3 HRCT
所有納入研究的患者采用仰臥位，吸氣相末屏氣時行 HRCT，采用 64 多探頭 CT 掃描儀（SOMATOM Definition Flash，Siemens，德國；LightSpeed VCT，GM Medical Systems，美國），技術參數：120 kV，窗寬（window width，WW）1 000～1 200 HU；窗位（window level，WL）–700～–600 HU；厚度 1 mm，間隔 1 cm，高空間頻率（骨）算法重建。連續隨訪在同一品牌的掃描儀上進行。
1.2.4 計算機輔助系統組織量化
計算機輔助系統（采用軟件系統 MeVis PULMO 3D 3.11，MeVIS Research GmbH，Bremen，德國和 CALIPER 計算機分析技術軟件）自動分析 HRCT 掃描中的異常肺結構并加以標記和量化、根據氣道解剖特點進行肺段分析[10]。首先，CALIPER 計算機分析技術軟件自動根據像素不同將肺段分為正常或異常（肺氣腫、網格狀影和蜂窩病變）；其次，軟件自動計算各病變的絕對值和占肺總容積的百分比，并用不同的顏色編碼標識出來，使用三維成像進行演示。總體 ILD 病變容積被定義為磨玻璃影、網格狀影和蜂窩病變異常的體積總量。對比首次與末次的組織量化指標，結合觀察時限分析指標的差值，計算年變化程度。
1.2.5 肺功能測定
患者的首次肺功能測定在 HRCT 檢查前后 1 周內進行，由技術人員負責操作（MS PFT，VIASYS 系列，美國），操作遵循 ATS/ERS 的指南標準[11]。分別記錄肺總量（total lung capacity，TLC）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、一氧化碳彌散功能（carbon monoxide diffusion function，DLCO）。對比首次與末次的測定指標，結合觀察時限分析指標的差值，計算年變化程度。
1.2.6 MUC5B 和 TOLLIP 的單核苷酸多態性提取及檢測
納入研究的 126 例 IPF 患者均在入組時提取血標本做 DNA 檢測。血液經 10 000 r/min 離心，取血清在–80 ℃ 冰箱保存，血液 DNA 提取后采用實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），將 PCR 產物純化后測序，分別測試 MUC5B rs35705950 及 TOLLIP rs5743890、rs5743894 的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）。
PCR 引物設計使用 Primer 引物設計軟件設計篩選各基因特異性引物。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司設計合成，并以 ULTRAPAGE 純化。rs5743890 引物序列上游：5′-TCGTCCAGTAGGGAGTCTCGTAGGTA-3′，下游：5′-AGAAGTAACATTCCGTCGGGAGCC-3′；rs5743894 引物序列上游：5′-TTCCGTTCCCGTAGTCACGTTCTCCA-3′，下游：5′-TCGTCGGTTCACGTGTGTCCGTAG-3′；rs35705950 引物序列上游：5′-AACCGGCGTGTTCCCTTTCCTTCCT-3′，下游：5′-GACTTGTCCCTCGTCCCTCCCACTA-3′。
PCR 反應體系為 20 μL，在 EP 管中分別加入 SYBR Primix Ex TaqⅡ（2×），10.0 μL；正向引物（0.4 μmol/L），0.8 μL；反向引物（0.4 μmol/L），0.8 μL；cDNA，2.0 μL；ddH2O，6.4 μL。將 EP 管放入離心機進行瞬時離心。PCR 反應程序：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 個循環，4 ℃ 保存。
1.2.7 血清 KL-6 和 CXCL13 的測定
采集外周血標本，經 3 000 r/min 離心，取血清在–80 ℃ 冰箱保存，分別采用化學發光酶免疫檢測法和酶聯免疫吸附法檢測血清涎液化糖鏈抗原-6（Krebs Von den Lungen-6，KL-6）和 B 淋巴細胞趨化因子 CXCL13（C-X-C motif chemokine ligand 13）水平[12-13]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；計數資料以率和構成比表示，采用 Pearson χ2 檢驗，利用 Kaplan-Meier 法對生存函數進行估計，并通過對數秩檢驗進行比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 IPF 患者 MUC5B SNP rs35705950 及 TOLLIP SNP rs5743890、rs5743894 基因亞型的表達
納入研究的 126 例 IPF 患者中，TOLLIP SNP rs5743890 和 rs5743894 均表達為具有兩個主要等位基因 A 的純合子（AA 型），占總人數的 100.0%，未檢測到次要等位基因 G；116 例患者的 MUC5B SNP rs35705950 表達為具有兩個主要等位基因 G 的純合子（GG 型），占總人數的 92.1%，攜帶一個次要等位基因 T 的雜合子（GT 型）類型的患者僅有 10 例，占總人數的 7.9%，而且均為男性，未檢測到攜帶兩個次要等位基因 T 的純合子類型（TT 型）。根據 MUC5B rs35705950 SNP 的不同，納入研究的 IPF 患者分為 G 組（基因表型為 GG）和 T 組（基因表型為 GT）。
2.2 不同 MUC5B rs35705950 SNP 表達的 IPF 患者臨床特征比較
兩組年齡和未吸煙者的分布趨勢無明顯差異（P>0.05）。與 G 組相比，T 組患者肺功能 DLCO 和 TCL 的年下降水平、血清生物標志物 KL-6 和 CXCL13 的基線水平、影像學的網格狀影和蜂窩病變病變年增加程度相對較低（P<0.05）。隨訪期間兩組死亡率比較，G 組明顯高于 T 組（χ2=29.069，P=0.02）。結果見表 1。
表1
不同 rs35705950 SNP 類型的 IPF 患者的臨床特征比較（）
2.3 不同 MUC5B rs35705950 SNP 表達的 IPF 患者中位生存時間的比較
攜帶 MUC5B SNP rs35705950 次要等位基因（GT 型）雜合子的 IPF 患者的中位生存時間明顯高于基因表型均為 GG 的純合子 IPF 患者（45.3 個月，95% 可信區間 40.172～46.220 比 36.0 個月，95% 可信區間 35.659～43.341，P=0.02）。結果見圖 1。
圖1
不同 MUC5B rs35705950 SNP 的 IPF 患者 Kaplan-Meier 生存曲線比較
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IPF 是原因不明并以普通型間質性肺炎為特征性病理改變的一種慢性炎癥性間質性肺疾病。近年研究表明，IPF 是一種“二次打擊”疾病，是基因調控與環境壓力相結合的具有遺傳傾向疾病[14]。GWAS 研究采用候選基因及病例對照研究已證實 IPF 與黏蛋白基因 MUC5B 啟動子 rs35705950 及 TOLLIP 啟動子 rs5743890、rs5743894 基因多態性相關，具有遺傳易感傾向；基因變異參與宿主防御、細胞與細胞間的黏附和 DNA 修復，與 IPF 疾病進展風險相關[2]，這為研究 IPF 遺傳易感及發病機制探索了一條新的途徑。
美國華盛頓大學首次采用全基因組測序 1 例 61 歲臨床確診的 IPF 患者，發現在 MUC5B 啟動子區未發現除 rs35705950 以外的其他相鄰的序列，并發現 rs35705950 位于 MUC5B 啟動子區干擾 DNA 酶與轉錄因子結合位點，上調 MUC5B 表達，表明 MUC5B 啟動子區單核苷酸多態性可能是與 IPF 發病相關的重要遺傳因素[15]。此外，Scholand 等[16]研究發現咳嗽的嚴重程度與 MUC5B rs35705950 啟動子 G>T 多態性顯著相關，提示了 IPF 表型遺傳學異質性的可能機制。有研究納入 438 例 IPF 患者，被檢出攜帶 MUC5B 基因多態性的患者共 37%，且未校正 2 年累計死亡率低于未攜帶 MUC5B 多態性的患者[17]。TOLLIP 與 MUC5B 位于同一基因位點，rs5743890、rs5743894 位于非編碼的 TOLLIP 調控區域內，rs5743890 作為保護性的次要等位基因可降低 IPF 患病的易感性，但與 IPF 患者的死亡率增加相關[18]。提示 MUC5B、TOLLIP 多態性在統計學上仍是生存的顯著預測因素，對于患有亞臨床或早期疾病的患者，在肺功能明顯下降前，通過綜合 MUC5B 及其他因素的預測能力來預測預后可能有所幫助。本研究結果提示中國 IPF 患者中，對預后相關的 MUC5B SNP rs35705950 及 TOLLIP SNP rs5743890 和 rs5743894 的基因多態性分布上絕大多數是由主要基因位點組成的純合子類型；在 rs35705950 表達中，有少數 GT 雜合子分布，而以次要基因位點 T 為純合子的 SNP 出現概率最小。而一項多中心臨床研究中報道韓國 IPF 患者中 TOLLIP rs5743890 基因位點具有次要等位基因 G 的頻率為 6%，在歐美白種 IPF 患者中報道分別接近 11% 和 29%[19]，提示黃種 IPF 患者 TOLLIP 和 MUC5B 的 SNP 攜帶次要基因位點的概率明顯低于白種 IPF 患者。本研究中具有基因變異的人群均為男性，與吸煙史及年齡無相關性，提示這種基因變異的分布可能具有性別優勢，但本研究為單中心研究，因此，中國 IPF 患者間的差異尚需要多中心大樣本量的研究進一步證實。
許多肺功能測試的生理變量是用來評估 IPF 疾病嚴重程度和預測 IPF 生存的重要指標，其中與預后確切相關的指標有 FVC、TLC、DLCO[20]。研究表明 6～12 個月 FVC 和 DLCO 的動態變化與 IPF 的預后高度相關，且比大多數基線特征更能預測預后[21]。另有研究表明攜帶 rs35705950 SNP 主要和次要等位基因的 IPF 患者具有不同的纖維化影像模式，攜帶 T 等位基因（T 組）與 CT 影像和組織學 UIP 診斷一致的患者密切相關，GG 純合子亞型具有更顯著的磨玻璃影表現，T 組顯示更為顯著的胸膜下軸線分布的纖維化病變，G 組和 T 組對于蜂窩病變病變表現無差異[22]。提示 MUC5B 啟動子多態性可識別 UIP/IPF 模式而區別其他原因導致的肺纖維化的模式。但既往研究尚未提及 HRCT 病變的動態變化與 MUC5B 啟動子多態性的相關性，我們的研究表明，兩個基因組患者的影像學的網格狀和蜂窩病變病變進展及肺功能變化有差異。這一結論與 Best 等[23]的研究結論一致，提示基因型與預后存在相關性。
KL-6 在 IPF 中一直作為纖維化的非特異性標志物被研究，報道指出 IPF 患者血清 KL-6 水平比健康志愿者明顯升高，作為一種黏液樣糖蛋白表達于Ⅱ型肺泡細胞的細胞外表面和細支氣管上皮細胞，并作為一種趨化因子促進了肺成纖維細胞的遷移、增殖和存活[24]。CXCL13 是引導 B 細胞到炎性病灶的關鍵中介因子，循環 CXCL13 水平在許多自身免疫綜合征中有明顯升高，CXCL13 的 B 細胞配體 C-X-C 趨化因子受體 5 具有介導淋巴細胞趨化性的作用，其出現與 IPF 具有臨床相關性。此外，IPF 自身抗體直接促進纖維化增生，促進炎癥反應或細胞毒性效應并與患者的臨床表現和預后高度相關[25]。最近研究發現 IPF 發病機制中出現異常 B 細胞，提示 CXCL13 可能是一種與 IPF 病因相關，反映纖維化進程的生物標志物[26]。本研究結果顯示 GT 基因型患者血清 KL-6、CXCL13 水平明顯低于 GG 基因型患者，然而在 5 年的隨訪期間其隨著病情波動起伏，變化缺少規律，因此其臨床應用價值尚需進一步研究。
GWAS 研究顯示基因型為 GT 和 TT 的 IPF 患者死亡風險明顯低于基因型為 GG 的患者，MUC5B rs35705950 SNP 與 IPF 的患者死亡率減少有關[2]。Peljto 等[19]認為潛在的創傷修復等因素使 MUC5B 的基因突變，雖然可導致 IPF 發病風險增高但其危害程度較小，因而其攜帶者疾病發病率增高而死亡率相對較低。Jiang 等[27]研究同樣證實了 MUC5B rs35705950 基因多態性增加 IPF 的易感性，但卻發現攜帶次要基因組的 IPF 患者肺功能 FVC 和 DLCO 有明顯下降，其 5 年生存率也有所降低，攜帶不同 MUC5B rs35705950 基因多態性的 IPF 患者預后差異也符合疾病異質性特點。我們的研究表明 GT 基因型較 GG 基因型的 IPF 患者具有更長的中位生存期，死亡人數明顯低于 GG 組。由于臨床過程復雜，機制不清，MUC5B 啟動子的基因多態性可能具有特異的病理學過程，包括具有更高的疾病易感性風險和不同的生存狀態，基因參與程度亦有個體性和復雜性，因而識別基因多態性對 IPF 預后的相關性有助于制定患者精準化治療策略。
綜上所述，中國 IPF 患者存在基因多態性現象；MUC5B rs35705950 和 TOLLIP rs5743890、rs5743894 基因亞型在中國 IPF 患者中突變率較低，可能預示中國 IPF 患者死亡率高且靶向藥物治療效果不佳。然而，本研究系單中心研究，且基因多態性具有人種差異，其與 IPF 發病相關的遺傳風險仍需多中心及擴大病例數進一步證實，異常調節的分子機制仍有待建立，基因多態性對中國 IPF 患者的相關性和臨床價值研究仍需一步明確。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
