引用本文： 林瑩妮, 周劍平, 李慶云. 氫氣在呼吸系統疾病模型中的應用及相關機制研究進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(3): 305-308. doi: 10.7507/1671-6205.201807009 復制
氫氣是密度最小且無色無味的氣體，具有可燃性和一定還原性，曾被認為是一種生理性惰性氣體。2007 年 Ohsawa 等[1]提出氫氣可選擇性清除氧自由基，并在大鼠腦缺血再灌注模型中證實氫氣的保護作用，開啟了氫氣醫學研究和應用的新紀元。迄今研究已證實氫氣對多個臟器缺血再灌注損傷、神經退行性疾病、骨關節疾病及呼吸系統疾病等具有潛在保護作用[2-3]。本文就氫氣在呼吸系統疾病模型中的應用及相關機制研究進展作一綜述。
1 氫氣在呼吸系統疾病模型中的應用
1.1 吸煙致慢性阻塞性肺疾病模型
氧化應激損傷是慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）發病機制之一。Ning 等[4]首次報道氫氣對煙熏大鼠慢阻肺模型的保護作用。在熏煙前 30 min 予以腹腔注射含氫生理鹽水可抑制氣道黏液積聚、炎癥細胞浸潤及杯狀細胞增生，抑制細胞凋亡，降低支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中脂質過氧化的標志物丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平。進一步研究發現，氫氣可能通過抑制表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸 1068 磷酸化、降低 Nrf2 表達量，進而減輕氧化應激損傷。另一研究發現在熏煙同時吸入氫氣可改善煙熏大鼠體重下降程度、肺功能及肺組織病理改變，降低平均肺動脈壓，抑制右心室肥厚，并減少 BALF 中炎癥因子及凋亡相關因子水平，提示氫氣可通過抑制炎癥反應及細胞凋亡來延緩大鼠慢阻肺模型肺損傷的發生[5]。應用維生素 C 合成障礙的 SMP30 基因敲除小鼠煙熏 8 周以建立肺氣腫模型，給予富氫水可改善肺泡破壞程度及靜態肺順應性，并降低 DNA 損傷標志物（?H2AX、8-OHdG）、衰老標志物（β-半乳糖苷酶）及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子 p16、p21 水平，提示氫氣可通過抑制吸煙所致 DNA 氧化損傷及過早衰老來減輕肺氣腫[6]。
1.2 支氣管哮喘模型
在大鼠卵清蛋白哮喘模型中，吸入氫氣可降低氣道阻力，減少細、小支氣管的管壁嗜酸性粒細胞、單核細胞、漿細胞和淋巴細胞的浸潤，并改善氣道、血管平滑肌及肺泡壁增厚等肺組織病理改變[7]。Xiao 等[8]研究也顯示，給卵清蛋白誘導的哮喘小鼠模型腹腔注射含氫生理鹽水可減少 BALF 總細胞數及炎癥因子水平，減少黏蛋白 muc5ac、膠原蛋白Ⅲ及血管內皮生長因子表達，抑制氣道重塑，提示氫氣具有抗哮喘的作用，可能通過抑制核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路實現。
1.3 急性肺損傷模型
多個研究表明在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）動物模型中，氫氣可改善 LPS 誘發的肺病理損傷，包括肺泡壁增厚、肺間質及肺泡腔炎癥細胞浸潤、肺實變及肺泡出血，降低肺濕/干重比，改善氧合，減少 BALF 中炎癥細胞、炎癥因子及趨化因子水平，降低肺組織硝基酪氨酸、MDA 水平，并抑制肺泡上皮細胞凋亡[9-11]。相關機制研究顯示氫氣可抑制Ⅱ型肺泡上皮細胞自噬[12]，并通過抑制 p38MAPK 通路[12]、ROS-JNK-Caspase3 通路[11]及 NF-κB 通路[9]起抗氧化、抗炎及抗凋亡作用。另外，氫氣可增加水通道蛋白 1 及水通道蛋白 5 的表達而對肺上皮細胞屏障起保護作用[13-14]，并通過激活肺泡上皮細胞中磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路而上調緊密連接蛋白-5 表達，減少細胞旁路通透性而改善肺水腫[15]。研究者還發現在盲腸結扎穿孔致急性肺損傷小鼠模型中，氫氣可通過抑制 Ras 同源基因（Rho）/Rho 激酶（ROCK）信號通路活性調控內皮細胞骨架重塑而改善內皮通透性[16]。蛋白組學研究顯示，氫氣治療組與對照組間的差異表達蛋白涉及 PI3K/Akt 信號通路、趨化因子信號通路、缺氧誘導因子 1 信號通路、補體與凝血級聯反應及過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路等[17]。此外，研究者還發現氫氣對百枯草[18-19]、油酸[20]、海水淹溺[21]、呼吸機治療[22-23]、萘/吉非替尼[24]、煙霧吸入[25]及燒傷[26-27]等誘發的 ALI 和放射性肺損傷[28]的動物模型均有類似保護作用。
長時間吸入高濃度氧氣致氧中毒的發病機制與過多氧自由基所致氧化損傷相關。吸入 2% 氫氣可改善高氧性肺損傷大鼠的氧合，減少炎癥反應，誘導血紅素氧合酶（HO-1）表達，延長平均生存時間，但在 Nrf2 基因敲除小鼠中未見氫氣的類似作用，提示氫氣對高氧性肺損傷的保護作用與 Nrf2 內源性抗氧化系統的激活相關[29]。另一項研究顯示氫氣可通過上調沉默信息調節因子 1（Sirt1）、抑制內質網應激而抑制非折疊蛋白反應（UPR）來對高氧性肺損傷起保護作用[30]。
1.4 肺缺血再灌注損傷模型
在肺移植大鼠模型中，Kawamura 等[31]發現受體大鼠在移植術后及再灌注后 1 h 吸入 2% 氫氣可改善受體氧合，減少移植肺 MDA 水平，并上調 Bcl-2 及 Bcl-xl 表達。而在供體大鼠機械通氣中給予 2% 氫氣亦能對移植肺起到類似保護作用[32]。此外，腦死亡供體大鼠吸入 2% 氫氣 2 h 可減少移植肺炎癥反應及氧化應激水平，并抑制受體大鼠全身炎癥反應[33]。Tanaka 等[34]予以供體大鼠術前吸入 2% 氫氣 3 h 后取移植肺組織行基因芯片分析發現，氫氣可上調 182 種基因，下調 47 種基因，其中上調基因包括肺表面活性物質相關基因、ATP 合成酶基因及應激反應相關基因等。在失血性休克/復蘇（HS/R）大鼠模型中，休克期及再灌注 1～6 h 內予以吸入 1.3% 氫氣可減輕間質水腫、炎癥細胞浸潤，改善機體氧合，減少肺組織氧化應激反應及炎癥反應，該作用可能與氫氣抑制 NF-κB 信號通路激活有關[35]。
1.5 污染物暴露相關肺損傷模型
富氫水可通過增加巨噬細胞吞噬能力而加速大鼠肺及血液中吸入碳納米顆粒及碳微顆粒的清除，減少肺組織的碳末沉積，并降低肺組織硫代巴比妥酸反應物（TBARS）水平，提示氫氣可減少吸入細微顆粒誘發的肺損傷[36]。
1.6 肺惡性腫瘤模型
氫氣培養可抑制非小細胞肺癌細胞系 A549 及 H1975 細胞活力及侵襲性，促進細胞凋亡，同時，吸入氫氣可抑制 A549 裸鼠異種移植模型腫瘤生長，該作用可能與氫氣抑制細胞分裂過程中染色體結構維持蛋白 3 表達相關[37]。研究還顯示，氫氣可通過抑制 PI3K/Akt 信號通路來促進 A549 細胞凋亡，且氫氣聯合 PI3K 抑制劑對 A549 抑制作用優于單藥處理[38]。另外，吸入氫氣還可降低非小細胞肺癌裸鼠異種移植模型腫瘤組織中 Ki67、環氧化酶 2 及血管內皮生長因子表達，并抑制腫瘤生長[39]。
2 氫氣作用機制
2.1 氧自由基清除機制
氫氣選擇性地清除強毒性的羥自由基（.OH）和亞硝酸陰離子（–ONOO）[1]，以減輕蛋白質、DNA 等的氧化損傷，且不影響過氧化氫（H2O2）及一氧化氮（NO）等具有信號通路作用的自由基。但有學者指出，該經典假說并不能完全解釋氫氣的生物學效應，這是因為機體通過飲用氫氣水或吸入氫氣所獲取的氫氣量不足以中和正常或疾病狀態下持續釋放的氧自由基，且氫氣作用的劑量-效應關系并不明確[2]。因此，氫氣可能通過其他非氧自由基清除機制來發揮作用。
2.2 非氧自由基清除機制
Itoh 等[40]于 2009 年首次報道氫氣可減少 RBL-2H3 漿細胞 IgE 高親和力受體 FcεRI 相關的 Lyn 磷酸化，從而抑制 I 型超敏反應，該作用與中和羥自由基的機制無關，而與氫氣調控信號通路機制相關。因此，氫氣可能作為一種氣體信號分子來發揮效應。
氫氣可調控多個信號通路，包括 NF-κB[8-9, 23]、Nrf2[21]、p38MAPK[12]、JNK[11, 13]、Wnt/β-catenin[3]、PI3K/Akt[15]、硫氧還蛋白互作蛋白（Txnip）/NLR3 炎性小體[41]及 Rho/ROCK 等信號通路[16]。通過影響上述信號通路，氫氣調控多種基因和蛋白的表達水平，在多個動物模型中氫氣可下調腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、白細胞介素-1、髓過氧化物酶等多種炎癥因子[11, 20, 26]，上調 Bcl-2、Bcl-xl 等抗凋亡因子[22]，并調節 HO-1[29]、超氧化物歧化酶（SOD）[33]等的表達，以及抑制 NF-κB 調控的基因表達，如 Bcl6、G6pc、Egr1 及 Dusp1 等[42]。新近研究顯示低濃度氫氣（>1.3%）可通過抑制磷脂的自動氧化反應而減少細胞內鈣離子濃度，從而抑制鈣信號通路，并調控下游多個目標基因的表達[43]。
3 小結與展望
綜上所述，多個研究已經證實氫氣對急慢性肺損傷具有潛在保護作用，然而，氫氣如何調控信號通路、該調控作用是否存在細胞、組織或病理狀態特異性等問題均需進一步闡明。此外，雖然基礎研究取得了一定進展，但將氫氣治療應用于臨床仍面臨諸多挑戰。關于給藥途徑、濃度及毒副作用，已有的臨床研究顯示富氫水（0.5～1.0 L/d，氫氣濃度為 0.5～0.8 mmol/L）可有效改善帕金森病、高膽固醇血癥及類風濕性關節炎，且無毒副作用報道[44-46]。但有研究指出富氫水（1.5～2 L/d，氫氣濃度為 0.55～0.65 mmol/L）治療 4～8 周后血清天冬氨酸氨基轉移酶和丙氨酸氨基轉移酶下降，而總膽紅素升高，但均沒有超出臨床正常范圍[47]。另一項研究顯示氫氧混合氣（67%/33%）吸入（1 h/d）30 d 耐受性良好，且有助于改善環衛工人咳嗽等呼吸系統癥狀及肺功能[48]。后續仍需要更多大樣本的前瞻性研究來進一步明確氫氣保護作用機制及潛在的毒副作用；解決不同病種中氫氣的給予方式、最佳濃度及時間等問題，及如何控制氫氣吸入量，減少設備、環境及個體因素的影響等。
氫氣是密度最小且無色無味的氣體，具有可燃性和一定還原性，曾被認為是一種生理性惰性氣體。2007 年 Ohsawa 等[1]提出氫氣可選擇性清除氧自由基，并在大鼠腦缺血再灌注模型中證實氫氣的保護作用，開啟了氫氣醫學研究和應用的新紀元。迄今研究已證實氫氣對多個臟器缺血再灌注損傷、神經退行性疾病、骨關節疾病及呼吸系統疾病等具有潛在保護作用[2-3]。本文就氫氣在呼吸系統疾病模型中的應用及相關機制研究進展作一綜述。
1 氫氣在呼吸系統疾病模型中的應用
1.1 吸煙致慢性阻塞性肺疾病模型
氧化應激損傷是慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）發病機制之一。Ning 等[4]首次報道氫氣對煙熏大鼠慢阻肺模型的保護作用。在熏煙前 30 min 予以腹腔注射含氫生理鹽水可抑制氣道黏液積聚、炎癥細胞浸潤及杯狀細胞增生，抑制細胞凋亡，降低支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中脂質過氧化的標志物丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平。進一步研究發現，氫氣可能通過抑制表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸 1068 磷酸化、降低 Nrf2 表達量，進而減輕氧化應激損傷。另一研究發現在熏煙同時吸入氫氣可改善煙熏大鼠體重下降程度、肺功能及肺組織病理改變，降低平均肺動脈壓，抑制右心室肥厚，并減少 BALF 中炎癥因子及凋亡相關因子水平，提示氫氣可通過抑制炎癥反應及細胞凋亡來延緩大鼠慢阻肺模型肺損傷的發生[5]。應用維生素 C 合成障礙的 SMP30 基因敲除小鼠煙熏 8 周以建立肺氣腫模型，給予富氫水可改善肺泡破壞程度及靜態肺順應性，并降低 DNA 損傷標志物（?H2AX、8-OHdG）、衰老標志物（β-半乳糖苷酶）及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子 p16、p21 水平，提示氫氣可通過抑制吸煙所致 DNA 氧化損傷及過早衰老來減輕肺氣腫[6]。
1.2 支氣管哮喘模型
在大鼠卵清蛋白哮喘模型中，吸入氫氣可降低氣道阻力，減少細、小支氣管的管壁嗜酸性粒細胞、單核細胞、漿細胞和淋巴細胞的浸潤，并改善氣道、血管平滑肌及肺泡壁增厚等肺組織病理改變[7]。Xiao 等[8]研究也顯示，給卵清蛋白誘導的哮喘小鼠模型腹腔注射含氫生理鹽水可減少 BALF 總細胞數及炎癥因子水平，減少黏蛋白 muc5ac、膠原蛋白Ⅲ及血管內皮生長因子表達，抑制氣道重塑，提示氫氣具有抗哮喘的作用，可能通過抑制核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路實現。
1.3 急性肺損傷模型
多個研究表明在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）動物模型中，氫氣可改善 LPS 誘發的肺病理損傷，包括肺泡壁增厚、肺間質及肺泡腔炎癥細胞浸潤、肺實變及肺泡出血，降低肺濕/干重比，改善氧合，減少 BALF 中炎癥細胞、炎癥因子及趨化因子水平，降低肺組織硝基酪氨酸、MDA 水平，并抑制肺泡上皮細胞凋亡[9-11]。相關機制研究顯示氫氣可抑制Ⅱ型肺泡上皮細胞自噬[12]，并通過抑制 p38MAPK 通路[12]、ROS-JNK-Caspase3 通路[11]及 NF-κB 通路[9]起抗氧化、抗炎及抗凋亡作用。另外，氫氣可增加水通道蛋白 1 及水通道蛋白 5 的表達而對肺上皮細胞屏障起保護作用[13-14]，并通過激活肺泡上皮細胞中磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路而上調緊密連接蛋白-5 表達，減少細胞旁路通透性而改善肺水腫[15]。研究者還發現在盲腸結扎穿孔致急性肺損傷小鼠模型中，氫氣可通過抑制 Ras 同源基因（Rho）/Rho 激酶（ROCK）信號通路活性調控內皮細胞骨架重塑而改善內皮通透性[16]。蛋白組學研究顯示，氫氣治療組與對照組間的差異表達蛋白涉及 PI3K/Akt 信號通路、趨化因子信號通路、缺氧誘導因子 1 信號通路、補體與凝血級聯反應及過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路等[17]。此外，研究者還發現氫氣對百枯草[18-19]、油酸[20]、海水淹溺[21]、呼吸機治療[22-23]、萘/吉非替尼[24]、煙霧吸入[25]及燒傷[26-27]等誘發的 ALI 和放射性肺損傷[28]的動物模型均有類似保護作用。
長時間吸入高濃度氧氣致氧中毒的發病機制與過多氧自由基所致氧化損傷相關。吸入 2% 氫氣可改善高氧性肺損傷大鼠的氧合，減少炎癥反應，誘導血紅素氧合酶（HO-1）表達，延長平均生存時間，但在 Nrf2 基因敲除小鼠中未見氫氣的類似作用，提示氫氣對高氧性肺損傷的保護作用與 Nrf2 內源性抗氧化系統的激活相關[29]。另一項研究顯示氫氣可通過上調沉默信息調節因子 1（Sirt1）、抑制內質網應激而抑制非折疊蛋白反應（UPR）來對高氧性肺損傷起保護作用[30]。
1.4 肺缺血再灌注損傷模型
在肺移植大鼠模型中，Kawamura 等[31]發現受體大鼠在移植術后及再灌注后 1 h 吸入 2% 氫氣可改善受體氧合，減少移植肺 MDA 水平，并上調 Bcl-2 及 Bcl-xl 表達。而在供體大鼠機械通氣中給予 2% 氫氣亦能對移植肺起到類似保護作用[32]。此外，腦死亡供體大鼠吸入 2% 氫氣 2 h 可減少移植肺炎癥反應及氧化應激水平，并抑制受體大鼠全身炎癥反應[33]。Tanaka 等[34]予以供體大鼠術前吸入 2% 氫氣 3 h 后取移植肺組織行基因芯片分析發現，氫氣可上調 182 種基因，下調 47 種基因，其中上調基因包括肺表面活性物質相關基因、ATP 合成酶基因及應激反應相關基因等。在失血性休克/復蘇（HS/R）大鼠模型中，休克期及再灌注 1～6 h 內予以吸入 1.3% 氫氣可減輕間質水腫、炎癥細胞浸潤，改善機體氧合，減少肺組織氧化應激反應及炎癥反應，該作用可能與氫氣抑制 NF-κB 信號通路激活有關[35]。
1.5 污染物暴露相關肺損傷模型
富氫水可通過增加巨噬細胞吞噬能力而加速大鼠肺及血液中吸入碳納米顆粒及碳微顆粒的清除，減少肺組織的碳末沉積，并降低肺組織硫代巴比妥酸反應物（TBARS）水平，提示氫氣可減少吸入細微顆粒誘發的肺損傷[36]。
1.6 肺惡性腫瘤模型
氫氣培養可抑制非小細胞肺癌細胞系 A549 及 H1975 細胞活力及侵襲性，促進細胞凋亡，同時，吸入氫氣可抑制 A549 裸鼠異種移植模型腫瘤生長，該作用可能與氫氣抑制細胞分裂過程中染色體結構維持蛋白 3 表達相關[37]。研究還顯示，氫氣可通過抑制 PI3K/Akt 信號通路來促進 A549 細胞凋亡，且氫氣聯合 PI3K 抑制劑對 A549 抑制作用優于單藥處理[38]。另外，吸入氫氣還可降低非小細胞肺癌裸鼠異種移植模型腫瘤組織中 Ki67、環氧化酶 2 及血管內皮生長因子表達，并抑制腫瘤生長[39]。
2 氫氣作用機制
2.1 氧自由基清除機制
氫氣選擇性地清除強毒性的羥自由基（.OH）和亞硝酸陰離子（–ONOO）[1]，以減輕蛋白質、DNA 等的氧化損傷，且不影響過氧化氫（H2O2）及一氧化氮（NO）等具有信號通路作用的自由基。但有學者指出，該經典假說并不能完全解釋氫氣的生物學效應，這是因為機體通過飲用氫氣水或吸入氫氣所獲取的氫氣量不足以中和正常或疾病狀態下持續釋放的氧自由基，且氫氣作用的劑量-效應關系并不明確[2]。因此，氫氣可能通過其他非氧自由基清除機制來發揮作用。
2.2 非氧自由基清除機制
Itoh 等[40]于 2009 年首次報道氫氣可減少 RBL-2H3 漿細胞 IgE 高親和力受體 FcεRI 相關的 Lyn 磷酸化，從而抑制 I 型超敏反應，該作用與中和羥自由基的機制無關，而與氫氣調控信號通路機制相關。因此，氫氣可能作為一種氣體信號分子來發揮效應。
氫氣可調控多個信號通路，包括 NF-κB[8-9, 23]、Nrf2[21]、p38MAPK[12]、JNK[11, 13]、Wnt/β-catenin[3]、PI3K/Akt[15]、硫氧還蛋白互作蛋白（Txnip）/NLR3 炎性小體[41]及 Rho/ROCK 等信號通路[16]。通過影響上述信號通路，氫氣調控多種基因和蛋白的表達水平，在多個動物模型中氫氣可下調腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、白細胞介素-1、髓過氧化物酶等多種炎癥因子[11, 20, 26]，上調 Bcl-2、Bcl-xl 等抗凋亡因子[22]，并調節 HO-1[29]、超氧化物歧化酶（SOD）[33]等的表達，以及抑制 NF-κB 調控的基因表達，如 Bcl6、G6pc、Egr1 及 Dusp1 等[42]。新近研究顯示低濃度氫氣（>1.3%）可通過抑制磷脂的自動氧化反應而減少細胞內鈣離子濃度，從而抑制鈣信號通路，并調控下游多個目標基因的表達[43]。
3 小結與展望
綜上所述，多個研究已經證實氫氣對急慢性肺損傷具有潛在保護作用，然而，氫氣如何調控信號通路、該調控作用是否存在細胞、組織或病理狀態特異性等問題均需進一步闡明。此外，雖然基礎研究取得了一定進展，但將氫氣治療應用于臨床仍面臨諸多挑戰。關于給藥途徑、濃度及毒副作用，已有的臨床研究顯示富氫水（0.5～1.0 L/d，氫氣濃度為 0.5～0.8 mmol/L）可有效改善帕金森病、高膽固醇血癥及類風濕性關節炎，且無毒副作用報道[44-46]。但有研究指出富氫水（1.5～2 L/d，氫氣濃度為 0.55～0.65 mmol/L）治療 4～8 周后血清天冬氨酸氨基轉移酶和丙氨酸氨基轉移酶下降，而總膽紅素升高，但均沒有超出臨床正常范圍[47]。另一項研究顯示氫氧混合氣（67%/33%）吸入（1 h/d）30 d 耐受性良好，且有助于改善環衛工人咳嗽等呼吸系統癥狀及肺功能[48]。后續仍需要更多大樣本的前瞻性研究來進一步明確氫氣保護作用機制及潛在的毒副作用；解決不同病種中氫氣的給予方式、最佳濃度及時間等問題，及如何控制氫氣吸入量，減少設備、環境及個體因素的影響等。