引用本文： 周永召, 李亞倫, 范紅, 李為民. 臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病精準診療中的疑問解析. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(6): 539-543. doi: 10.7507/1671-6205.201804048 復制
感染性疾病是全球發病率與死亡率最高的疾病，呼吸道感染是感染性疾病中最主要的部分[1]。抗生素濫用導致的細菌耐藥已成為影響人類健康的最主要威脅之一[2]，我國于 2016 年發起“遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016–2020 年）”[3]，但是避免抗生素濫用、遏制細菌耐藥的關鍵在感染性疾病病原菌的早期、快速、精準診斷。隨著微生物宏基因組測序價格的幾何級下降[4]，臨床宏基因組學（clinical metagenomics）由實驗室快速走向臨床。2018 年版《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南》（下稱指南）指出：臨床宏基因組學能夠顯著提高病原檢測的敏感度，縮短檢測時間，對罕見病原菌感染的診斷具有優勢，鑒于此，可審慎地用于現有成熟檢測技術不能確定的病原體[5]。2016 年 10 月，第一屆世界臨床宏基因組學大會深入探討了臨床宏基因組學在感染性疾病臨床應用中的相關疑問[6]，指出該技術應用于臨床尚需解決許多問題，基于此，本文就目前臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病應用中的疑問作進一步的解析。
1 臨床宏基因組學的定義
目前明確感染性疾病病原菌的主要手段有微生物培養技術[7]、核酸擴增技術、血清學病原菌抗體檢測技術[8]及特定病原菌的多重 PCR 技術[9]。其中，微生物培養技術確診病原菌至少需要 12 h 以上，核酸擴增技術及血清學病原菌抗體檢測技術雖然方便快捷，但特異性低，多重 PCR 技術也只能明確特定的幾種病原菌。因此，約 60% 的感染性疾病仍不能明確病因[10]。
臨床宏基因組學是運用高通量測序技術，不依賴傳統的微生物培養而明確樣本中所有微生物分類及功能的檢測技術[6, 11]。該技術能夠無偏倚的在同一樣本中同時檢測已知或者未知的細菌、真菌、病毒、寄生蟲，且無需特異性擴增，適用于未知病原菌的感染性疾病暴發調查，傳統檢測結果陰性的感染患者，免疫缺陷患者及危重癥感染患者[12]。狹義的臨床宏基因組學技術主要是指鳥槍法二代測序技術（shotgun next generation sequencing），主要測序流程是首先將樣本中的所有 DNA 打斷成小片段，然后建庫并上機測序，運用生物信息學方法將測序結果進行拼接，最后比對數據庫明確所檢測物種[13]。廣義的臨床宏基因組學技術還包括擴增子二代測序技術，主要包括檢測細菌的 16S rRNA（16S ribosomal RNA）擴增子測序技術和檢測真菌的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer, ITS）擴增子測序技術。主要測序流程是首先獲取樣本中的所有 DNA，然后使用特定細菌或者真菌的引物進行 PCR 擴增，建庫并上機測序，運用生物信息學方法獲得合格測序數據，最后比對數據庫明確檢測物種[14]。值得一提的是，臨床宏基因組學能夠同時明確樣本中的細菌、真菌、病毒及原蟲，并且能夠精確到種水平，還能夠明確微生物的抗生素耐藥等功能；而擴增子測序技術僅能明確樣本中的細菌或真菌，可精確到屬水平，微生物相關功能只能根據數據庫進行推測[15]。
2 臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病中的應用模式
臨床宏基因組學被認為是明確感染性疾病病原菌的最有力武器[16]，但是目前還沒有一個統一的臨床使用路徑。我們結合臨床醫生、樣品取樣人員、實驗室樣品處理技術員及生物信息分析師在臨床宏基因組學臨床應用中的工作特征，總結了臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病精準診療中的應用模式（圖 1）。這一模式需要臨床醫生、樣品取樣人員、實驗室樣品處理技術員及生物信息分析師之間相互溝通，以便獲取最有效的數據并給予精準用藥。
圖1
臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病精準診療中的應用模式
3 臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病中的應用范例
呼吸道感染患者的檢測樣本主要包括痰液、氣道吸出物以及肺泡灌洗液。Moran Losada 等[17]運用臨床宏基因組學的方法檢測不同年齡階段的囊性肺纖維化患者的誘導痰液樣本，證實 99% 的呼吸道微生物是數百種細菌，主要以銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌為主，而 10 種真菌和病毒僅占呼吸道微生物的 1% 左右，真菌主要為念珠菌和曲霉菌，病毒主要為腺病毒和皰疹病毒；該研究同時明確了每例呼吸道樣本中每種微生物的豐度；此外，該研究證實銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的相關抗生素耐藥基因，為抗生素的精準選用提供了依據。Langelier 等[18]納入 22 例因下呼吸道感染入院的骨髓移植患者，運用臨床宏基因組學的方法檢測每位患者 250 μl 的肺泡灌洗液樣本，結果證實急性呼吸道感染的骨髓移植患者肺部存在 HCOV 229E、HRV-A、HHV-6、CMV、HSV、EBV、人乳頭瘤病毒及扭矩特諾病毒等多種病毒，同時存在少見的致病性細菌：輕型鏈球菌（Streptococcus mitis）及棒狀桿菌（Corynebacterium Propinquum），且細菌與病毒共存患者的臨床癥狀明顯較重。此外，臨床宏基因組學也被用于明確肺移植患者繼發肺部感染時肺部微生物特征[19]。
4 臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病精準診療應用中的疑問
經驗性廣譜抗菌治療相對于窄譜抗菌治療不能顯著改善患者的臨床癥狀及預后，不良事件發生率卻明顯增高[20]。因此，臨床上急需早期精準快速的病原菌診斷技術。臨床宏基因組學作為能夠快速（最短 9 h 內）[21]在同一個樣本中精準明確可能致病微生物（包括細菌、真菌、病毒或寄生蟲）及相應微生物抗生素耐藥基因的診斷技術[22]，是實現呼吸感染性疾病精準診療，避免抗生素濫用的關鍵技術之一[23]。雖然臨床宏基因組學在呼吸道病原微生物診斷中是一項非常有應用前景的工具，但還是有多個疑問。
4.1 臨床宏基因組學是否適用于所有呼吸感染患者？
理論上，臨床宏基因組學適用于所有呼吸感染患者的精準診斷。但是，對于免疫功能正常的社區獲得性肺炎患者，常見的主要致病菌為肺炎支原體及肺炎鏈球菌，病毒所致社區獲得性肺炎患者約占 15%～35%，主要以流感病毒為主，真菌感染則非常少見，而且社區獲得性肺炎病原微生物攜帶多重耐藥基因較少[24]。因此，初步的診斷選擇應以更經濟及便利的傳統微生物檢測技術為主。而對于特殊人群如嬰幼兒、高齡或合并基礎疾病的患者、免疫缺陷人群、反復住院患者、傳統微生物檢測技術反復檢測陰性且治療效果不佳患者、疑似特殊病原體感染患者、不明原因的感染性疾病患者、因病情危重需盡早明確病原菌患者，一方面，因致病微生物復雜，傳統機會性致病菌可能成為主要的致病微生物，另一方面，致病微生物攜帶多重抗生素耐藥基因[25]，在這種情況下，臨床宏基因組學是最好的診斷選擇[12, 21-22, 26]。
4.2 臨床宏基因組學獲得的病原微生物抗生素耐藥是否可靠？
臨床宏基因組學臨床應用的重要優勢之一是不依賴微生物藥敏試驗而精確預測微生物的抗生素耐藥狀況[17, 27]。這種基于微生物基因型預測抗生素耐藥表型的生物信息學技術，首先依賴抗生素耐藥數據庫的選擇，其次是該數據庫中需具有相關抗生素耐藥信息；而且部分抗生素耐藥源于基因突變，而目前這類研究缺乏。因此，臨床宏基因組學精確預測微生物抗生素耐藥還存在局限性，對于預測數據庫中存在的微生物獲得性抗生素耐藥比較精準；而對于預測基因突變導致的抗生素耐藥（例如銅綠假單胞菌的 oprD 耐藥突變）的精確度還難以保證[22]。常用的抗生素耐藥數據庫主要有 Resfinder[28]、CARD[29]和 ARG-ANNOT[30]。因此，對于臨床宏基因組學獲得的病原微生物抗生素耐藥基因，一方面需要結合患者具體的臨床信息，另一方面需要結合抗生素耐藥基因類型進行綜合判斷，以期協助制定最合理的抗生素應用方案。
4.3 臨床宏基因組學診斷的敏感性及特異性如何？
相對于傳統的微生物培養技術，臨床宏基因組學在呼吸道樣本微生物診斷的特異性高達 99.8%～100%；即使在腦脊液樣本中，臨床宏基因組學的微生物診斷敏感性和特異性也分別高達 84.3% 和 93.7%[10]。雖然臨床宏基因組學診斷的敏感性和特異性高，但是獲得的微生物是否為致病微生物亦需要結合患者的臨床特征進行綜合分析。因此，運用臨床宏基因組學動態監測呼吸道微生物變化可能是確診真實致病菌的有效手段之一。
4.4 臨床宏基因組學如何區分測得微生物是致病、定植還是污染？
臨床宏基因組學在同一個樣本中可獲得數百種細菌、病毒、真菌及寄生蟲等[17]。獲得微生物測序結果后，首先面對的問題是如何區分所明確的微生物是致病、定植還是污染。結合目前的相關研究，我們認為：一方面，臨床宏基因組學能夠獲得各個微生物的豐度信息，隨著生物信息學分析技術的發展，結合測序數據與傳統培養的集落形成單位，能夠進一步促進微生物的定量檢測[31]，由此可以明確各個微生物含量多少，可作為區分致病、定植還是污染的依據之一[16]；另一方面，結合宿主的免疫組學檢測可區分微生物是感染還是定植[32]，即使免疫力低下患者，宿主的免疫變化也是判定微生物定植與感染的標志之一[16]。因此，作為臨床宏基因組學臨床應用的最大難題之一，上述判斷方法是目前臨床宏基因組學判斷測得微生物是致病、定植還是污染的主要方法，而更精確有效的判斷方法需要更深一步的研究證實。
4.5 臨床宏基因組學的應用平臺有哪些？
臨床宏基因組學目前主要是基于 150～300 bp 的短片段 illumina 測序平臺[22, 33-34]，Life 公司的 SOLiD 5500 平臺[17]及華大基因的 BGISEQ-100 平臺[35]也有部分應用。近期，也有少部分研究是基于 Pacific Biosciences[36]和 Oxford Nanopore 長片段測序平臺[37]。
4.6 臨床宏基因組學如何降低宿主 DNA 對于微生物 DNA 的影響？
在痰液、肺泡灌洗液等呼吸道樣本中，95% 的 DNA 源自宿主，是影響微生物檢測的重要因素[38]，因此盡可能多的去除宿主 DNA 是提高微生物檢測靈敏度及精確診斷的重要策略之一。目前臨床宏基因組學的臨床應用中已經有相應的去宿主 DNA 試劑盒（Mo1Ysis Basic kit）[26]和去宿主 DNA 相關實驗流程[38]，也有相應的微生物富集生物信息學方案[39]。
4.7 臨床宏基因組學如何處理操作污染？
臨床宏基因組學所獲得的測序數據中只有<5% 的微生物序列[38]。因此，實驗試劑、耗材、取樣、運輸及 DNA 提取過程中任何操作都可能帶來相應的微生物污染[40-41]。因此，應合理設置陰性對照組以提高微生物精確診斷[40]。臨床醫生也應該和樣品取樣人員、樣品處理人員及生物信息分析人員全面分析測序結果。
4.8 臨床宏基因組學是否有標準的檢測流程及質控標準？
目前臨床宏基因組學雖然已經應用于臨床，但是還沒有大規模的相關研究證實其一線應用的可靠性和經濟、社會價值；而且目前臨床宏基因組學樣本實驗室處理的試劑耗材各異，測序平臺不一，生物信息分析對照數據庫也不同，因此亟需大規模多中心臨床試驗制定統一的質控標準及檢測流程[6]。
5 結論與展望
臨床宏基因組學是實現呼吸感染性疾病精準診療的基礎及關鍵技術之一，雖然 2018 年版指南已推薦臨床宏基因組學可用于臨床診斷，由于缺乏統一完善的檢測流程和質控標準，臨床宏基因組學還不能全面應用于臨床，目前需要結合傳統感染診療方法及患者臨床信息進行綜合應用。隨著免疫組學、微生物代謝組學、微生物蛋白組學及微生物轉錄組學的聯合應用，呼吸感染性疾病的診療已經進入了精準醫學時代[23]，未來臨床宏基因組學將在以下兩個方面獲得重要突破：（1）實現病原菌在 12 h 內確診，并同時獲得相關致病菌耐藥信息；（2）通過患者免疫反應監測明確微生物定植或者感染。從而最終遏制細菌耐藥，實現抗生素合理應用，最終降低感染性疾病的經濟及社會負擔。
感染性疾病是全球發病率與死亡率最高的疾病，呼吸道感染是感染性疾病中最主要的部分[1]。抗生素濫用導致的細菌耐藥已成為影響人類健康的最主要威脅之一[2]，我國于 2016 年發起“遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016–2020 年）”[3]，但是避免抗生素濫用、遏制細菌耐藥的關鍵在感染性疾病病原菌的早期、快速、精準診斷。隨著微生物宏基因組測序價格的幾何級下降[4]，臨床宏基因組學（clinical metagenomics）由實驗室快速走向臨床。2018 年版《中國成人醫院獲得性肺炎與呼吸機相關性肺炎診斷和治療指南》（下稱指南）指出：臨床宏基因組學能夠顯著提高病原檢測的敏感度，縮短檢測時間，對罕見病原菌感染的診斷具有優勢，鑒于此，可審慎地用于現有成熟檢測技術不能確定的病原體[5]。2016 年 10 月，第一屆世界臨床宏基因組學大會深入探討了臨床宏基因組學在感染性疾病臨床應用中的相關疑問[6]，指出該技術應用于臨床尚需解決許多問題，基于此，本文就目前臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病應用中的疑問作進一步的解析。
1 臨床宏基因組學的定義
目前明確感染性疾病病原菌的主要手段有微生物培養技術[7]、核酸擴增技術、血清學病原菌抗體檢測技術[8]及特定病原菌的多重 PCR 技術[9]。其中，微生物培養技術確診病原菌至少需要 12 h 以上，核酸擴增技術及血清學病原菌抗體檢測技術雖然方便快捷，但特異性低，多重 PCR 技術也只能明確特定的幾種病原菌。因此，約 60% 的感染性疾病仍不能明確病因[10]。
臨床宏基因組學是運用高通量測序技術，不依賴傳統的微生物培養而明確樣本中所有微生物分類及功能的檢測技術[6, 11]。該技術能夠無偏倚的在同一樣本中同時檢測已知或者未知的細菌、真菌、病毒、寄生蟲，且無需特異性擴增，適用于未知病原菌的感染性疾病暴發調查，傳統檢測結果陰性的感染患者，免疫缺陷患者及危重癥感染患者[12]。狹義的臨床宏基因組學技術主要是指鳥槍法二代測序技術（shotgun next generation sequencing），主要測序流程是首先將樣本中的所有 DNA 打斷成小片段，然后建庫并上機測序，運用生物信息學方法將測序結果進行拼接，最后比對數據庫明確所檢測物種[13]。廣義的臨床宏基因組學技術還包括擴增子二代測序技術，主要包括檢測細菌的 16S rRNA（16S ribosomal RNA）擴增子測序技術和檢測真菌的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer, ITS）擴增子測序技術。主要測序流程是首先獲取樣本中的所有 DNA，然后使用特定細菌或者真菌的引物進行 PCR 擴增，建庫并上機測序，運用生物信息學方法獲得合格測序數據，最后比對數據庫明確檢測物種[14]。值得一提的是，臨床宏基因組學能夠同時明確樣本中的細菌、真菌、病毒及原蟲，并且能夠精確到種水平，還能夠明確微生物的抗生素耐藥等功能；而擴增子測序技術僅能明確樣本中的細菌或真菌，可精確到屬水平，微生物相關功能只能根據數據庫進行推測[15]。
2 臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病中的應用模式
臨床宏基因組學被認為是明確感染性疾病病原菌的最有力武器[16]，但是目前還沒有一個統一的臨床使用路徑。我們結合臨床醫生、樣品取樣人員、實驗室樣品處理技術員及生物信息分析師在臨床宏基因組學臨床應用中的工作特征，總結了臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病精準診療中的應用模式（圖 1）。這一模式需要臨床醫生、樣品取樣人員、實驗室樣品處理技術員及生物信息分析師之間相互溝通，以便獲取最有效的數據并給予精準用藥。
圖1
臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病精準診療中的應用模式
3 臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病中的應用范例
呼吸道感染患者的檢測樣本主要包括痰液、氣道吸出物以及肺泡灌洗液。Moran Losada 等[17]運用臨床宏基因組學的方法檢測不同年齡階段的囊性肺纖維化患者的誘導痰液樣本，證實 99% 的呼吸道微生物是數百種細菌，主要以銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌為主，而 10 種真菌和病毒僅占呼吸道微生物的 1% 左右，真菌主要為念珠菌和曲霉菌，病毒主要為腺病毒和皰疹病毒；該研究同時明確了每例呼吸道樣本中每種微生物的豐度；此外，該研究證實銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的相關抗生素耐藥基因，為抗生素的精準選用提供了依據。Langelier 等[18]納入 22 例因下呼吸道感染入院的骨髓移植患者，運用臨床宏基因組學的方法檢測每位患者 250 μl 的肺泡灌洗液樣本，結果證實急性呼吸道感染的骨髓移植患者肺部存在 HCOV 229E、HRV-A、HHV-6、CMV、HSV、EBV、人乳頭瘤病毒及扭矩特諾病毒等多種病毒，同時存在少見的致病性細菌：輕型鏈球菌（Streptococcus mitis）及棒狀桿菌（Corynebacterium Propinquum），且細菌與病毒共存患者的臨床癥狀明顯較重。此外，臨床宏基因組學也被用于明確肺移植患者繼發肺部感染時肺部微生物特征[19]。
4 臨床宏基因組學在呼吸感染性疾病精準診療應用中的疑問
經驗性廣譜抗菌治療相對于窄譜抗菌治療不能顯著改善患者的臨床癥狀及預后，不良事件發生率卻明顯增高[20]。因此，臨床上急需早期精準快速的病原菌診斷技術。臨床宏基因組學作為能夠快速（最短 9 h 內）[21]在同一個樣本中精準明確可能致病微生物（包括細菌、真菌、病毒或寄生蟲）及相應微生物抗生素耐藥基因的診斷技術[22]，是實現呼吸感染性疾病精準診療，避免抗生素濫用的關鍵技術之一[23]。雖然臨床宏基因組學在呼吸道病原微生物診斷中是一項非常有應用前景的工具，但還是有多個疑問。
4.1 臨床宏基因組學是否適用于所有呼吸感染患者？
理論上，臨床宏基因組學適用于所有呼吸感染患者的精準診斷。但是，對于免疫功能正常的社區獲得性肺炎患者，常見的主要致病菌為肺炎支原體及肺炎鏈球菌，病毒所致社區獲得性肺炎患者約占 15%～35%，主要以流感病毒為主，真菌感染則非常少見，而且社區獲得性肺炎病原微生物攜帶多重耐藥基因較少[24]。因此，初步的診斷選擇應以更經濟及便利的傳統微生物檢測技術為主。而對于特殊人群如嬰幼兒、高齡或合并基礎疾病的患者、免疫缺陷人群、反復住院患者、傳統微生物檢測技術反復檢測陰性且治療效果不佳患者、疑似特殊病原體感染患者、不明原因的感染性疾病患者、因病情危重需盡早明確病原菌患者，一方面，因致病微生物復雜，傳統機會性致病菌可能成為主要的致病微生物，另一方面，致病微生物攜帶多重抗生素耐藥基因[25]，在這種情況下，臨床宏基因組學是最好的診斷選擇[12, 21-22, 26]。
4.2 臨床宏基因組學獲得的病原微生物抗生素耐藥是否可靠？
臨床宏基因組學臨床應用的重要優勢之一是不依賴微生物藥敏試驗而精確預測微生物的抗生素耐藥狀況[17, 27]。這種基于微生物基因型預測抗生素耐藥表型的生物信息學技術，首先依賴抗生素耐藥數據庫的選擇，其次是該數據庫中需具有相關抗生素耐藥信息；而且部分抗生素耐藥源于基因突變，而目前這類研究缺乏。因此，臨床宏基因組學精確預測微生物抗生素耐藥還存在局限性，對于預測數據庫中存在的微生物獲得性抗生素耐藥比較精準；而對于預測基因突變導致的抗生素耐藥（例如銅綠假單胞菌的 oprD 耐藥突變）的精確度還難以保證[22]。常用的抗生素耐藥數據庫主要有 Resfinder[28]、CARD[29]和 ARG-ANNOT[30]。因此，對于臨床宏基因組學獲得的病原微生物抗生素耐藥基因，一方面需要結合患者具體的臨床信息，另一方面需要結合抗生素耐藥基因類型進行綜合判斷，以期協助制定最合理的抗生素應用方案。
4.3 臨床宏基因組學診斷的敏感性及特異性如何？
相對于傳統的微生物培養技術，臨床宏基因組學在呼吸道樣本微生物診斷的特異性高達 99.8%～100%；即使在腦脊液樣本中，臨床宏基因組學的微生物診斷敏感性和特異性也分別高達 84.3% 和 93.7%[10]。雖然臨床宏基因組學診斷的敏感性和特異性高，但是獲得的微生物是否為致病微生物亦需要結合患者的臨床特征進行綜合分析。因此，運用臨床宏基因組學動態監測呼吸道微生物變化可能是確診真實致病菌的有效手段之一。
4.4 臨床宏基因組學如何區分測得微生物是致病、定植還是污染？
臨床宏基因組學在同一個樣本中可獲得數百種細菌、病毒、真菌及寄生蟲等[17]。獲得微生物測序結果后，首先面對的問題是如何區分所明確的微生物是致病、定植還是污染。結合目前的相關研究，我們認為：一方面，臨床宏基因組學能夠獲得各個微生物的豐度信息，隨著生物信息學分析技術的發展，結合測序數據與傳統培養的集落形成單位，能夠進一步促進微生物的定量檢測[31]，由此可以明確各個微生物含量多少，可作為區分致病、定植還是污染的依據之一[16]；另一方面，結合宿主的免疫組學檢測可區分微生物是感染還是定植[32]，即使免疫力低下患者，宿主的免疫變化也是判定微生物定植與感染的標志之一[16]。因此，作為臨床宏基因組學臨床應用的最大難題之一，上述判斷方法是目前臨床宏基因組學判斷測得微生物是致病、定植還是污染的主要方法，而更精確有效的判斷方法需要更深一步的研究證實。
4.5 臨床宏基因組學的應用平臺有哪些？
臨床宏基因組學目前主要是基于 150～300 bp 的短片段 illumina 測序平臺[22, 33-34]，Life 公司的 SOLiD 5500 平臺[17]及華大基因的 BGISEQ-100 平臺[35]也有部分應用。近期，也有少部分研究是基于 Pacific Biosciences[36]和 Oxford Nanopore 長片段測序平臺[37]。
4.6 臨床宏基因組學如何降低宿主 DNA 對于微生物 DNA 的影響？
在痰液、肺泡灌洗液等呼吸道樣本中，95% 的 DNA 源自宿主，是影響微生物檢測的重要因素[38]，因此盡可能多的去除宿主 DNA 是提高微生物檢測靈敏度及精確診斷的重要策略之一。目前臨床宏基因組學的臨床應用中已經有相應的去宿主 DNA 試劑盒（Mo1Ysis Basic kit）[26]和去宿主 DNA 相關實驗流程[38]，也有相應的微生物富集生物信息學方案[39]。
4.7 臨床宏基因組學如何處理操作污染？
臨床宏基因組學所獲得的測序數據中只有<5% 的微生物序列[38]。因此，實驗試劑、耗材、取樣、運輸及 DNA 提取過程中任何操作都可能帶來相應的微生物污染[40-41]。因此，應合理設置陰性對照組以提高微生物精確診斷[40]。臨床醫生也應該和樣品取樣人員、樣品處理人員及生物信息分析人員全面分析測序結果。
4.8 臨床宏基因組學是否有標準的檢測流程及質控標準？
目前臨床宏基因組學雖然已經應用于臨床，但是還沒有大規模的相關研究證實其一線應用的可靠性和經濟、社會價值；而且目前臨床宏基因組學樣本實驗室處理的試劑耗材各異，測序平臺不一，生物信息分析對照數據庫也不同，因此亟需大規模多中心臨床試驗制定統一的質控標準及檢測流程[6]。
5 結論與展望
臨床宏基因組學是實現呼吸感染性疾病精準診療的基礎及關鍵技術之一，雖然 2018 年版指南已推薦臨床宏基因組學可用于臨床診斷，由于缺乏統一完善的檢測流程和質控標準，臨床宏基因組學還不能全面應用于臨床，目前需要結合傳統感染診療方法及患者臨床信息進行綜合應用。隨著免疫組學、微生物代謝組學、微生物蛋白組學及微生物轉錄組學的聯合應用，呼吸感染性疾病的診療已經進入了精準醫學時代[23]，未來臨床宏基因組學將在以下兩個方面獲得重要突破：（1）實現病原菌在 12 h 內確診，并同時獲得相關致病菌耐藥信息；（2）通過患者免疫反應監測明確微生物定植或者感染。從而最終遏制細菌耐藥，實現抗生素合理應用，最終降低感染性疾病的經濟及社會負擔。
