引用本文： 龍淑珍, 甘羅曼, 黎雨, 柳廣南. 血晶素對間歇性低氧大鼠作用的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(1): 31-36. doi: 10.7507/1671-6205.201804044 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是一種常見病。OSAHS 是高血壓病的病因之一，也是難治性高血壓的主要原因，與高血壓具有很強的相關性[1-3]。目前認為 OSAHS 導致血壓升高主要與交感神經興奮性升高、血管活性物質分泌異常、化學反射敏感性增強、壓力感受器反射異常、腎素-血管緊張素-醛固酮系統、胰島素抵抗導致高胰島素分泌及血管重塑等多方面因素有關[4-5]。OSAHS 的治療手段主要為手術及佩戴無創呼吸機，但外科手術由于有創性、手術成功率不高及遠期療效不理想而不易被患者接受。無創通氣在消除 OSAHS 癥狀、降低并發癥及死亡率等方面的治療效果較為肯定[6-8]，但其長期治療的依從性較差。因此，能否有一種簡便、依從性好的治療途徑來有效控制 OSAHS 所致的高血壓，比如利用血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）/一氧化碳（carbon monoxide，CO）體系的降壓作用，值得我們深入研究。CO 是一種重要的血管舒張因子，其生理作用與一氧化氮（nitric oxide，NO）相當。內源性 CO 主要來自血紅素加氧酶分解血紅素所產生。血晶素也稱氯化血紅素，是 HO-1 的特異性激動劑，可誘導機體內 HO-1/CO 體系表達上調，通過舒張血管平滑肌、調節血管張力及抑制平滑肌細胞增殖等機制降低血壓[9-10]。本研究通過建立 OSAHS 動物模型，研究血晶素對間歇性低氧大鼠體內 HO-1 及 CO 生成的影響及對大鼠血壓的調節作用。
1 材料與方法
1.1 主要儀器和試劑
血晶素（美國 Sigma 公司），有機玻璃箱（自制，體積 20 L），電磁閥及減壓閥，氧濃度監測儀（YHL，中國航天科技集團公司 703 研究所），多通道 PCR 擴增儀（PTC-20，美國 MJ 公司），電泳儀（Power/Pac300，美國 Bio-Rad 公司），病理圖像分析儀（DMR-Q550，德國 LEICA 公司），半干式轉膜儀（170－3940，美國 Bio-Rad 公司），PCR 擴增儀（MJPT-220，美國），凝膠成像分析系統（美國 Bio-Rad 公司），逆轉錄試劑盒（美國 Promega），PCR 合成試劑盒（上海生工），TRIzol 試劑（美國 GibcoBRL），DNA Ladder（美國 GibcoBRL），一抗（武漢博士德），二抗 SP 檢測試劑盒（北京中山生物工程有限公司），二氨基聯苯胺（福建邁新），SD 大鼠（廣西醫科大學實驗動物中心），氮氣（廣西醫科大學實驗動物中心）。
1.2 方法
1.2.1 建立動物模型
雄性 SD 大鼠 24 只，鼠齡 10～12 周，體重 250～300 g。隨機分為三組（每組 8 例）：即血晶素組、間歇低氧組和正常組。血晶素組大鼠接受每天早晨腹腔內注射血晶素（用量為 15 mg·kg–1·d–1），30 min 后置于密閉有機玻璃箱中，每 30 s 交替向箱內充入氮氣和壓縮空氣，用氧監測儀連續監測箱內氧濃度，箱內氧濃度波動于 7%～21%，每天間歇性低氧 8 h。間歇低氧組大鼠接受每天早晨腹腔內注射生理鹽水，30 min 后置于另一相同條件玻璃箱中，每天間歇性低氧 8 h（控制條件同血晶素組）。正常組大鼠每天早晨向腹腔內注射生理鹽水后置于玻璃箱中正常通氣。模型制備時間為 35 d[11-13]。三組大鼠的飼養條件相同。
1.2.2 測定頸總動脈壓及留取標本
建模成功后，用 20% 烏拉坦（7 mg/kg）腹腔麻醉動物，仰臥固定后行頸正中切口進行氣管插管，分離左頸動脈以連接 YL-3 型壓力傳感器通過 SJ-42 型四道生理記錄儀測頸總動脈壓。測壓完畢后經頸動脈采血，然后處死大鼠。分離動脈血血漿，置于–70 ℃ 保存待測；取肝、脾、肺、腎用 4% 多聚甲醛液固定后，備做石蠟切片作免疫組織化學檢測用；部分組織立即放入液氮中冷凍后移存于–70 ℃ 冰箱待用。
1.2.3 測定動脈血 CO 含量
采用 Chalmers[14]介紹的連二亞硫酸鈉還原法測定實驗動物的動脈血中 CO 含量。
1.2.4 相關臟器 HO-1 的免疫組織化學檢測（SP 法）
對肝、脾、肺、腎進行 HO-1 免疫組織化學檢測。組織切片中細胞質內含棕黃色至棕褐色顆粒為陽性細胞，無棕色顆粒為陰性細胞。在 400 倍光鏡下每張切片隨機選擇 10 個視野，采用病理圖像分析系統對免疫組織化學染色深度進行定量測定，分別測量胞質顯色陽性區灰度值和背景灰度值，得各組各例胞質陽性區平均灰度（Gα）和背景平均灰度（Gβ），計算出 HO-1 蛋白的陽性單位（positive unit，PU）值[15]。PU=100︱Gα–Gβ︱/256。以 PU 反映 HO-1 陽性表達染色深度。同時以圖像分析系統計算陽性表達面積占視野面積的百分比，即陽性表達率=（陽性表達面積/視野面積）×100%。
1.2.5 相關臟器 HO-1 mRNA 表達
采用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測 HO-1 mRNA 表達。對肝、脾、肺、腎組織提取 RNA，合成 cDNA 后進行 PCR 擴增 HO-1 和 β-肌動蛋白（β-actin），取 PCR 產物進行電泳，使用紫外儀觀察電泳帶，并用 HPIAS-1000 圖像分析系統測定每一個目的基因 HO-1 及看家基因 β-actin 的光密度值，結果以 HO-1/β-actin 的平均光密度值比值表示。
1.3 統計學方法
以 SPSS 18.0 統計學軟件建立試驗數據庫后再進行分析，計量資料用均數±標準差（
±s）表示，多個樣本均數間的兩兩比較采用 SNK-q 檢驗，并對變量進行相關與回歸分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 平均頸總動脈壓
血晶素組、間歇低氧組、正常組大鼠平均頸總動脈壓（mean carotid artery pressure，mCAP）分別為（159.00±4.63）、（195.50±15.36）、（132.50±9.02）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。將各組大鼠 mCAP 進行兩兩比較，結果顯示間歇低氧組 mCAP 高于血晶素組（P=0.001）和正常組（P=0.000），血晶素組 mCAP 介于間歇低氧組與正常組之間（P=0.000）。
2.2 血漿 CO 含量
血晶素組、間歇低氧組、正常組大鼠血漿 CO 含量分別為（3.986±0.164）、（1.529±0.236）、（1.381±0.126）mg/L。將各組血漿 CO 含量進行兩兩比較，結果顯示血晶素組血漿 CO 含量高于間歇低氧組（P=0.000）、正常組（P=0.000），間歇低氧組與正常組差異無統計學意義（P=0.801）。
2.3 臟器 HO-1 免疫組織化學檢測結果
將各組肺臟、肝臟、脾臟、腎小球及腎小管的 HO-1 的 PU 值及陽性表達率進行兩兩比較。結果顯示血晶素組臟器 HO-1 的 PU 值及陽性表達率高于間歇低氧組和正常組，間歇低氧組高于正常組。結果見表 1 及圖 1～5。
表1
各組大鼠不同臟器 HO-1 免疫組織化學檢測圖像定量分析結果（n=8，
）
圖1
大鼠肺臟 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：肺組織中基本無 HO-1 表達；b. 間歇低氧組：肺組織中肺泡間質毛細血管、細支氣管、部分肺泡上皮細胞及炎癥細胞均有 HO-1 表達；c. 血晶素組：肺組織中 HO-1 表達強度較間歇低氧組顯著增高
圖2
大鼠肝臟 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：肝臟組織中基本無 HO-1 表達；b. 間歇低氧組：肝竇內皮、匯管區小血管內皮細胞、部分肝細胞胞漿均有 HO-1 表達；c. 血晶素組：肝竇內皮、匯管區小血管內皮細胞、肝細胞胞漿中 HO-1 表達強度較間歇低氧組顯著增高
圖3
大鼠脾臟 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：脾臟組織中基本無 HO-1 表達；b. 間歇低氧組：脾臟紅髓、淋巴細胞中均有 HO-1 表達；c. 血晶素組：脾臟中 HO-1 表達強度較間歇低氧組顯著增高
圖4
大鼠腎小管 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：腎小管中無陽性細胞；b. 間歇低氧組：腎髓質的腎小管周圍間質可見 HO-1 陽性表達；c. 血晶素組：腎髓質的腎小管上皮細胞、腎小管周圍間質均有大量 HO-1 陽性表達，表達強度較間歇低氧組顯著增高
圖5
大鼠腎小球 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：腎小球中無陽性細胞；b. 間歇低氧組：腎小球內皮細胞、腎皮質腎小管周圍間質及部分血管內皮細胞可見 HO-1 陽性表達；c. 血晶素組：腎小球內皮細胞、腎小管上皮細胞及周圍間質均有大量 HO-1 陽性表達，表達強度較間歇低氧組顯著增高
2.4 臟器 HO-1 mRNA 的 RT-PCR 結果
將大鼠各組不同臟器 HO-1/β-actin 的平均光密度值進行兩兩比較，結果顯示血晶素組高于間歇低氧組（P=0.000）及正常組（P=0.000），間歇低氧組高于正常組（P=0.001）。結果見表 2 及圖 6。
表2
各組大鼠不同臟器 HO-1/β-actin 的平均光密度（n=8，
）
圖6
各組大鼠不同臟器 HO-1 mRNA 的 RT-PCR 產物電泳圖
M：100～1 200 bp DNA ladder marker；1～4：血晶素組肝、脾、肺、腎；5～8：間歇低氧組肝、脾、肺、腎；9～12：正常組肝、脾、肺、腎
2.5 變量相關與回歸分析
以 24 例大鼠 mCAP 與血漿 CO 含量數據作散點圖，顯示兩個變量之間無直線相關關系，亦無曲線趨勢。以 mCAP 與 HO-1 mRNA 數據作散點圖，顯示兩個變量之間呈曲線趨勢。從曲線擬合結果來看，二次方曲線的擬合優度高于對數方程。二次方曲線擬合方程為 Y=39.715+446.640X-334.353X2。對 mCAP 與 HO-1 mRNA 進行曲線擬合的結果見表 3 及圖 7。
表3
mCAP 與 HO-1 mRNA 曲線擬合結果
圖7
大鼠臟器 HO-1 mRNA 與 mCAP 的曲線擬合模型圖
3 討論
慢性缺氧可誘導大鼠相關臟器的 HO-1 mRNA 應激性表達增加，因此血晶素組及間歇低氧組大鼠的 HO-1 mRNA 均高于正常組。由于使用了 HO-1 激動劑，血晶素組的 HO-1 及血漿 CO 含量均明顯高于間歇低氧組及正常組。值得注意的是，間歇低氧組的 HO-1 mRNA 雖然高于正常組，但其血漿 CO 含量與正常組差異卻無統計學意義。分析原因可能為：HO 有 HO-1、HO-2 和 HO-3 三種同工酶，HO-1 為誘導型，HO-2 和 HO-3 均為結構型。慢性缺氧雖可誘導 HO-1 表達上調使血漿中 CO 增加，但 HO-1 代償性表達上調是有限的。同時，慢性缺氧可損傷內皮細胞，導致 HO-2 的表達下調和活性下降甚至失活。HO-1 和 HO-2 兩種同工酶活性一增一減，低氧狀態下機體產生大量超氧化物及自由基也使部分 CO 被消耗，因此間歇低氧組血漿 CO 含量并無明顯增加。
OSAHS 患者睡眠過程中反復上氣道塌陷所導致的間歇性低氧和低通氣是引起患者血壓升高的原因，通過經鼻持續氣道正壓通氣治療后可使血壓下降。本研究通過建立間歇性低氧大鼠模型來模擬 OSAHS 患者，證實了低氧可導致間歇低氧組及血晶素組大鼠血壓高于正常組。大鼠體內 HO-1 及 CO 水平及對大鼠血壓具有調節作用。間歇低氧組大鼠臟器的 HO-1 mRNA 表達量高于正常組，但其動脈血 CO 含量卻無顯著增加，對血壓的調節作用有限。此外，慢性缺氧還可導致血管內皮細胞受損，內皮細胞分泌血管活性物質異常，周圍阻力小動脈平滑肌管型肥厚、管腔狹窄，肥厚的平滑肌細胞對縮血管因素的反應性增高。以上因素均可導致血壓顯著升高，因此間歇低氧組的 mCAP 是三組大鼠中最高的。有研究表明，誘導 HO-1 的生成可使自發性高血壓大鼠血壓降低，HO-1 抑制劑則會使正常大鼠體循環血壓增高[16-18]。本研究證實，對間歇性低氧大鼠腹腔注射 HO-1 特異性激動劑血晶素，可使血晶素組大鼠相關臟器的 HO-1 及血漿 CO 含量表達上調，血壓有一定程度下降，但仍高于正常組。分析原因如下：人體內使血管收縮的因素主要是交感神經系統、血管緊張素-醛固酮系統以及內皮細胞系統所合成分泌的內皮素等收縮血管活性物質，使血管舒張的因子主要是內皮系統合成的 CO 和 NO。正常生理條件下，血管狀態的調節主要依賴于 NO，低氧狀態時，NO 在內皮中的產生受到影響，CO 則成為內皮細胞和血管平滑肌細胞中基因表達和環鳥苷酸水平的重要調節物。因此，缺氧時主要是 CO 起著緩慢而持久的舒張平滑肌、擴張血管的作用[10]。血晶素可誘導間歇低氧大鼠體內 HO-1 及 CO 表達增加，血漿中大量的 CO 可通過舒張血管平滑肌、調節血管張力及抑制平滑肌細胞增殖發揮降壓作用，但間歇低氧亦可使交感神經系統興奮性增高，縮血管物質表達水平升高（長期作用可導致慢性血管平滑肌增生肥厚）、壓力感受器閾值上調、腎素-血管緊張素-醛固酮系統的興奮性增高等，以上因素均可對抗 HO-1/CO 體系的降壓作用。因此，實驗動物的血壓水平取決于這兩方面因素之間的抗衡結果。血晶素誘導血漿 CO 水平上升的確有降壓作用，但這單一的舒張血管因素并不能完全抵消眾多縮血管因素的升壓作用，因此血晶素組大鼠的血壓未能降至正常水平。血晶素的使用劑量及持續使用時間也可能是影響實驗動物血壓的重要因素。
本研究還存在不足之處。分析對比各組臟器的 HO-1 mRNA 采用的 RT-PCR 屬于半定量方法，其準確性及重復性不夠理想。若采用實時熒光 PCR 或數字 PCR 進行定量分析，可提高實驗的精確度及敏感性。
綜上所述，血晶素可使間歇性低氧大鼠的 HO-1 及血漿 CO 水平上調，可在一定程度上降低間歇性低氧大鼠的血壓水平。對實驗對象增加血晶素的用量或者延長其使用時間能否獲得更好的降壓效果，值得進一步研究探討。
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是一種常見病。OSAHS 是高血壓病的病因之一，也是難治性高血壓的主要原因，與高血壓具有很強的相關性[1-3]。目前認為 OSAHS 導致血壓升高主要與交感神經興奮性升高、血管活性物質分泌異常、化學反射敏感性增強、壓力感受器反射異常、腎素-血管緊張素-醛固酮系統、胰島素抵抗導致高胰島素分泌及血管重塑等多方面因素有關[4-5]。OSAHS 的治療手段主要為手術及佩戴無創呼吸機，但外科手術由于有創性、手術成功率不高及遠期療效不理想而不易被患者接受。無創通氣在消除 OSAHS 癥狀、降低并發癥及死亡率等方面的治療效果較為肯定[6-8]，但其長期治療的依從性較差。因此，能否有一種簡便、依從性好的治療途徑來有效控制 OSAHS 所致的高血壓，比如利用血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）/一氧化碳（carbon monoxide，CO）體系的降壓作用，值得我們深入研究。CO 是一種重要的血管舒張因子，其生理作用與一氧化氮（nitric oxide，NO）相當。內源性 CO 主要來自血紅素加氧酶分解血紅素所產生。血晶素也稱氯化血紅素，是 HO-1 的特異性激動劑，可誘導機體內 HO-1/CO 體系表達上調，通過舒張血管平滑肌、調節血管張力及抑制平滑肌細胞增殖等機制降低血壓[9-10]。本研究通過建立 OSAHS 動物模型，研究血晶素對間歇性低氧大鼠體內 HO-1 及 CO 生成的影響及對大鼠血壓的調節作用。
1 材料與方法
1.1 主要儀器和試劑
血晶素（美國 Sigma 公司），有機玻璃箱（自制，體積 20 L），電磁閥及減壓閥，氧濃度監測儀（YHL，中國航天科技集團公司 703 研究所），多通道 PCR 擴增儀（PTC-20，美國 MJ 公司），電泳儀（Power/Pac300，美國 Bio-Rad 公司），病理圖像分析儀（DMR-Q550，德國 LEICA 公司），半干式轉膜儀（170－3940，美國 Bio-Rad 公司），PCR 擴增儀（MJPT-220，美國），凝膠成像分析系統（美國 Bio-Rad 公司），逆轉錄試劑盒（美國 Promega），PCR 合成試劑盒（上海生工），TRIzol 試劑（美國 GibcoBRL），DNA Ladder（美國 GibcoBRL），一抗（武漢博士德），二抗 SP 檢測試劑盒（北京中山生物工程有限公司），二氨基聯苯胺（福建邁新），SD 大鼠（廣西醫科大學實驗動物中心），氮氣（廣西醫科大學實驗動物中心）。
1.2 方法
1.2.1 建立動物模型
雄性 SD 大鼠 24 只，鼠齡 10～12 周，體重 250～300 g。隨機分為三組（每組 8 例）：即血晶素組、間歇低氧組和正常組。血晶素組大鼠接受每天早晨腹腔內注射血晶素（用量為 15 mg·kg–1·d–1），30 min 后置于密閉有機玻璃箱中，每 30 s 交替向箱內充入氮氣和壓縮空氣，用氧監測儀連續監測箱內氧濃度，箱內氧濃度波動于 7%～21%，每天間歇性低氧 8 h。間歇低氧組大鼠接受每天早晨腹腔內注射生理鹽水，30 min 后置于另一相同條件玻璃箱中，每天間歇性低氧 8 h（控制條件同血晶素組）。正常組大鼠每天早晨向腹腔內注射生理鹽水后置于玻璃箱中正常通氣。模型制備時間為 35 d[11-13]。三組大鼠的飼養條件相同。
1.2.2 測定頸總動脈壓及留取標本
建模成功后，用 20% 烏拉坦（7 mg/kg）腹腔麻醉動物，仰臥固定后行頸正中切口進行氣管插管，分離左頸動脈以連接 YL-3 型壓力傳感器通過 SJ-42 型四道生理記錄儀測頸總動脈壓。測壓完畢后經頸動脈采血，然后處死大鼠。分離動脈血血漿，置于–70 ℃ 保存待測；取肝、脾、肺、腎用 4% 多聚甲醛液固定后，備做石蠟切片作免疫組織化學檢測用；部分組織立即放入液氮中冷凍后移存于–70 ℃ 冰箱待用。
1.2.3 測定動脈血 CO 含量
采用 Chalmers[14]介紹的連二亞硫酸鈉還原法測定實驗動物的動脈血中 CO 含量。
1.2.4 相關臟器 HO-1 的免疫組織化學檢測（SP 法）
對肝、脾、肺、腎進行 HO-1 免疫組織化學檢測。組織切片中細胞質內含棕黃色至棕褐色顆粒為陽性細胞，無棕色顆粒為陰性細胞。在 400 倍光鏡下每張切片隨機選擇 10 個視野，采用病理圖像分析系統對免疫組織化學染色深度進行定量測定，分別測量胞質顯色陽性區灰度值和背景灰度值，得各組各例胞質陽性區平均灰度（Gα）和背景平均灰度（Gβ），計算出 HO-1 蛋白的陽性單位（positive unit，PU）值[15]。PU=100︱Gα–Gβ︱/256。以 PU 反映 HO-1 陽性表達染色深度。同時以圖像分析系統計算陽性表達面積占視野面積的百分比，即陽性表達率=（陽性表達面積/視野面積）×100%。
1.2.5 相關臟器 HO-1 mRNA 表達
采用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測 HO-1 mRNA 表達。對肝、脾、肺、腎組織提取 RNA，合成 cDNA 后進行 PCR 擴增 HO-1 和 β-肌動蛋白（β-actin），取 PCR 產物進行電泳，使用紫外儀觀察電泳帶，并用 HPIAS-1000 圖像分析系統測定每一個目的基因 HO-1 及看家基因 β-actin 的光密度值，結果以 HO-1/β-actin 的平均光密度值比值表示。
1.3 統計學方法
以 SPSS 18.0 統計學軟件建立試驗數據庫后再進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多個樣本均數間的兩兩比較采用 SNK-q 檢驗，并對變量進行相關與回歸分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 平均頸總動脈壓
血晶素組、間歇低氧組、正常組大鼠平均頸總動脈壓（mean carotid artery pressure，mCAP）分別為（159.00±4.63）、（195.50±15.36）、（132.50±9.02）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。將各組大鼠 mCAP 進行兩兩比較，結果顯示間歇低氧組 mCAP 高于血晶素組（P=0.001）和正常組（P=0.000），血晶素組 mCAP 介于間歇低氧組與正常組之間（P=0.000）。
2.2 血漿 CO 含量
血晶素組、間歇低氧組、正常組大鼠血漿 CO 含量分別為（3.986±0.164）、（1.529±0.236）、（1.381±0.126）mg/L。將各組血漿 CO 含量進行兩兩比較，結果顯示血晶素組血漿 CO 含量高于間歇低氧組（P=0.000）、正常組（P=0.000），間歇低氧組與正常組差異無統計學意義（P=0.801）。
2.3 臟器 HO-1 免疫組織化學檢測結果
將各組肺臟、肝臟、脾臟、腎小球及腎小管的 HO-1 的 PU 值及陽性表達率進行兩兩比較。結果顯示血晶素組臟器 HO-1 的 PU 值及陽性表達率高于間歇低氧組和正常組，間歇低氧組高于正常組。結果見表 1 及圖 1～5。
表1
各組大鼠不同臟器 HO-1 免疫組織化學檢測圖像定量分析結果（n=8，）
圖1
大鼠肺臟 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：肺組織中基本無 HO-1 表達；b. 間歇低氧組：肺組織中肺泡間質毛細血管、細支氣管、部分肺泡上皮細胞及炎癥細胞均有 HO-1 表達；c. 血晶素組：肺組織中 HO-1 表達強度較間歇低氧組顯著增高
圖2
大鼠肝臟 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：肝臟組織中基本無 HO-1 表達；b. 間歇低氧組：肝竇內皮、匯管區小血管內皮細胞、部分肝細胞胞漿均有 HO-1 表達；c. 血晶素組：肝竇內皮、匯管區小血管內皮細胞、肝細胞胞漿中 HO-1 表達強度較間歇低氧組顯著增高
圖3
大鼠脾臟 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：脾臟組織中基本無 HO-1 表達；b. 間歇低氧組：脾臟紅髓、淋巴細胞中均有 HO-1 表達；c. 血晶素組：脾臟中 HO-1 表達強度較間歇低氧組顯著增高
圖4
大鼠腎小管 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：腎小管中無陽性細胞；b. 間歇低氧組：腎髓質的腎小管周圍間質可見 HO-1 陽性表達；c. 血晶素組：腎髓質的腎小管上皮細胞、腎小管周圍間質均有大量 HO-1 陽性表達，表達強度較間歇低氧組顯著增高
圖5
大鼠腎小球 HO-1 表達病理檢測像（SP×400）
a. 正常組：腎小球中無陽性細胞；b. 間歇低氧組：腎小球內皮細胞、腎皮質腎小管周圍間質及部分血管內皮細胞可見 HO-1 陽性表達；c. 血晶素組：腎小球內皮細胞、腎小管上皮細胞及周圍間質均有大量 HO-1 陽性表達，表達強度較間歇低氧組顯著增高
2.4 臟器 HO-1 mRNA 的 RT-PCR 結果
將大鼠各組不同臟器 HO-1/β-actin 的平均光密度值進行兩兩比較，結果顯示血晶素組高于間歇低氧組（P=0.000）及正常組（P=0.000），間歇低氧組高于正常組（P=0.001）。結果見表 2 及圖 6。
表2
各組大鼠不同臟器 HO-1/β-actin 的平均光密度（n=8，）
圖6
各組大鼠不同臟器 HO-1 mRNA 的 RT-PCR 產物電泳圖
M：100～1 200 bp DNA ladder marker；1～4：血晶素組肝、脾、肺、腎；5～8：間歇低氧組肝、脾、肺、腎；9～12：正常組肝、脾、肺、腎
2.5 變量相關與回歸分析
以 24 例大鼠 mCAP 與血漿 CO 含量數據作散點圖，顯示兩個變量之間無直線相關關系，亦無曲線趨勢。以 mCAP 與 HO-1 mRNA 數據作散點圖，顯示兩個變量之間呈曲線趨勢。從曲線擬合結果來看，二次方曲線的擬合優度高于對數方程。二次方曲線擬合方程為 Y=39.715+446.640X-334.353X2。對 mCAP 與 HO-1 mRNA 進行曲線擬合的結果見表 3 及圖 7。
表3
mCAP 與 HO-1 mRNA 曲線擬合結果
圖7
大鼠臟器 HO-1 mRNA 與 mCAP 的曲線擬合模型圖
3 討論
慢性缺氧可誘導大鼠相關臟器的 HO-1 mRNA 應激性表達增加，因此血晶素組及間歇低氧組大鼠的 HO-1 mRNA 均高于正常組。由于使用了 HO-1 激動劑，血晶素組的 HO-1 及血漿 CO 含量均明顯高于間歇低氧組及正常組。值得注意的是，間歇低氧組的 HO-1 mRNA 雖然高于正常組，但其血漿 CO 含量與正常組差異卻無統計學意義。分析原因可能為：HO 有 HO-1、HO-2 和 HO-3 三種同工酶，HO-1 為誘導型，HO-2 和 HO-3 均為結構型。慢性缺氧雖可誘導 HO-1 表達上調使血漿中 CO 增加，但 HO-1 代償性表達上調是有限的。同時，慢性缺氧可損傷內皮細胞，導致 HO-2 的表達下調和活性下降甚至失活。HO-1 和 HO-2 兩種同工酶活性一增一減，低氧狀態下機體產生大量超氧化物及自由基也使部分 CO 被消耗，因此間歇低氧組血漿 CO 含量并無明顯增加。
OSAHS 患者睡眠過程中反復上氣道塌陷所導致的間歇性低氧和低通氣是引起患者血壓升高的原因，通過經鼻持續氣道正壓通氣治療后可使血壓下降。本研究通過建立間歇性低氧大鼠模型來模擬 OSAHS 患者，證實了低氧可導致間歇低氧組及血晶素組大鼠血壓高于正常組。大鼠體內 HO-1 及 CO 水平及對大鼠血壓具有調節作用。間歇低氧組大鼠臟器的 HO-1 mRNA 表達量高于正常組，但其動脈血 CO 含量卻無顯著增加，對血壓的調節作用有限。此外，慢性缺氧還可導致血管內皮細胞受損，內皮細胞分泌血管活性物質異常，周圍阻力小動脈平滑肌管型肥厚、管腔狹窄，肥厚的平滑肌細胞對縮血管因素的反應性增高。以上因素均可導致血壓顯著升高，因此間歇低氧組的 mCAP 是三組大鼠中最高的。有研究表明，誘導 HO-1 的生成可使自發性高血壓大鼠血壓降低，HO-1 抑制劑則會使正常大鼠體循環血壓增高[16-18]。本研究證實，對間歇性低氧大鼠腹腔注射 HO-1 特異性激動劑血晶素，可使血晶素組大鼠相關臟器的 HO-1 及血漿 CO 含量表達上調，血壓有一定程度下降，但仍高于正常組。分析原因如下：人體內使血管收縮的因素主要是交感神經系統、血管緊張素-醛固酮系統以及內皮細胞系統所合成分泌的內皮素等收縮血管活性物質，使血管舒張的因子主要是內皮系統合成的 CO 和 NO。正常生理條件下，血管狀態的調節主要依賴于 NO，低氧狀態時，NO 在內皮中的產生受到影響，CO 則成為內皮細胞和血管平滑肌細胞中基因表達和環鳥苷酸水平的重要調節物。因此，缺氧時主要是 CO 起著緩慢而持久的舒張平滑肌、擴張血管的作用[10]。血晶素可誘導間歇低氧大鼠體內 HO-1 及 CO 表達增加，血漿中大量的 CO 可通過舒張血管平滑肌、調節血管張力及抑制平滑肌細胞增殖發揮降壓作用，但間歇低氧亦可使交感神經系統興奮性增高，縮血管物質表達水平升高（長期作用可導致慢性血管平滑肌增生肥厚）、壓力感受器閾值上調、腎素-血管緊張素-醛固酮系統的興奮性增高等，以上因素均可對抗 HO-1/CO 體系的降壓作用。因此，實驗動物的血壓水平取決于這兩方面因素之間的抗衡結果。血晶素誘導血漿 CO 水平上升的確有降壓作用，但這單一的舒張血管因素并不能完全抵消眾多縮血管因素的升壓作用，因此血晶素組大鼠的血壓未能降至正常水平。血晶素的使用劑量及持續使用時間也可能是影響實驗動物血壓的重要因素。
本研究還存在不足之處。分析對比各組臟器的 HO-1 mRNA 采用的 RT-PCR 屬于半定量方法，其準確性及重復性不夠理想。若采用實時熒光 PCR 或數字 PCR 進行定量分析，可提高實驗的精確度及敏感性。
綜上所述，血晶素可使間歇性低氧大鼠的 HO-1 及血漿 CO 水平上調，可在一定程度上降低間歇性低氧大鼠的血壓水平。對實驗對象增加血晶素的用量或者延長其使用時間能否獲得更好的降壓效果，值得進一步研究探討。
