引用本文： 史瑩, 毛山. 慢性阻塞性肺疾病患者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 通道表達及功能的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(2): 120-123. doi: 10.7507/1671-6205.201802029 復制
近年來淋巴細胞在慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）氣道炎癥中的作用日益受到重視。T 淋巴細胞可通過釋放多種細胞因子參與炎癥反應，通過釋放穿孔素、顆粒酶引起肺泡上皮細胞的裂解和凋亡[1-2]。其功能與細胞膜上的 Kv1.3 鉀通道密切相關[3]。研究發現，激活狀態下，Kv1.3 通道在 T 細胞膜上表達的數量顯著上調，促進 T 淋巴細胞釋放多種細胞因子如白細胞介素（interleukin，IL）-2、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等，并促進 T 細胞激活和增殖[4-5]。我們推測慢阻肺患者的慢性氣道炎癥可能與外周血 T 淋巴細胞過表達 Kv1.3 通道有關。本研究擬通過檢測穩定期慢阻肺患者外周血 T 細胞活化時 Kv1.3 通道的表達，分析 Kv1.3 通道在慢阻肺患者 T 細胞活化中的作用，探討 Kv1.3 通道作為慢阻肺免疫治療靶點的可能性。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取 2016 年 1 月至 2016 年 6 月在南京市第一醫院首次就診且未經藥物治療的穩定期慢阻肺患者 50 例，體檢中心健康對照者 50 例，兩組在年齡，性別上匹配。慢阻肺納入標準參照中華醫學會呼吸病學分會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》（ 2013 年修訂版）的診斷標準[6]。排除標準：排除患哮喘、支氣管擴張、肺結核、支氣管肺癌等其他呼吸系統疾病者、肺栓塞、肺動脈高壓、肺間質性疾病和肺癌；依從性差者；妊娠或哺乳期女性；近期有喪失行為能力的精神疾病病史；2 周內有證據表明有呼吸道感染或相關癥狀（評估應延遲）。
1.2 材料和方法
1.2.1 材料
胎牛血清（杭州四季青公司），TRIzol（Invitrogen 公司，美國），羊抗兔二抗（Sigma 公司，美國），反轉錄試劑盒（Takara，大連），chemiluminescence reagents（Cell Signaling Technology 公司，美國），蛋白酶抑制劑，cocktail（Sigma 公司，美國），anti-GAPDH 抗 體（Abcam 公司，美國），Kv1.3 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國），HRP 標記的抗免 IgG 抗體（Santa Cruz Biotechnology 公司，美國）。β-actin 上游引物 5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物 5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，擴 增 片 段 為 150 bp。 Kv1.3 上游引物 5′-GGAAGCTCCGGGAACAAGTG-3′，下游引物 5′-TGCCAGCCCATGGATTCTC-3′，擴增片段為 121 bp。IL-2 上游引物 5′-GACACTTGTGCTCCTTGTCA-3′，下游引物 5′-TCAATTCTGTGGCCTGCTTG-3′，擴增片段 137 bp。CCK-8 試劑盒（碧云天公司，上海）。IL-2 酶聯免疫吸附試驗試劑盒（Abcam 公司，英國）。
1.2.2 分離人外周血 T 淋巴細胞
無菌采集外周靜脈血 5 ml，拘椽酸鈉抗凝，Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，之后應用免疫磁珠陰性分選法分離出 T 淋巴細胞，予以含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 完全培養液調整細胞濃度至 1×106/ml，接種于培養瓶。
1.2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 Kv1.3 表達
按 TRIzol 說明書操作步驟提取細胞 RNA，用紫外分光光度計分別測定樣品濃度，反轉錄的反應條件為 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，保存 cDNA 待做實時熒光定量 PCR 用。實時熒光定量 PCR 反應體系的反應條件為：95 ℃ 10 s 1 個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s 1 個循環。PCR 完成后產物行 2% 瓊脂糖凝膠電泳。結果分析使用相對的 ΔCT 表示：ΔCT 處理組=CT 處理組–CT 內參處理組，ΔCT 對照組=CT 對照組–CT 內參對照組，ΔΔCT=ΔCT 處理組–ΔCT 對照組，差別倍數=2–ΔΔCT。
1.2.4 Western blot 檢測 Kv1.3 通道的表達水平
提取細胞蛋白后，用 Bradford 法測蛋白濃度。在玻璃板夾槽中依次加入分離膠（凝固后）和濃縮膠，凝固后，根據濃度取適量待測蛋白加入上樣孔中；浸于 1×電泳緩沖液，4 ℃ 冷房冰浴中恒流（10～20 mA）電泳 1～3 h。然后準備 PVDF 膜和濾紙，制作三明治夾心，浸于 1×轉膜緩沖液，4 ℃ 冷房冰浴中恒壓（100 V）轉膜 1 h。PVDF 膜浸入 1×封閉液，加入一抗，4 ℃ 過夜。用 1×洗膜液洗膜 3 次，加入二抗室溫孵育 1 h，洗膜同前，加入 ECL 發光液，顯色 10 min。
1.2.5 CCK-8 法檢測 Kv1.3 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞增殖能力的影響
將 100 μl 細胞懸液接種于 96 孔培養板中，設空白孔，將細胞分為 CD3 單抗組和 ShK 組。CD3 單抗組僅加 CD3 單抗。ShK 組除加 CD3 單抗外，還加入不同濃度 Kv1.3 抑制劑 ShK。37 ℃ 培養 72 h 后，向每孔中加入 10 μl 的 CCK-8 溶液，37 ℃ 4 h，在酶標儀上于 450 nm 處測定吸光度 A 值。
1.2.6 實時熒光定量 PCR 檢測 Kv1.3 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞生成 IL-2 的影響
將 100 μl 細胞懸液接種于 24 孔培養板中，CD3 單抗處理后，分為對照組、佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）組和 ShK 組。PMA 組僅加 PMA，PMA 終濃度為 10 ng/ml。ShK 組除加 PMA 外，還加入不同濃度 Kv1.3 抑制劑 ShK。5 h 后提取 mRNA，用實時熒光定量 PCR 法檢測 IL-2 的表達。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 11.5 統計學軟件。計量資料采用均數±標準差（
±s）表示。使用單因素方差分析和 LSD 法（最小差異性檢驗）進行數據統計。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 慢阻肺患者與健康者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的 mRNA 表達的比較
實時熒光定量 PCR 結果顯示，慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的 mRNA 表達水平較健康者明顯增高，比值為（2.75±2.86），P<0.05。結果見圖 1。
圖1
慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的 mRNA 表達
*與對照組比較，
2.2 慢阻肺患者與健康者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的蛋白表達的比較
Western blot 結果顯示，慢阻肺組及對照組的 GAPDH 水平無明顯差別，而慢阻肺患者的外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的蛋白表達水平較健康者明顯增高。結果見圖 2。
圖2
慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的蛋白表達
2.3 Kv1.3 阻滯劑 ShK 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞增殖的影響
與 CD3 單抗組相比，25 μmol/L 的 ShK 對 T 淋巴細胞增殖的能力無影響，50 μmol/L 的 ShK 可使 T 淋巴細胞的增殖能力降低 20.6%，100 μmol/L 的 ShK 能將 T 淋巴細胞的增殖能力降低 40.3%。結果見圖 3。
圖3
Kv1.3 阻滯劑 ShK 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞增殖的影響
*與 CD3 單抗組比較，
2.4 Kv1.3 阻滯劑 ShK 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞產生 IL-2 的影響
與對照組相比，PMA 能明顯促進慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞產生 IL-2，ShK 能減少 PMA 導致的 T 淋巴細胞的 IL-2 產生，25 μmol/L、50 μmol/L 及 100 μmol/L 的 ShK 能使 IL-2 降低 26.5%、42.1% 及 65.8%。結果見圖 4。
圖4
Kv1.3 抑制劑 ShK 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞產生 IL-2 的影響
*與對照組比較，
3 討論
T 淋巴細胞在慢阻肺氣道炎癥的形成過程中起重要的作用，研究表明慢阻肺患者氣道壁浸潤的炎癥細胞主要是 T 淋巴細胞[7]。T 淋巴細胞通過細胞增殖分化及分泌細胞因子參與慢性氣道炎癥，而這種氣道炎癥是導致患者最終氣道結構改變（肺氣腫、肺大皰）的病理基礎。
T 淋巴細胞的功能活動與其細胞膜上離子通道的電活動密切相關。Kv1.3 鉀通道是效應性 T 淋巴細胞持續活化的關鍵，在其激活、遷移、增殖及細胞因子分泌中起重要作用[4, 8]。 在本研究中，我們發現慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞表達 Kv1.3 量較健康者明顯增加，提示慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞具有較強的增殖功能及較強的分泌細胞因子的作用。這種 T 淋巴細胞功能的增強都有可能促進慢阻肺患者慢性氣道炎癥的形成。
在受到抗原的刺激后，CD4+和 CD8+T 細胞會由初始 T 細胞增殖分化為 TCM 和 TEM 記憶性 T 細胞亞群，同時會伴隨著 T 細胞膜表面 Kv1.3 的變化[8]。Kv1.3 通道是 TEM 細胞活化的主要鉀離子通道，在活化期間表達明顯增高，從而促進了 T 細胞的增殖和分化。我們的研究發現 Kv1.3 抑制劑對慢阻肺穩定期患者 T 淋巴細胞增殖功能有明顯的抑制作用，提示阻斷 Kv1.3 可能減輕慢阻肺患者氣道內的 T 細胞浸潤狀況。
IL-2 是一種重要的細胞因子，在啟動慢阻肺患者氣道的細胞免疫中起重要作用。支氣管及肺泡中的巨噬細胞吞噬煙霧顆粒，在氣道黏膜固有層中刺激活化 T 細胞，T 細胞通過表達 Kv1.3 通道，進一步激活鈣調神經磷酸酶/活化 T 細胞核因子（calcineurin/NFAT）通路，NFAT 與 IL-2 啟動子結合，從而促進 IL-2 的表達。IL-2 能刺激 T 細胞進入細胞分裂周期，促進 T 細胞生長，增強 T 細胞的細胞毒作用[9]。我們的研究發現 Kv1.3 阻滯劑能抑制慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞產生 IL-2，提示阻斷 Kv1.3 可能改變慢阻肺患者的細胞免疫狀況，從而有潛在的減輕慢阻肺患者慢性氣道炎癥的作用。
目前的研究發現，鈣離子拮抗劑、大環內酯類、非甾體類抗炎藥、他汀類藥物均具有抑制 Kv1.3 鉀通道的作用[10-14]。鑒于 Kv1.3 鉀通道在調節 T 細胞功能中的重要作用，這些潛在的 Kv1.3 鉀通道阻滯劑有可能對抑制慢阻肺的慢性氣道炎癥有效，可能成為未來治療慢阻肺的新方向。
近年來淋巴細胞在慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）氣道炎癥中的作用日益受到重視。T 淋巴細胞可通過釋放多種細胞因子參與炎癥反應，通過釋放穿孔素、顆粒酶引起肺泡上皮細胞的裂解和凋亡[1-2]。其功能與細胞膜上的 Kv1.3 鉀通道密切相關[3]。研究發現，激活狀態下，Kv1.3 通道在 T 細胞膜上表達的數量顯著上調，促進 T 淋巴細胞釋放多種細胞因子如白細胞介素（interleukin，IL）-2、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等，并促進 T 細胞激活和增殖[4-5]。我們推測慢阻肺患者的慢性氣道炎癥可能與外周血 T 淋巴細胞過表達 Kv1.3 通道有關。本研究擬通過檢測穩定期慢阻肺患者外周血 T 細胞活化時 Kv1.3 通道的表達，分析 Kv1.3 通道在慢阻肺患者 T 細胞活化中的作用，探討 Kv1.3 通道作為慢阻肺免疫治療靶點的可能性。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取 2016 年 1 月至 2016 年 6 月在南京市第一醫院首次就診且未經藥物治療的穩定期慢阻肺患者 50 例，體檢中心健康對照者 50 例，兩組在年齡，性別上匹配。慢阻肺納入標準參照中華醫學會呼吸病學分會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》（ 2013 年修訂版）的診斷標準[6]。排除標準：排除患哮喘、支氣管擴張、肺結核、支氣管肺癌等其他呼吸系統疾病者、肺栓塞、肺動脈高壓、肺間質性疾病和肺癌；依從性差者；妊娠或哺乳期女性；近期有喪失行為能力的精神疾病病史；2 周內有證據表明有呼吸道感染或相關癥狀（評估應延遲）。
1.2 材料和方法
1.2.1 材料
胎牛血清（杭州四季青公司），TRIzol（Invitrogen 公司，美國），羊抗兔二抗（Sigma 公司，美國），反轉錄試劑盒（Takara，大連），chemiluminescence reagents（Cell Signaling Technology 公司，美國），蛋白酶抑制劑，cocktail（Sigma 公司，美國），anti-GAPDH 抗 體（Abcam 公司，美國），Kv1.3 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國），HRP 標記的抗免 IgG 抗體（Santa Cruz Biotechnology 公司，美國）。β-actin 上游引物 5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物 5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，擴 增 片 段 為 150 bp。 Kv1.3 上游引物 5′-GGAAGCTCCGGGAACAAGTG-3′，下游引物 5′-TGCCAGCCCATGGATTCTC-3′，擴增片段為 121 bp。IL-2 上游引物 5′-GACACTTGTGCTCCTTGTCA-3′，下游引物 5′-TCAATTCTGTGGCCTGCTTG-3′，擴增片段 137 bp。CCK-8 試劑盒（碧云天公司，上海）。IL-2 酶聯免疫吸附試驗試劑盒（Abcam 公司，英國）。
1.2.2 分離人外周血 T 淋巴細胞
無菌采集外周靜脈血 5 ml，拘椽酸鈉抗凝，Ficoll 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，之后應用免疫磁珠陰性分選法分離出 T 淋巴細胞，予以含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 完全培養液調整細胞濃度至 1×106/ml，接種于培養瓶。
1.2.3 實時熒光定量 PCR 檢測 Kv1.3 表達
按 TRIzol 說明書操作步驟提取細胞 RNA，用紫外分光光度計分別測定樣品濃度，反轉錄的反應條件為 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，保存 cDNA 待做實時熒光定量 PCR 用。實時熒光定量 PCR 反應體系的反應條件為：95 ℃ 10 s 1 個循環；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s 1 個循環。PCR 完成后產物行 2% 瓊脂糖凝膠電泳。結果分析使用相對的 ΔCT 表示：ΔCT 處理組=CT 處理組–CT 內參處理組，ΔCT 對照組=CT 對照組–CT 內參對照組，ΔΔCT=ΔCT 處理組–ΔCT 對照組，差別倍數=2–ΔΔCT。
1.2.4 Western blot 檢測 Kv1.3 通道的表達水平
提取細胞蛋白后，用 Bradford 法測蛋白濃度。在玻璃板夾槽中依次加入分離膠（凝固后）和濃縮膠，凝固后，根據濃度取適量待測蛋白加入上樣孔中；浸于 1×電泳緩沖液，4 ℃ 冷房冰浴中恒流（10～20 mA）電泳 1～3 h。然后準備 PVDF 膜和濾紙，制作三明治夾心，浸于 1×轉膜緩沖液，4 ℃ 冷房冰浴中恒壓（100 V）轉膜 1 h。PVDF 膜浸入 1×封閉液，加入一抗，4 ℃ 過夜。用 1×洗膜液洗膜 3 次，加入二抗室溫孵育 1 h，洗膜同前，加入 ECL 發光液，顯色 10 min。
1.2.5 CCK-8 法檢測 Kv1.3 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞增殖能力的影響
將 100 μl 細胞懸液接種于 96 孔培養板中，設空白孔，將細胞分為 CD3 單抗組和 ShK 組。CD3 單抗組僅加 CD3 單抗。ShK 組除加 CD3 單抗外，還加入不同濃度 Kv1.3 抑制劑 ShK。37 ℃ 培養 72 h 后，向每孔中加入 10 μl 的 CCK-8 溶液，37 ℃ 4 h，在酶標儀上于 450 nm 處測定吸光度 A 值。
1.2.6 實時熒光定量 PCR 檢測 Kv1.3 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞生成 IL-2 的影響
將 100 μl 細胞懸液接種于 24 孔培養板中，CD3 單抗處理后，分為對照組、佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）組和 ShK 組。PMA 組僅加 PMA，PMA 終濃度為 10 ng/ml。ShK 組除加 PMA 外，還加入不同濃度 Kv1.3 抑制劑 ShK。5 h 后提取 mRNA，用實時熒光定量 PCR 法檢測 IL-2 的表達。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 11.5 統計學軟件。計量資料采用均數±標準差（±s）表示。使用單因素方差分析和 LSD 法（最小差異性檢驗）進行數據統計。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 慢阻肺患者與健康者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的 mRNA 表達的比較
實時熒光定量 PCR 結果顯示，慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的 mRNA 表達水平較健康者明顯增高，比值為（2.75±2.86），P<0.05。結果見圖 1。
圖1
慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的 mRNA 表達
*與對照組比較，
2.2 慢阻肺患者與健康者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的蛋白表達的比較
Western blot 結果顯示，慢阻肺組及對照組的 GAPDH 水平無明顯差別，而慢阻肺患者的外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的蛋白表達水平較健康者明顯增高。結果見圖 2。
圖2
慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞 Kv1.3 的蛋白表達
2.3 Kv1.3 阻滯劑 ShK 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞增殖的影響
與 CD3 單抗組相比，25 μmol/L 的 ShK 對 T 淋巴細胞增殖的能力無影響，50 μmol/L 的 ShK 可使 T 淋巴細胞的增殖能力降低 20.6%，100 μmol/L 的 ShK 能將 T 淋巴細胞的增殖能力降低 40.3%。結果見圖 3。
圖3
Kv1.3 阻滯劑 ShK 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞增殖的影響
*與 CD3 單抗組比較，
2.4 Kv1.3 阻滯劑 ShK 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞產生 IL-2 的影響
與對照組相比，PMA 能明顯促進慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞產生 IL-2，ShK 能減少 PMA 導致的 T 淋巴細胞的 IL-2 產生，25 μmol/L、50 μmol/L 及 100 μmol/L 的 ShK 能使 IL-2 降低 26.5%、42.1% 及 65.8%。結果見圖 4。
圖4
Kv1.3 抑制劑 ShK 對慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞產生 IL-2 的影響
*與對照組比較，
3 討論
T 淋巴細胞在慢阻肺氣道炎癥的形成過程中起重要的作用，研究表明慢阻肺患者氣道壁浸潤的炎癥細胞主要是 T 淋巴細胞[7]。T 淋巴細胞通過細胞增殖分化及分泌細胞因子參與慢性氣道炎癥，而這種氣道炎癥是導致患者最終氣道結構改變（肺氣腫、肺大皰）的病理基礎。
T 淋巴細胞的功能活動與其細胞膜上離子通道的電活動密切相關。Kv1.3 鉀通道是效應性 T 淋巴細胞持續活化的關鍵，在其激活、遷移、增殖及細胞因子分泌中起重要作用[4, 8]。 在本研究中，我們發現慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞表達 Kv1.3 量較健康者明顯增加，提示慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞具有較強的增殖功能及較強的分泌細胞因子的作用。這種 T 淋巴細胞功能的增強都有可能促進慢阻肺患者慢性氣道炎癥的形成。
在受到抗原的刺激后，CD4+和 CD8+T 細胞會由初始 T 細胞增殖分化為 TCM 和 TEM 記憶性 T 細胞亞群，同時會伴隨著 T 細胞膜表面 Kv1.3 的變化[8]。Kv1.3 通道是 TEM 細胞活化的主要鉀離子通道，在活化期間表達明顯增高，從而促進了 T 細胞的增殖和分化。我們的研究發現 Kv1.3 抑制劑對慢阻肺穩定期患者 T 淋巴細胞增殖功能有明顯的抑制作用，提示阻斷 Kv1.3 可能減輕慢阻肺患者氣道內的 T 細胞浸潤狀況。
IL-2 是一種重要的細胞因子，在啟動慢阻肺患者氣道的細胞免疫中起重要作用。支氣管及肺泡中的巨噬細胞吞噬煙霧顆粒，在氣道黏膜固有層中刺激活化 T 細胞，T 細胞通過表達 Kv1.3 通道，進一步激活鈣調神經磷酸酶/活化 T 細胞核因子（calcineurin/NFAT）通路，NFAT 與 IL-2 啟動子結合，從而促進 IL-2 的表達。IL-2 能刺激 T 細胞進入細胞分裂周期，促進 T 細胞生長，增強 T 細胞的細胞毒作用[9]。我們的研究發現 Kv1.3 阻滯劑能抑制慢阻肺患者外周血 T 淋巴細胞產生 IL-2，提示阻斷 Kv1.3 可能改變慢阻肺患者的細胞免疫狀況，從而有潛在的減輕慢阻肺患者慢性氣道炎癥的作用。
目前的研究發現，鈣離子拮抗劑、大環內酯類、非甾體類抗炎藥、他汀類藥物均具有抑制 Kv1.3 鉀通道的作用[10-14]。鑒于 Kv1.3 鉀通道在調節 T 細胞功能中的重要作用，這些潛在的 Kv1.3 鉀通道阻滯劑有可能對抑制慢阻肺的慢性氣道炎癥有效，可能成為未來治療慢阻肺的新方向。
