引用本文： 王圓方, 林江濤. 糖皮質激素敏感性降低的分子機制研究進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(4): 426-429. doi: 10.7507/1671-6205.201801028 復制
糖皮質激素是機體內極為重要的一種類固醇激素，由下丘腦-垂體-腎上腺軸調控，在人體應激反應中起著重要作用；也是臨床常用的抗炎和免疫抑制劑，它在機體生長發育、新陳代謝、免疫調節以及炎癥反應等方面都起著重要的調節作用，臨床中通常用于治療炎癥疾病、自身免疫性疾病和癌癥[1]。糖皮質激素主要是通過結合糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）發揮后續作用，但對糖皮質激素反應的敏感性則因人而異，甚至在同一個體的不同組織中也不相同。
盡管糖皮質激素廣泛應用于臨床，但有相當一部分患者對于糖皮質激素反應性不佳，或者是在激素治療的過程中出現對糖皮質激素抵抗的現象。這部分患者往往具有高度的預后不良風險，這種風險既來自原發疾病本身，也來自長期大量使用糖皮質激素所帶來的不良反應。雖然這種糖皮質激素抵抗的患者人群所占比例較低，但是他們的就醫率和住院率卻常常遠超其他患者，占據了大量的醫療資源，加重了個人及社會的經濟負擔。因此，對糖皮質激素敏感性降低發生機制的研究具有十分重要的臨床價值。本文對目前糖皮質激素敏感性降低的分子機制的研究進展進行綜述。
1 GR 相關的分子機制
GR 編碼基因位于 5 號染色體上（5q31），由編碼蛋白質三個特征結構域的 9 個外顯子組成。N 端含有反式激活結構域（AF-1），涉及靶基因的轉錄激活[2]。由兩個高度保守的“鋅指”組成的活性結合結構是結合糖皮質激素反應元件（glucocorticoid response elements，GRE）的重要部位。該域包含核定位信號（nuclear localization signal，NLS）。第一個鋅指（外顯子 3）編碼結合核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和 AP-116 所必需的結構域，對受體結合起到反饋調節的作用。第二個鋅指（外顯子 4）編碼受到受體二聚化和 GRE 介導。蛋白的 C 端部分可結合熱休克蛋白，還可受體二聚化。該域包含第二個核定位信號 NLS2 和轉錄激活位點。兩個反式激活結構域（AF-1 和 AF-2）與其他核蛋白如 CREB 結合蛋白和 P300，其對糖皮質激素反應基因啟動子中轉錄起始復合物的穩定和活化是非常重要的[3]。
糖皮質激素的典型作用模式是通過直接調節基因轉錄而發生的。在不結合配體的情況下，GRα 主要和一些分子伴侶結合成為復合物，如熱休克蛋白（heat shock protein，HSP） 40、HSP70 和 HSP90 以及包括 HSP70 相互作用蛋白和 HSP70/HSP90 組織蛋白在內的連接酶。這些分子伴侶有助于保持受體的穩定。當親脂性糖皮質激素進入質膜并結合 GR 時，便可誘導 GR 復合體的重排，導致 GR 同二聚化和核易位，并且使其進入細胞核，進行正向或負向調節轉錄[4]。
1.1 GR 基因多態性及突變
GR 本身具有的基因多態性或突變使其在與配體結合時親和力下降[5]。一些腫瘤患者需要同時使用糖皮質激素藥物和化放療，這或許增加了 GR 突變的發生和發展的可能性。美國的一項研究在激素抵抗的人類白血病 CCRF-CEM 細胞中發現了 GR 等位基因 L753F 的突變[6]。絕大多數的突變都是雜合性突變，這就提示 GR 功能完全喪失是不能存在于活體中的。然而，對異質性細胞群體基因檢測的分析方法很難檢測出異常突變，因此 GR 突變在激素抵抗中的作用很可能被低估了。
1.2 GR 表達水平降低
GR 的表達情況與糖皮質激素最終發揮的效應強弱密切相關，細胞中 GR 表達降低與糖皮質激素治療伊始抵抗、復發和預后不良相關。細胞中的 GR 水平受到周圍配體的調節，呈現動態的變化趨勢。GR mRNA 的 3'UTR 中天然存在的突變可以降低 mRNA 的穩定性和蛋白質表達量，這很有可能是造成糖皮質激素抵抗的原因[7]。Wallace 等[8]研究發現，蛋白酶體介導的 GR 降解有助于以配體依賴的方式增加 GR 蛋白的更新換代，進而增強細胞對糖皮質激素的敏感性。糖皮質激素可以誘導 GR 上調或下調，以維持相對穩態。這種自我誘導的機制可能是轉錄，因為 GRE 在 GR 啟動子的特定區域已被鑒定[9]。然而，Tissing 等[10]發現兒童 T 細胞或前體 B 細胞中 GR mRNA 的自身誘導與糖皮質激素反應性之間并無明顯相關性，也提示 GR 自身誘導在糖皮質激素敏感性方面的確切作用值得進一步探究。總之，這些發現均表明 GR 表達水平可能是糖皮質激素反應的重要決定因素之一[11]。
1.3 GR 的不同亞型
已有一系列研究證實同種 GR 基因可以表達產生出一系列的不同蛋白，相關機制也有很多報道[12-15]，不同亞型的 GR 蛋白對于糖皮質激素的結合力及后續效應均不相同。
1.3.1 啟動子不同
科學家們于 1985 年首次克隆出人類 GR cDNA[16]，在闡明基因組結構的同時也發現了橫跨 80 kB 區域的 9 個外顯子的存在。外顯子 1 包含了 5' 非翻譯區，最近的研究已經確定了由特定啟動子產生的 9 個替代外顯子 1（1A、1B、1C、1D、1E、1F、1H、1I 和 1J）[17]。外顯子 1 的額外變異性是通過將外顯子 1A 選擇性剪切為 1A1、1A2、1A3 或者將外顯子 1C 的選擇性剪接到 1C1、1C2、1C3 來完成的[18]。盡管外顯子 1 的異質性不影響 GR 蛋白本身的序列，但可變啟動子的存在使其可以對 GR 蛋白水平進行調節，因此 GR mRNA 的不同啟動子是影響糖皮質激素敏感性的重要因素。
1.3.2 剪切方式不同
GR 蛋白由 GR 基因的 2～9 外顯子編碼，GR 前信使 RNA 的選擇性剪接可以產生 5 種 GR 蛋白亞型，分別為 GRα、GRβ、GRγ、GR-A 和 GR-P，其中 GRα 是典型的功能性受體。GRα 和 GRβ 蛋白都具有由外顯子 2～8 編碼的相同的 N-末端，僅由其 C-末端區分，恰恰是 GRβ 的 15 個獨特的 C-末端氨基酸的存在對其功能產生了巨大的影響[19]。早年研究顯示，GRβ 不能結合糖皮質激素激動劑，被認為僅可通過對 GRα 誘導的基因表達的顯性負性作用來調控轉錄[20]。近幾年，Lewis-Tuffin 等[21]證明即使在沒有 GRα 的情況下，GRβ 也能夠調節基因表達，降低其轉錄能力。此外，GRβ 還能以類似于 GRα 的方式，通過募集組蛋白脫乙酰酶 1 來抑制白細胞介素（interleukin，IL）-5和 IL-13 細胞因子啟動子的基礎活性[22]。這些研究表明，GRβ 在細胞信號傳導中可能具有以前被忽視的作用。GRβ 可以在大多數組織和細胞系中檢測到，但是與 GRα 相比通常呈低水平表達[23]。為了證明 GRβ 與 GRα 相比的負性功能，Koga 等[24]發現白血病對糖皮質激素治療的抵抗性與 GRβ 的高水平相關；朱琦等[25]對不同激素敏感性患者外周血內單個核細胞 GRα 和 GRβ 蛋白表達量進行檢測，發現糖皮質激素抵抗組患者 GRβ 表達陽性比率明顯高于激素敏感組。然而，類似結論在其他研究中并沒有得到重復[26-27]。因此，GRβ 在影響糖皮質激素的敏感性方面的作用尚無定論。
2 GR 復合物的分子伴侶
早在 1997 年，Koper 等[28]發現一些患者未能有效地通過下調內源性糖皮質激素而對地塞米松抑制試驗作出陽性反應。由于這些受試者表現出的糖皮質激素抵抗現象與 GR 基因中的突變或多態性無關，所以他們提出猜想：可能存在無關 GR 基因本身的一種糖皮質激素抵抗的機制。由于成熟完整的 GR 復合物對配體的結合以及激活后續的轉錄反應至關重要，因此與 GR 共同組成復合物的分子伴侶發生異常可能導致糖皮質激素反應性降低。Kojika 等[29]發現 HSP90 和 HSP70 的改變與細胞糖皮質激素敏感性降低有關，并且在 9 種糖皮質激素抗性人類白血病細胞系中的 2 種細胞系中成功檢測出了異常 HSP90 和 HSP70 蛋白水平。錢小順等[30]發現哮喘中 HSP90 mRNA 表達相對不足，從而造成 HSP90/GR 比值降低，這可能是激素抵抗型哮喘的發病機制原因之一。另外，在多發性硬化癥[31]和特發性腎病綜合征[32]患者中的外周血單核細胞中均檢測出了異常水平的 HSP90。Tissing 等[33]發現與糖皮質激素敏感的個體相比，糖皮質激素抗性個體單核細胞中的 HSP70 mRNA 表達存在差異，但 HSP90 水平沒有顯著差異。另外，也有研究發現分子伴侶的不同突變體可以通過 GR 復合物影響后續信號傳導，從而導致細胞對糖皮質激素的敏感性降低[34]。
3 其他機制
細胞內具有生物活性的糖皮質激素水平不足也是造成糖皮質激素抵抗的原因之一。對糖皮質激素攝取受損或外排增加是其中一個重要的原因，而這部分的功能由 P 糖蛋白、多重耐藥相關蛋白、肺耐藥蛋白等調節。另一個可能的原因是循環中的類固醇結合蛋白的增加或細胞內轉化酶活性降低[12]。另外，GR 的核易位也是糖皮質激素敏感性的重要決定因素之一。研究發現，一些糖皮質激素抵抗性哮喘患者在接受糖皮質激素治療后，外周血單個核細胞中的 GR 細胞核易位減少，與 GRE 結合也減少；而進一步研究發現 Ser-203 磷酸化的 GRα 將優先保留在細胞質中，因此證實了某些特殊位點的磷酸化能通過調節 GR 的核位移來影響糖皮質激素的活性[35-36]。與 GR 相互作用的轉錄因子的過度激活也是糖皮質激素抵抗的機制之一，其中激活蛋白 1 的激活增加已被認為是哮喘患者糖皮質激素抵抗的重要機制。該蛋白可與 GR 結合，從而阻止其與 GRE 以及其他轉錄因子的相互作用。另外，哮喘患者外周血中單個核細胞 NF-κB 的表達增加與激素的反應性呈現一定負相關，可能的機制是 NF-κB 和 GR 之間存在著物理性的相互拮抗作用，從而降低了糖皮質激素敏感性[37]。
4 結語
糖皮質激素敏感性下降是臨床工作中較為常見和棘手的問題之一。目前，我們對于糖皮質激素敏感性的相關研究已經有了一定的突破，其中包括 GR 表達減少、GR 下調和 GR 突變等方面。基于現有機制的研究，也有許多國內外學者在尋找改善或恢復激素敏感性的治療策略，目前已經發現了一些藥物具有此類的功效，如甲氨蝶呤[37]、大環內酯類藥物[38]、p38MAPK 抑制劑[39]以及中醫藥等[40]，在激素抵抗的治療方面已經取得了一定的進展。但是，由于糖皮質激素作用的病理生理機制相當錯綜復雜，而我們對于其中許多方面的研究也僅僅是淺嘗輒止，因此對于激素反應性仍亟需更加深入的研究。相信隨著科技的發展和對于糖皮質激素抵抗的機制研究進一步的深入，我們最終能夠找到對抗糖皮質激素敏感性降低的策略，為臨床診療工作和廣大患者開辟出新的治療道路。
糖皮質激素是機體內極為重要的一種類固醇激素，由下丘腦-垂體-腎上腺軸調控，在人體應激反應中起著重要作用；也是臨床常用的抗炎和免疫抑制劑，它在機體生長發育、新陳代謝、免疫調節以及炎癥反應等方面都起著重要的調節作用，臨床中通常用于治療炎癥疾病、自身免疫性疾病和癌癥[1]。糖皮質激素主要是通過結合糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）發揮后續作用，但對糖皮質激素反應的敏感性則因人而異，甚至在同一個體的不同組織中也不相同。
盡管糖皮質激素廣泛應用于臨床，但有相當一部分患者對于糖皮質激素反應性不佳，或者是在激素治療的過程中出現對糖皮質激素抵抗的現象。這部分患者往往具有高度的預后不良風險，這種風險既來自原發疾病本身，也來自長期大量使用糖皮質激素所帶來的不良反應。雖然這種糖皮質激素抵抗的患者人群所占比例較低，但是他們的就醫率和住院率卻常常遠超其他患者，占據了大量的醫療資源，加重了個人及社會的經濟負擔。因此，對糖皮質激素敏感性降低發生機制的研究具有十分重要的臨床價值。本文對目前糖皮質激素敏感性降低的分子機制的研究進展進行綜述。
1 GR 相關的分子機制
GR 編碼基因位于 5 號染色體上（5q31），由編碼蛋白質三個特征結構域的 9 個外顯子組成。N 端含有反式激活結構域（AF-1），涉及靶基因的轉錄激活[2]。由兩個高度保守的“鋅指”組成的活性結合結構是結合糖皮質激素反應元件（glucocorticoid response elements，GRE）的重要部位。該域包含核定位信號（nuclear localization signal，NLS）。第一個鋅指（外顯子 3）編碼結合核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和 AP-116 所必需的結構域，對受體結合起到反饋調節的作用。第二個鋅指（外顯子 4）編碼受到受體二聚化和 GRE 介導。蛋白的 C 端部分可結合熱休克蛋白，還可受體二聚化。該域包含第二個核定位信號 NLS2 和轉錄激活位點。兩個反式激活結構域（AF-1 和 AF-2）與其他核蛋白如 CREB 結合蛋白和 P300，其對糖皮質激素反應基因啟動子中轉錄起始復合物的穩定和活化是非常重要的[3]。
糖皮質激素的典型作用模式是通過直接調節基因轉錄而發生的。在不結合配體的情況下，GRα 主要和一些分子伴侶結合成為復合物，如熱休克蛋白（heat shock protein，HSP） 40、HSP70 和 HSP90 以及包括 HSP70 相互作用蛋白和 HSP70/HSP90 組織蛋白在內的連接酶。這些分子伴侶有助于保持受體的穩定。當親脂性糖皮質激素進入質膜并結合 GR 時，便可誘導 GR 復合體的重排，導致 GR 同二聚化和核易位，并且使其進入細胞核，進行正向或負向調節轉錄[4]。
1.1 GR 基因多態性及突變
GR 本身具有的基因多態性或突變使其在與配體結合時親和力下降[5]。一些腫瘤患者需要同時使用糖皮質激素藥物和化放療，這或許增加了 GR 突變的發生和發展的可能性。美國的一項研究在激素抵抗的人類白血病 CCRF-CEM 細胞中發現了 GR 等位基因 L753F 的突變[6]。絕大多數的突變都是雜合性突變，這就提示 GR 功能完全喪失是不能存在于活體中的。然而，對異質性細胞群體基因檢測的分析方法很難檢測出異常突變，因此 GR 突變在激素抵抗中的作用很可能被低估了。
1.2 GR 表達水平降低
GR 的表達情況與糖皮質激素最終發揮的效應強弱密切相關，細胞中 GR 表達降低與糖皮質激素治療伊始抵抗、復發和預后不良相關。細胞中的 GR 水平受到周圍配體的調節，呈現動態的變化趨勢。GR mRNA 的 3'UTR 中天然存在的突變可以降低 mRNA 的穩定性和蛋白質表達量，這很有可能是造成糖皮質激素抵抗的原因[7]。Wallace 等[8]研究發現，蛋白酶體介導的 GR 降解有助于以配體依賴的方式增加 GR 蛋白的更新換代，進而增強細胞對糖皮質激素的敏感性。糖皮質激素可以誘導 GR 上調或下調，以維持相對穩態。這種自我誘導的機制可能是轉錄，因為 GRE 在 GR 啟動子的特定區域已被鑒定[9]。然而，Tissing 等[10]發現兒童 T 細胞或前體 B 細胞中 GR mRNA 的自身誘導與糖皮質激素反應性之間并無明顯相關性，也提示 GR 自身誘導在糖皮質激素敏感性方面的確切作用值得進一步探究。總之，這些發現均表明 GR 表達水平可能是糖皮質激素反應的重要決定因素之一[11]。
1.3 GR 的不同亞型
已有一系列研究證實同種 GR 基因可以表達產生出一系列的不同蛋白，相關機制也有很多報道[12-15]，不同亞型的 GR 蛋白對于糖皮質激素的結合力及后續效應均不相同。
1.3.1 啟動子不同
科學家們于 1985 年首次克隆出人類 GR cDNA[16]，在闡明基因組結構的同時也發現了橫跨 80 kB 區域的 9 個外顯子的存在。外顯子 1 包含了 5' 非翻譯區，最近的研究已經確定了由特定啟動子產生的 9 個替代外顯子 1（1A、1B、1C、1D、1E、1F、1H、1I 和 1J）[17]。外顯子 1 的額外變異性是通過將外顯子 1A 選擇性剪切為 1A1、1A2、1A3 或者將外顯子 1C 的選擇性剪接到 1C1、1C2、1C3 來完成的[18]。盡管外顯子 1 的異質性不影響 GR 蛋白本身的序列，但可變啟動子的存在使其可以對 GR 蛋白水平進行調節，因此 GR mRNA 的不同啟動子是影響糖皮質激素敏感性的重要因素。
1.3.2 剪切方式不同
GR 蛋白由 GR 基因的 2～9 外顯子編碼，GR 前信使 RNA 的選擇性剪接可以產生 5 種 GR 蛋白亞型，分別為 GRα、GRβ、GRγ、GR-A 和 GR-P，其中 GRα 是典型的功能性受體。GRα 和 GRβ 蛋白都具有由外顯子 2～8 編碼的相同的 N-末端，僅由其 C-末端區分，恰恰是 GRβ 的 15 個獨特的 C-末端氨基酸的存在對其功能產生了巨大的影響[19]。早年研究顯示，GRβ 不能結合糖皮質激素激動劑，被認為僅可通過對 GRα 誘導的基因表達的顯性負性作用來調控轉錄[20]。近幾年，Lewis-Tuffin 等[21]證明即使在沒有 GRα 的情況下，GRβ 也能夠調節基因表達，降低其轉錄能力。此外，GRβ 還能以類似于 GRα 的方式，通過募集組蛋白脫乙酰酶 1 來抑制白細胞介素（interleukin，IL）-5和 IL-13 細胞因子啟動子的基礎活性[22]。這些研究表明，GRβ 在細胞信號傳導中可能具有以前被忽視的作用。GRβ 可以在大多數組織和細胞系中檢測到，但是與 GRα 相比通常呈低水平表達[23]。為了證明 GRβ 與 GRα 相比的負性功能，Koga 等[24]發現白血病對糖皮質激素治療的抵抗性與 GRβ 的高水平相關；朱琦等[25]對不同激素敏感性患者外周血內單個核細胞 GRα 和 GRβ 蛋白表達量進行檢測，發現糖皮質激素抵抗組患者 GRβ 表達陽性比率明顯高于激素敏感組。然而，類似結論在其他研究中并沒有得到重復[26-27]。因此，GRβ 在影響糖皮質激素的敏感性方面的作用尚無定論。
2 GR 復合物的分子伴侶
早在 1997 年，Koper 等[28]發現一些患者未能有效地通過下調內源性糖皮質激素而對地塞米松抑制試驗作出陽性反應。由于這些受試者表現出的糖皮質激素抵抗現象與 GR 基因中的突變或多態性無關，所以他們提出猜想：可能存在無關 GR 基因本身的一種糖皮質激素抵抗的機制。由于成熟完整的 GR 復合物對配體的結合以及激活后續的轉錄反應至關重要，因此與 GR 共同組成復合物的分子伴侶發生異常可能導致糖皮質激素反應性降低。Kojika 等[29]發現 HSP90 和 HSP70 的改變與細胞糖皮質激素敏感性降低有關，并且在 9 種糖皮質激素抗性人類白血病細胞系中的 2 種細胞系中成功檢測出了異常 HSP90 和 HSP70 蛋白水平。錢小順等[30]發現哮喘中 HSP90 mRNA 表達相對不足，從而造成 HSP90/GR 比值降低，這可能是激素抵抗型哮喘的發病機制原因之一。另外，在多發性硬化癥[31]和特發性腎病綜合征[32]患者中的外周血單核細胞中均檢測出了異常水平的 HSP90。Tissing 等[33]發現與糖皮質激素敏感的個體相比，糖皮質激素抗性個體單核細胞中的 HSP70 mRNA 表達存在差異，但 HSP90 水平沒有顯著差異。另外，也有研究發現分子伴侶的不同突變體可以通過 GR 復合物影響后續信號傳導，從而導致細胞對糖皮質激素的敏感性降低[34]。
3 其他機制
細胞內具有生物活性的糖皮質激素水平不足也是造成糖皮質激素抵抗的原因之一。對糖皮質激素攝取受損或外排增加是其中一個重要的原因，而這部分的功能由 P 糖蛋白、多重耐藥相關蛋白、肺耐藥蛋白等調節。另一個可能的原因是循環中的類固醇結合蛋白的增加或細胞內轉化酶活性降低[12]。另外，GR 的核易位也是糖皮質激素敏感性的重要決定因素之一。研究發現，一些糖皮質激素抵抗性哮喘患者在接受糖皮質激素治療后，外周血單個核細胞中的 GR 細胞核易位減少，與 GRE 結合也減少；而進一步研究發現 Ser-203 磷酸化的 GRα 將優先保留在細胞質中，因此證實了某些特殊位點的磷酸化能通過調節 GR 的核位移來影響糖皮質激素的活性[35-36]。與 GR 相互作用的轉錄因子的過度激活也是糖皮質激素抵抗的機制之一，其中激活蛋白 1 的激活增加已被認為是哮喘患者糖皮質激素抵抗的重要機制。該蛋白可與 GR 結合，從而阻止其與 GRE 以及其他轉錄因子的相互作用。另外，哮喘患者外周血中單個核細胞 NF-κB 的表達增加與激素的反應性呈現一定負相關，可能的機制是 NF-κB 和 GR 之間存在著物理性的相互拮抗作用，從而降低了糖皮質激素敏感性[37]。
4 結語
糖皮質激素敏感性下降是臨床工作中較為常見和棘手的問題之一。目前，我們對于糖皮質激素敏感性的相關研究已經有了一定的突破，其中包括 GR 表達減少、GR 下調和 GR 突變等方面。基于現有機制的研究，也有許多國內外學者在尋找改善或恢復激素敏感性的治療策略，目前已經發現了一些藥物具有此類的功效，如甲氨蝶呤[37]、大環內酯類藥物[38]、p38MAPK 抑制劑[39]以及中醫藥等[40]，在激素抵抗的治療方面已經取得了一定的進展。但是，由于糖皮質激素作用的病理生理機制相當錯綜復雜，而我們對于其中許多方面的研究也僅僅是淺嘗輒止，因此對于激素反應性仍亟需更加深入的研究。相信隨著科技的發展和對于糖皮質激素抵抗的機制研究進一步的深入，我們最終能夠找到對抗糖皮質激素敏感性降低的策略，為臨床診療工作和廣大患者開辟出新的治療道路。