引用本文： 鄭林鑫, 陳燦, 麥玉梅, 李理, 李偉峰. 兩種表皮生長因子抑制劑下調腫瘤抑制素 M 抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(4): 400-406. doi: 10.7507/1671-6205.201712029 復制
肺纖維化屬于纖維增殖性疾病的范疇，進行性呼吸衰竭、并發肺腫瘤或心血管疾病而死亡是肺纖維化疾病的轉歸，迄今為止除了肺移植和長期氧療外尚無有效的治療手段[1]。有必要從分子水平闡明肺纖維化的發生機制，解決其分子調控的核心問題，找到有效的藥物治療靶點，才能從本質上解決肺纖維化的治療問題。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor kinase inhibitor，EGFR-TKI）能競爭性抑制三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結合區域，抑制表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶活性，從而抑制細胞增生和血管發生，目前已是非小細胞肺癌治療中的一線靶向用藥，其中吉非替尼和厄羅替尼是第一代 EGFR-TKI 中的經典藥物[2]。已有研究證明在腫瘤壞死因子-α 轉基因或博來霉素誘導的肺纖維化小鼠中，EGFR-TKI 可減輕肺纖維化[3-4]。本課題組前期研究亦證明吉非替尼及厄羅替尼對博來霉素誘導的肺纖維化小鼠的緩解作用相似[5]。但 EGFR-TKI 緩解小鼠肺纖維化的分子調控機制及其代表性藥物吉非替尼和厄羅替尼對下游通路的干預是否有差異仍不明確。
腫瘤抑制素 M（oncostatin M，OSM）是一種耐熱、耐酸的相對分子質量為 28 000 的單鏈糖蛋白，既往主要在腫瘤細胞中有廣泛研究，近年來研究表明它與纖維化及細胞轉分化有密切關系[6-8]，其經典的下游通路為非受體型酪氨酸激酶（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）通路[9]。既往乳腺癌的相關研究發現 OSM 與表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）在乳腺癌患者的腫瘤相關巨噬細胞中共表達[10]，并且 EGF 促進 OSM 對乳腺癌細胞增殖和分化的抑制作用[9]。我們推測 EGFR-TKI 通過抑制 OSM 的表達及下游 JAK/STAT 通路的活化從而達到抗纖維化作用。鑒于此，本實驗通過氣道內霧化博來霉素，分別以吉非替尼及厄羅替尼進行干預，然后通過小鼠胸部 CT、肺組織蘇木精-伊紅（HE）染色和 Masoon 染色對各組小鼠進行纖維化評價，同時測定 OSM、JAK/STAT 的表達情況，從而初步探索 EGFR-TKI 抗纖維化的分子機制，并比較兩種第一代經典 EGFR-TKI 藥物對相關通路的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF 級雌性昆明小鼠 40 只，均為 8 周齡，平均體重約 27.7 g。小鼠從廣東省醫學實驗動物購買，于廣州軍區廣州總醫院實驗動物中心飼養。所有操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。
1.2 主要材料
博來霉素（15 mg/支，浙江海正藥業）；吉非替尼片（250 mg/片，英國阿斯利康公司）；厄羅替尼片（150 mg/片，瑞士羅氏公司）；RIPA 強裂解液（江蘇碧云天公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天公司）；蛋白酶抑制劑（瑞士羅氏公司）；磷酸化酶抑制劑（瑞士羅氏公司）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（武漢博士德公司）；OSM 抗體（CST 公司）；JAK1 抗體（CST 公司）；磷酸化 JAK1（p-JAK1）抗體（CST 公司）；信號傳導與轉錄激活因子 3（STAT3，CST 公司）；磷酸化 STAT3（p-STAT3，CST 公司）；MILLIPORE 化學發光劑（Billerica，USA）；動物喉鏡（美國 PENN-CENTURY 公司）；小鼠固定操作臺（美國 PENN-CENTURY 公司）；MicroSprayereTM 霧化器（美國 PENN-CENTURY 公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯，BX51）；Multiskan Go 全波長酶標儀（Thermo Fisher 公司）；Minichemi 化學發光儀（北京賽智創業科技有限公司）；小動物全定量多排 MicroCT（HITACHI 公司）。
1.3 方法
1.3.1 實驗設計
40 只雌性昆明小鼠隨機分成 4 組，每組10只，分別為正常組、博來霉素組、吉非替尼組和厄羅替尼組。博來霉素組小鼠以腹腔注射水合氯醛進行麻醉，麻醉成功后固定于小鼠固定操作臺，使用小鼠喉鏡下壓小鼠舌根部，暴露聲門，MicroSprayereTM霧化器吸取 100μl 博來霉素溶液（3 mg/kg 溶于 100μl 生理鹽水）從聲門插入小鼠氣道，然后進行霧化；對照組小鼠霧化等體積的生理鹽水；吉非替尼組小鼠在氣管內霧化博來霉素后每日使用 100μl 吉非替尼溶液灌胃（20 mg/kg 稀釋至 100 μl 5% 的葡萄糖溶液）；厄羅替尼組小鼠在氣管內霧化博來霉素后每日使用 100μl 吉非替尼溶液灌胃（25 mg/kg 稀釋至 100μl 5% 的葡萄糖溶液）。而對照組和博來霉素組小鼠則每日使用100 μl 5% 的葡萄糖溶液灌胃。實驗的第 14 d 行小鼠胸部 CT 檢查，完成檢查后處死各組小鼠，使用眼球取血法獲得全血標本，3 000 r/min 離心 10 min 獲得血清，解剖小鼠獲取肺組織標本。
1.3.2 小鼠胸部 CT 檢查
小鼠腹腔注射水合氯醛后俯臥位固定于小鼠固定臺，使用小動物全定量多排 MicroCT 進行胸部 CT 檢查。
1.3.3 小鼠肺組織病理檢查
肺組織以 10% 中性甲醛固定 72 h，然后常規脫水、石蠟包埋、切片，而后行 HE 染色和 Masson 染色。分別參照 Mikawa 法[11]和 Ashcroft 法[12]對小鼠肺組織炎癥損傷程度以及纖維化損傷程度進行評分。
1.3.4 小鼠肺組織 α-SMA、OSM、p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3 Western blot 結果
取肺組織 0.1 g，勻漿后加入含有蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑的 RIPA 裂解液，提取總蛋白，使用 BCA 法檢測所提蛋白濃度，30 μg/孔上樣，隨后進行 SDS/PAGE 電泳將蛋白轉移至 PVDF 膜上。使用 5% 脫脂奶粉 20 ml 室溫封閉 1 h。使用 TBST 洗滌液洗膜 3 次，每次 10 min。分別加入 α-SMA、OSM、p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3 一抗，4 ℃ 孵育過夜。使用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗 37 ℃ 孵育 1 h。最后使用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。化學發光試劑檢測蛋白印跡條帶，Gelpro32 軟件分析結果。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 進行統計學分析。所有數據以均數±標準差（
±s）表示，進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。其中，符合正態分布、方差齊的計量資料數據多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用 Bonferroni 檢驗，顯著性水準取 α=0.05，雙側；符合正態分布、方差不齊的計量資料數據多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用 Dunnett T3 檢驗，顯著性水準取 α=0.05，雙側。
2 結果
2.1 小鼠胸部 CT 表現
正常組小鼠雙肺肺野透亮度正常，肺紋理清晰，無明顯滲出病灶及纖維條索影。博來霉素組小鼠雙肺透亮度降低，肺紋理紊亂，可見多發片狀滲出及較多纖維條索影。吉非替尼及厄羅替尼組小鼠雙肺透亮度正常，肺紋理稍增粗，局部可見少量纖維條索影。結果見圖 1。
圖1
小鼠胸部 CT 檢查像
a．正常組；b．博來霉素組；c．吉非替尼組；d．厄羅替尼組
2.2 肺組織病理學改變
2.2.1 肺組織 HE 染色
正常組小鼠肺組織結構完整清晰，肺泡壁較薄，肺泡中未見明顯的炎細胞及紅細胞浸潤。博來霉素組小鼠肺組織中大范圍出現實變，肺泡壁明顯增厚，肺泡中有大量的炎細胞以及少量的紅細胞浸潤，且肺間質中出現了較多的成纖維細胞浸潤。吉非替尼小鼠及厄羅替尼組小鼠的病理損傷程度均居于正常組及博來霉素組之間。參照 Mikawa 法進行炎癥損傷評分。結果四組小鼠肺組織的炎癥損傷評分分別為（1.4±1.3）、（7.2±1.1）、（2.4±0.9）、（2.2±1.5）分，博來霉素組小鼠肺組織炎癥損傷評分較正常組明顯升高（P<0.01），吉非替尼及厄羅替尼組小鼠肺組織炎癥損傷評分較正常組明顯升高（均P<0.01），但較博來霉素組明顯下降（P<0.01）。結果見圖 2、圖 3。
圖2
小鼠肺組織炎癥損傷評分
與博來霉素組比較，*
圖3
小鼠肺組織病理像（HE×200）
a．正常組；b．博來霉素組；c．吉非替尼組；d．厄羅替尼組
2.2.2 肺組織 Masson 染色
正常組小鼠肺組織的肺泡結構完整清晰，未見明顯炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積。博來霉素組小鼠肺組織結構紊亂不清，失去正常肺泡結構，肺組織中出現大量炎癥細胞浸潤，伴有大片纖維化增值病灶，呈彌漫性分布，可見大量的藍色膠原纖維沉積。吉非替尼及厄羅替尼組小鼠的肺組織結構大致完整，肺泡壁呈輕到中度增厚，可見少量炎性癥細胞浸潤及藍色膠原纖維沉積。結果見圖 4。參照 Ashcroft 法對各組小鼠肺組織進行纖維化損傷評分，四組小鼠肺組織的纖維化損傷評分分別為（1.4±0.6）、（7.2±0.5）、（2.4±0.6）、（2.4±0.9）分。博來霉素組纖維化損傷評分較正常組明顯升高（P<0.01）。吉非替尼及厄羅替尼組小鼠纖維化損傷評分較正常組明顯升高（均P<0.01），但較博來霉素組明顯下降（P<0.01）。結果見圖 5。
圖4
小鼠肺組織 Masson 染色病理像（Masson ×200）
a．正常組；b．博來霉素組；c．吉非替尼組；d．厄羅替尼組
圖5
小鼠肺組織纖維化損傷評分
與博來霉素組比較，**
2.3 肺組織 α-SMA、OSM、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3 蛋白的表達
肺組織 α-SMA、OSM、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3 蛋白表達的 Western blot 結果見圖 6，半定量分析結果見圖 7。博來霉素組小鼠肺組織 α-SMA 蛋白表達水平較正常組明顯升高（1.26±0.93 比 0.76±0.11，P<0.01），吉非替尼組及厄羅替尼組小鼠肺組織 α-SMA 蛋白較博來霉素組明顯降低（0.86±0.10 比 1.26±0.93，P<0.01；0.89±0.14 比 1.26±0.93，P<0.01），與正常組無顯著差異（0.86±0.17 比 0.76±0.11，P=0.26；0.89±0.14 比 0.76±0.11，P =0.14）。結果見圖 7a。
博來霉素組小鼠肺組織 OSM 蛋白表達水平較正常組明顯升高（0.52±0.09 比 0.06±0.02，P<0.01），吉非替尼組及厄羅替尼組小鼠肺組織 OSM 蛋白表達水平較博來霉素組明顯降低（0.26±0.06 比 0.52±0.09，P <0.01，0.26±0.07 比 0.52±0.09， P <0.01），較正常組明顯升高（0.26±0.06 比 0.06±0.02， P <0.01，0.26±0.07 比 0.06±0.02， P <0.01）。結果見 圖 7b。
博來霉素組小鼠肺組織 p-JAK/JAK 蛋白表達水平較正常組明顯升高（2.13±0.08 比 0.50 ±0.07，P<0.01），吉非替尼組及厄羅替尼組小鼠肺組織 p-JAK/JAK 蛋白表達水平較博來霉素組明顯降低（1.39±0.07 比 2.13±0.08，P<0.01；1.38±0.09 比 2.13±0.08，P <0.01），較正常組明顯升高（1.39±0.07 比 0.50 ±0.07， P<0.01；1.38±0.09 比 0.50±0.07，P<0.01）。結果見圖 7c。
博來霉素組小鼠肺組織 p-STAT3/STAT3 蛋白表達水平較正常組明顯升高（0.67±0.05 比 0.52±0.11，P<0.05），吉非替尼組及厄羅替尼組小鼠肺組織 p-STAT3/STAT3 蛋白表達水平較博來霉素組明顯降低（0.50±0.12 比 0.67±0.05，P<0.05；0.52±0.09 比 0.67±0.05，P<0.05），與正常組無顯著差異（0.50±0.12 比 0.52±0.11，P=0.73，0.52±0.09 比 0.52±0.11，P=0.90）。結果見圖 7d。
圖6
肺組織 α-SMA、OSM、JAK1、p-JAK1、 STAT3、p-STAT3 蛋白表達的 Western blot 檢測像
圖7
肺組織 α-SMA、OSM、JAK1 、p-JAK1、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達水平
a．α-SMA；b．OSM；c．p-JAK/JAK；d． p-STAT3/STAT3。與博來霉素組比較，*
3 討論
EGFR-TKI 是一種表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑，其競爭性結合 HER 家族（EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4）中的 EGFR 胞內段的酪氨酸激酶域，阻斷其與 ATP 結合，中斷 EGFR 信號通路，從而達到抑制細胞增殖和血管發生的目的。自其問世以來，肺癌的治療進入了一個全新的時代，因其卓越的療效，第一代 EGFR-TKI 中的代表性藥物厄羅替尼和吉非替尼分別在 2013 年及 2015 年獲得美國 FDA 批準作為具有 EGFR 敏感突變的非小細胞肺癌患者的一線治療方案[2]。肺纖維化本質上亦是一種類似肺癌的纖維增殖性疾病，其特點是肺泡上皮損傷后不恰當增殖，成纖維細胞持續活化，膠原及細胞外基質成分過度沉積，血管以類似腫瘤發生的方式雜亂生成等，因此抑制 EGFR 信號通路或許有助于肺纖維化的治療。本課題組前期研究已證實 EGFR-TKI 在緩解肺纖維化中的可行性，并比較了吉非替尼和厄羅替尼在緩解肺纖維化中的差異[5]，但 EGFR-TKI 緩解肺纖維化的作用機制及吉非替尼和厄羅替尼對肺纖維化下游通路的影響仍未進一步探究。
本研究采用博來霉素氣管內霧化的新方法制作肺纖維化的小鼠模型，以 20 mg·kg–1·d–1的吉非替尼或 25 mg·kg–1·d–1的厄羅替尼灌胃進行干預。由于目前還沒有一種公認的方法可以使肺纖維化在已經形成后逆轉，故雖然已有最新研究將對肺纖維化相關干預改在造模前 1 周及造模后 3 周進行[13]，本研究仍然沿用傳統的干預方案，將吉非替尼和厄羅替尼灌胃的干預持續于 2 周的整個造模過程中。有研究表明造模過程第 1 周主要是肺泡急性損傷階段，第 2 周小鼠已經開始出現肺纖維化[14]，而吉非替尼和厄羅替尼的干預是持續 2 周。因此，本研究所觀察到的 TKI 的數據是作用于肺泡急性損傷階段和肺纖維化兩個階段的。在吉非替尼和厄羅替尼對博來霉素所誘導的肺纖維化小鼠模型進行干預后，胸部 CT 顯示吉非替尼和厄羅替尼均能減少肺纖維化小鼠雙肺滲出及纖維化病灶，HE、Masson 染色結果顯示吉非替尼和厄羅替尼均能下調肺纖維化小鼠模型肺部的炎癥損傷評分和纖維化損傷評分，Western blot 結果顯示吉非替尼和厄羅替尼均能下調肺纖維化生物學標志物 α-SMA 的高表達。以上影像學、病理學、分子生物學的結果提示吉非替尼及厄羅替尼均能緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，二者的作用相當。
本課題組前期研究顯示吉非替尼打斷 EGFR 通路，抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的同時能下調 OSM，提示吉非替尼可能是通過下調 OSM 起到緩解肺纖維化的作用[15]。OSM 是一種耐熱、耐酸的單鏈糖蛋白，其相對分子質量為 28 000，1986 年首次從豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（phorbol myristate acetate，PMA）活化組織細胞淋巴瘤細胞（U937 細胞）培養上清中分離純化，既往主要是在腫瘤細胞中得到廣泛研究，近年來研究證明 OSM 在細胞外基質沉淀、細胞增殖、細胞存活、炎癥介導中起重要作用[16]，與皮膚、瘢痕、腎等組織纖維化有密切聯系[6-8]。上述研究表明 EGFR 及 OSM 均為纖維化相關性基因，但有關 EGFR 通路及 OSM 之間關系的研究甚少。一項關于乳腺癌的研究發現 OSM 與 EFG 在乳腺癌患者的腫瘤相關性巨噬細胞中有共表達[10]。而在關于惡性膠質瘤的研究則發現 OSM 受體與 EGF 受體能形成復合物，OSM 受體的缺失直接減弱 EGFR 信號通路的傳導[17]。有關 OSM 與 EGFR 通路的相互作用及上下游關系缺乏更多文獻，需要進一步研究。
本研究顯示博來霉素誘導的肺纖維化組小鼠中 OSM、p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3 均顯著上調，而兩種經典的第一代 EGFR-TKI 干預后均能下調上述蛋白的表達，實驗結果提示 OSM 及 JAK/STAT 通路可能為 EGFR 的下游通路。JAK/STAT 通路是近年來發現的一條由細胞因子刺激的信號通路，該通路參與細胞的增殖、分化、凋亡，且在免疫調節等許多重要的生物學過程中起重要作用。JAK/STAT 信號通路主要由三個成分組成，即非受體型酪氨酸激酶相關受體 GP130、酪氨酸激酶 JAK 和轉錄因子 STAT[18]。OSM 等白細胞介素-6 家族成員與 JAK/STAT 通路密切相關，研究發現 OSM 能通過 STAT3 介導促進肺成纖維細胞的趨化性、α-SMA的表達、收縮性及轉分化等肺纖維化過程中肺成纖維細胞的重要病理生理改變[16]。本課題組的研究成果及上述文獻表明 OSM 及 p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3 在博來霉素誘導的肺纖維化小鼠中的表達與肺纖維化程度呈正相關關系，而兩種經典的第一代 EGFR-TKI 藥物吉非替尼及厄羅替尼均能相同程度地緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，伴有上述蛋白的下調。我們推測，吉非替尼及厄羅替尼可能通過下調 OSM 的表達，抑制下游的 JAK/STAT 通路，從而緩解肺纖維化，兩種EGFR-TKI 下調 OSM 及 JAK/STAT 通路的作用無顯著差異，緩解肺纖維化的程度亦相近。
本研究結果為肺纖維化研究中 EGFR 通路及 OSM 通路的相互作用及上下游關系的闡明提供了部分實驗依據，且證明兩種 EGFR-TKI 在下調 OSM、抑制 JAK/STAT 通路及緩解肺纖維化的作用中無顯著差異。但該研究僅為初步研究，后續還需要通過構建 OSM 高表達質粒、OSM siRNA 及使用 JAK/STAT 通路特異性抑制劑進一步求證 EGFR 通路及 OSM 通路的上下游關系，以及它們在肺纖維化中的作用。進一步深入研究有希望尋找到肺纖維化過程中的有效致纖維化靶點進行干預，為肺纖維化的治療提供一種新的思路，創造良好的社會價值及醫療價值。
肺纖維化屬于纖維增殖性疾病的范疇，進行性呼吸衰竭、并發肺腫瘤或心血管疾病而死亡是肺纖維化疾病的轉歸，迄今為止除了肺移植和長期氧療外尚無有效的治療手段[1]。有必要從分子水平闡明肺纖維化的發生機制，解決其分子調控的核心問題，找到有效的藥物治療靶點，才能從本質上解決肺纖維化的治療問題。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor kinase inhibitor，EGFR-TKI）能競爭性抑制三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結合區域，抑制表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶活性，從而抑制細胞增生和血管發生，目前已是非小細胞肺癌治療中的一線靶向用藥，其中吉非替尼和厄羅替尼是第一代 EGFR-TKI 中的經典藥物[2]。已有研究證明在腫瘤壞死因子-α 轉基因或博來霉素誘導的肺纖維化小鼠中，EGFR-TKI 可減輕肺纖維化[3-4]。本課題組前期研究亦證明吉非替尼及厄羅替尼對博來霉素誘導的肺纖維化小鼠的緩解作用相似[5]。但 EGFR-TKI 緩解小鼠肺纖維化的分子調控機制及其代表性藥物吉非替尼和厄羅替尼對下游通路的干預是否有差異仍不明確。
腫瘤抑制素 M（oncostatin M，OSM）是一種耐熱、耐酸的相對分子質量為 28 000 的單鏈糖蛋白，既往主要在腫瘤細胞中有廣泛研究，近年來研究表明它與纖維化及細胞轉分化有密切關系[6-8]，其經典的下游通路為非受體型酪氨酸激酶（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）通路[9]。既往乳腺癌的相關研究發現 OSM 與表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）在乳腺癌患者的腫瘤相關巨噬細胞中共表達[10]，并且 EGF 促進 OSM 對乳腺癌細胞增殖和分化的抑制作用[9]。我們推測 EGFR-TKI 通過抑制 OSM 的表達及下游 JAK/STAT 通路的活化從而達到抗纖維化作用。鑒于此，本實驗通過氣道內霧化博來霉素，分別以吉非替尼及厄羅替尼進行干預，然后通過小鼠胸部 CT、肺組織蘇木精-伊紅（HE）染色和 Masoon 染色對各組小鼠進行纖維化評價，同時測定 OSM、JAK/STAT 的表達情況，從而初步探索 EGFR-TKI 抗纖維化的分子機制，并比較兩種第一代經典 EGFR-TKI 藥物對相關通路的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF 級雌性昆明小鼠 40 只，均為 8 周齡，平均體重約 27.7 g。小鼠從廣東省醫學實驗動物購買，于廣州軍區廣州總醫院實驗動物中心飼養。所有操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。
1.2 主要材料
博來霉素（15 mg/支，浙江海正藥業）；吉非替尼片（250 mg/片，英國阿斯利康公司）；厄羅替尼片（150 mg/片，瑞士羅氏公司）；RIPA 強裂解液（江蘇碧云天公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天公司）；蛋白酶抑制劑（瑞士羅氏公司）；磷酸化酶抑制劑（瑞士羅氏公司）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（武漢博士德公司）；OSM 抗體（CST 公司）；JAK1 抗體（CST 公司）；磷酸化 JAK1（p-JAK1）抗體（CST 公司）；信號傳導與轉錄激活因子 3（STAT3，CST 公司）；磷酸化 STAT3（p-STAT3，CST 公司）；MILLIPORE 化學發光劑（Billerica，USA）；動物喉鏡（美國 PENN-CENTURY 公司）；小鼠固定操作臺（美國 PENN-CENTURY 公司）；MicroSprayereTM 霧化器（美國 PENN-CENTURY 公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯，BX51）；Multiskan Go 全波長酶標儀（Thermo Fisher 公司）；Minichemi 化學發光儀（北京賽智創業科技有限公司）；小動物全定量多排 MicroCT（HITACHI 公司）。
1.3 方法
1.3.1 實驗設計
40 只雌性昆明小鼠隨機分成 4 組，每組10只，分別為正常組、博來霉素組、吉非替尼組和厄羅替尼組。博來霉素組小鼠以腹腔注射水合氯醛進行麻醉，麻醉成功后固定于小鼠固定操作臺，使用小鼠喉鏡下壓小鼠舌根部，暴露聲門，MicroSprayereTM霧化器吸取 100μl 博來霉素溶液（3 mg/kg 溶于 100μl 生理鹽水）從聲門插入小鼠氣道，然后進行霧化；對照組小鼠霧化等體積的生理鹽水；吉非替尼組小鼠在氣管內霧化博來霉素后每日使用 100μl 吉非替尼溶液灌胃（20 mg/kg 稀釋至 100 μl 5% 的葡萄糖溶液）；厄羅替尼組小鼠在氣管內霧化博來霉素后每日使用 100μl 吉非替尼溶液灌胃（25 mg/kg 稀釋至 100μl 5% 的葡萄糖溶液）。而對照組和博來霉素組小鼠則每日使用100 μl 5% 的葡萄糖溶液灌胃。實驗的第 14 d 行小鼠胸部 CT 檢查，完成檢查后處死各組小鼠，使用眼球取血法獲得全血標本，3 000 r/min 離心 10 min 獲得血清，解剖小鼠獲取肺組織標本。
1.3.2 小鼠胸部 CT 檢查
小鼠腹腔注射水合氯醛后俯臥位固定于小鼠固定臺，使用小動物全定量多排 MicroCT 進行胸部 CT 檢查。
1.3.3 小鼠肺組織病理檢查
肺組織以 10% 中性甲醛固定 72 h，然后常規脫水、石蠟包埋、切片，而后行 HE 染色和 Masson 染色。分別參照 Mikawa 法[11]和 Ashcroft 法[12]對小鼠肺組織炎癥損傷程度以及纖維化損傷程度進行評分。
1.3.4 小鼠肺組織 α-SMA、OSM、p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3 Western blot 結果
取肺組織 0.1 g，勻漿后加入含有蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑的 RIPA 裂解液，提取總蛋白，使用 BCA 法檢測所提蛋白濃度，30 μg/孔上樣，隨后進行 SDS/PAGE 電泳將蛋白轉移至 PVDF 膜上。使用 5% 脫脂奶粉 20 ml 室溫封閉 1 h。使用 TBST 洗滌液洗膜 3 次，每次 10 min。分別加入 α-SMA、OSM、p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3 一抗，4 ℃ 孵育過夜。使用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗 37 ℃ 孵育 1 h。最后使用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。化學發光試劑檢測蛋白印跡條帶，Gelpro32 軟件分析結果。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 進行統計學分析。所有數據以均數±標準差（
±s）表示，進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。其中，符合正態分布、方差齊的計量資料數據多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用 Bonferroni 檢驗，顯著性水準取 α=0.05，雙側；符合正態分布、方差不齊的計量資料數據多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用 Dunnett T3 檢驗，顯著性水準取 α=0.05，雙側。
2 結果
2.1 小鼠胸部 CT 表現
正常組小鼠雙肺肺野透亮度正常，肺紋理清晰，無明顯滲出病灶及纖維條索影。博來霉素組小鼠雙肺透亮度降低，肺紋理紊亂，可見多發片狀滲出及較多纖維條索影。吉非替尼及厄羅替尼組小鼠雙肺透亮度正常，肺紋理稍增粗，局部可見少量纖維條索影。結果見圖 1。
圖1
小鼠胸部 CT 檢查像
a．正常組；b．博來霉素組；c．吉非替尼組；d．厄羅替尼組
2.2 肺組織病理學改變
2.2.1 肺組織 HE 染色
正常組小鼠肺組織結構完整清晰，肺泡壁較薄，肺泡中未見明顯的炎細胞及紅細胞浸潤。博來霉素組小鼠肺組織中大范圍出現實變，肺泡壁明顯增厚，肺泡中有大量的炎細胞以及少量的紅細胞浸潤，且肺間質中出現了較多的成纖維細胞浸潤。吉非替尼小鼠及厄羅替尼組小鼠的病理損傷程度均居于正常組及博來霉素組之間。參照 Mikawa 法進行炎癥損傷評分。結果四組小鼠肺組織的炎癥損傷評分分別為（1.4±1.3）、（7.2±1.1）、（2.4±0.9）、（2.2±1.5）分，博來霉素組小鼠肺組織炎癥損傷評分較正常組明顯升高（P<0.01），吉非替尼及厄羅替尼組小鼠肺組織炎癥損傷評分較正常組明顯升高（均P<0.01），但較博來霉素組明顯下降（P<0.01）。結果見圖 2、圖 3。
圖2
小鼠肺組織炎癥損傷評分
與博來霉素組比較，*
圖3
小鼠肺組織病理像（HE×200）
a．正常組；b．博來霉素組；c．吉非替尼組；d．厄羅替尼組
2.2.2 肺組織 Masson 染色
正常組小鼠肺組織的肺泡結構完整清晰，未見明顯炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積。博來霉素組小鼠肺組織結構紊亂不清，失去正常肺泡結構，肺組織中出現大量炎癥細胞浸潤，伴有大片纖維化增值病灶，呈彌漫性分布，可見大量的藍色膠原纖維沉積。吉非替尼及厄羅替尼組小鼠的肺組織結構大致完整，肺泡壁呈輕到中度增厚，可見少量炎性癥細胞浸潤及藍色膠原纖維沉積。結果見圖 4。參照 Ashcroft 法對各組小鼠肺組織進行纖維化損傷評分，四組小鼠肺組織的纖維化損傷評分分別為（1.4±0.6）、（7.2±0.5）、（2.4±0.6）、（2.4±0.9）分。博來霉素組纖維化損傷評分較正常組明顯升高（P<0.01）。吉非替尼及厄羅替尼組小鼠纖維化損傷評分較正常組明顯升高（均P<0.01），但較博來霉素組明顯下降（P<0.01）。結果見圖 5。
圖4
小鼠肺組織 Masson 染色病理像（Masson ×200）
a．正常組；b．博來霉素組；c．吉非替尼組；d．厄羅替尼組
圖5
小鼠肺組織纖維化損傷評分
與博來霉素組比較，**
2.3 肺組織 α-SMA、OSM、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3 蛋白的表達
肺組織 α-SMA、OSM、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3 蛋白表達的 Western blot 結果見圖 6，半定量分析結果見圖 7。博來霉素組小鼠肺組織 α-SMA 蛋白表達水平較正常組明顯升高（1.26±0.93 比 0.76±0.11，P<0.01），吉非替尼組及厄羅替尼組小鼠肺組織 α-SMA 蛋白較博來霉素組明顯降低（0.86±0.10 比 1.26±0.93，P<0.01；0.89±0.14 比 1.26±0.93，P<0.01），與正常組無顯著差異（0.86±0.17 比 0.76±0.11，P=0.26；0.89±0.14 比 0.76±0.11，P =0.14）。結果見圖 7a。
博來霉素組小鼠肺組織 OSM 蛋白表達水平較正常組明顯升高（0.52±0.09 比 0.06±0.02，P<0.01），吉非替尼組及厄羅替尼組小鼠肺組織 OSM 蛋白表達水平較博來霉素組明顯降低（0.26±0.06 比 0.52±0.09，P <0.01，0.26±0.07 比 0.52±0.09， P <0.01），較正常組明顯升高（0.26±0.06 比 0.06±0.02， P <0.01，0.26±0.07 比 0.06±0.02， P <0.01）。結果見 圖 7b。
博來霉素組小鼠肺組織 p-JAK/JAK 蛋白表達水平較正常組明顯升高（2.13±0.08 比 0.50 ±0.07，P<0.01），吉非替尼組及厄羅替尼組小鼠肺組織 p-JAK/JAK 蛋白表達水平較博來霉素組明顯降低（1.39±0.07 比 2.13±0.08，P<0.01；1.38±0.09 比 2.13±0.08，P <0.01），較正常組明顯升高（1.39±0.07 比 0.50 ±0.07， P<0.01；1.38±0.09 比 0.50±0.07，P<0.01）。結果見圖 7c。
博來霉素組小鼠肺組織 p-STAT3/STAT3 蛋白表達水平較正常組明顯升高（0.67±0.05 比 0.52±0.11，P<0.05），吉非替尼組及厄羅替尼組小鼠肺組織 p-STAT3/STAT3 蛋白表達水平較博來霉素組明顯降低（0.50±0.12 比 0.67±0.05，P<0.05；0.52±0.09 比 0.67±0.05，P<0.05），與正常組無顯著差異（0.50±0.12 比 0.52±0.11，P=0.73，0.52±0.09 比 0.52±0.11，P=0.90）。結果見圖 7d。
圖6
肺組織 α-SMA、OSM、JAK1、p-JAK1、 STAT3、p-STAT3 蛋白表達的 Western blot 檢測像
圖7
肺組織 α-SMA、OSM、JAK1 、p-JAK1、STAT3、p-STAT3 蛋白的相對表達水平
a．α-SMA；b．OSM；c．p-JAK/JAK；d． p-STAT3/STAT3。與博來霉素組比較，*
3 討論
EGFR-TKI 是一種表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑，其競爭性結合 HER 家族（EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4）中的 EGFR 胞內段的酪氨酸激酶域，阻斷其與 ATP 結合，中斷 EGFR 信號通路，從而達到抑制細胞增殖和血管發生的目的。自其問世以來，肺癌的治療進入了一個全新的時代，因其卓越的療效，第一代 EGFR-TKI 中的代表性藥物厄羅替尼和吉非替尼分別在 2013 年及 2015 年獲得美國 FDA 批準作為具有 EGFR 敏感突變的非小細胞肺癌患者的一線治療方案[2]。肺纖維化本質上亦是一種類似肺癌的纖維增殖性疾病，其特點是肺泡上皮損傷后不恰當增殖，成纖維細胞持續活化，膠原及細胞外基質成分過度沉積，血管以類似腫瘤發生的方式雜亂生成等，因此抑制 EGFR 信號通路或許有助于肺纖維化的治療。本課題組前期研究已證實 EGFR-TKI 在緩解肺纖維化中的可行性，并比較了吉非替尼和厄羅替尼在緩解肺纖維化中的差異[5]，但 EGFR-TKI 緩解肺纖維化的作用機制及吉非替尼和厄羅替尼對肺纖維化下游通路的影響仍未進一步探究。
本研究采用博來霉素氣管內霧化的新方法制作肺纖維化的小鼠模型，以 20 mg·kg–1·d–1的吉非替尼或 25 mg·kg–1·d–1的厄羅替尼灌胃進行干預。由于目前還沒有一種公認的方法可以使肺纖維化在已經形成后逆轉，故雖然已有最新研究將對肺纖維化相關干預改在造模前 1 周及造模后 3 周進行[13]，本研究仍然沿用傳統的干預方案，將吉非替尼和厄羅替尼灌胃的干預持續于 2 周的整個造模過程中。有研究表明造模過程第 1 周主要是肺泡急性損傷階段，第 2 周小鼠已經開始出現肺纖維化[14]，而吉非替尼和厄羅替尼的干預是持續 2 周。因此，本研究所觀察到的 TKI 的數據是作用于肺泡急性損傷階段和肺纖維化兩個階段的。在吉非替尼和厄羅替尼對博來霉素所誘導的肺纖維化小鼠模型進行干預后，胸部 CT 顯示吉非替尼和厄羅替尼均能減少肺纖維化小鼠雙肺滲出及纖維化病灶，HE、Masson 染色結果顯示吉非替尼和厄羅替尼均能下調肺纖維化小鼠模型肺部的炎癥損傷評分和纖維化損傷評分，Western blot 結果顯示吉非替尼和厄羅替尼均能下調肺纖維化生物學標志物 α-SMA 的高表達。以上影像學、病理學、分子生物學的結果提示吉非替尼及厄羅替尼均能緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，二者的作用相當。
本課題組前期研究顯示吉非替尼打斷 EGFR 通路，抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的同時能下調 OSM，提示吉非替尼可能是通過下調 OSM 起到緩解肺纖維化的作用[15]。OSM 是一種耐熱、耐酸的單鏈糖蛋白，其相對分子質量為 28 000，1986 年首次從豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（phorbol myristate acetate，PMA）活化組織細胞淋巴瘤細胞（U937 細胞）培養上清中分離純化，既往主要是在腫瘤細胞中得到廣泛研究，近年來研究證明 OSM 在細胞外基質沉淀、細胞增殖、細胞存活、炎癥介導中起重要作用[16]，與皮膚、瘢痕、腎等組織纖維化有密切聯系[6-8]。上述研究表明 EGFR 及 OSM 均為纖維化相關性基因，但有關 EGFR 通路及 OSM 之間關系的研究甚少。一項關于乳腺癌的研究發現 OSM 與 EFG 在乳腺癌患者的腫瘤相關性巨噬細胞中有共表達[10]。而在關于惡性膠質瘤的研究則發現 OSM 受體與 EGF 受體能形成復合物，OSM 受體的缺失直接減弱 EGFR 信號通路的傳導[17]。有關 OSM 與 EGFR 通路的相互作用及上下游關系缺乏更多文獻，需要進一步研究。
本研究顯示博來霉素誘導的肺纖維化組小鼠中 OSM、p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3 均顯著上調，而兩種經典的第一代 EGFR-TKI 干預后均能下調上述蛋白的表達，實驗結果提示 OSM 及 JAK/STAT 通路可能為 EGFR 的下游通路。JAK/STAT 通路是近年來發現的一條由細胞因子刺激的信號通路，該通路參與細胞的增殖、分化、凋亡，且在免疫調節等許多重要的生物學過程中起重要作用。JAK/STAT 信號通路主要由三個成分組成，即非受體型酪氨酸激酶相關受體 GP130、酪氨酸激酶 JAK 和轉錄因子 STAT[18]。OSM 等白細胞介素-6 家族成員與 JAK/STAT 通路密切相關，研究發現 OSM 能通過 STAT3 介導促進肺成纖維細胞的趨化性、α-SMA的表達、收縮性及轉分化等肺纖維化過程中肺成纖維細胞的重要病理生理改變[16]。本課題組的研究成果及上述文獻表明 OSM 及 p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3 在博來霉素誘導的肺纖維化小鼠中的表達與肺纖維化程度呈正相關關系，而兩種經典的第一代 EGFR-TKI 藥物吉非替尼及厄羅替尼均能相同程度地緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，伴有上述蛋白的下調。我們推測，吉非替尼及厄羅替尼可能通過下調 OSM 的表達，抑制下游的 JAK/STAT 通路，從而緩解肺纖維化，兩種EGFR-TKI 下調 OSM 及 JAK/STAT 通路的作用無顯著差異，緩解肺纖維化的程度亦相近。
本研究結果為肺纖維化研究中 EGFR 通路及 OSM 通路的相互作用及上下游關系的闡明提供了部分實驗依據，且證明兩種 EGFR-TKI 在下調 OSM、抑制 JAK/STAT 通路及緩解肺纖維化的作用中無顯著差異。但該研究僅為初步研究，后續還需要通過構建 OSM 高表達質粒、OSM siRNA 及使用 JAK/STAT 通路特異性抑制劑進一步求證 EGFR 通路及 OSM 通路的上下游關系，以及它們在肺纖維化中的作用。進一步深入研究有希望尋找到肺纖維化過程中的有效致纖維化靶點進行干預，為肺纖維化的治療提供一種新的思路，創造良好的社會價值及醫療價值。
