引用本文： 樊梅, 鄧俊, 王宋平. 阿奇霉素對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺血管重構的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(2): 128-133. doi: 10.7507/1671-6205.201710006 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的以持續性呼吸道癥狀和氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病，呼吸道癥狀和氣流受限是由有毒顆粒或氣體導致的氣道和（或）肺泡異常引起的[1]。氣道、肺實質、肺血管炎癥是慢阻肺的主要特征，長期炎癥刺激和慢性缺氧可導致氣道重塑、肺實質破壞、肺血管收縮及重構，肺血管重構是肺動脈高壓、慢性肺源性心臟病的主要發病機制之一。
阿奇霉素是第二代大環內酯類抗生素，國外已有多項研究證實，長期小劑量使用阿奇霉素可減少慢阻肺的急性發作次數，提高患者的生活質量[2-4]，這表明阿奇霉素具有抗菌以外的其他作用。阿奇霉素可抑制中性粒細胞活性、促進中性粒細胞凋亡，改善巨噬細胞的吞噬能力，減少促炎因子白細胞介素（interleukin，IL）-8、粒-巨噬細胞集落刺激因子、IL-6 及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等的釋放[5-6]，這可能是其用于預防慢阻肺急性加重的重要依據。有研究報道阿奇霉素可抑制氣道平滑肌細胞 P38MAPK 途徑激活，導致平滑肌細胞釋放的血管內皮生長因子顯著下降[7]，表明阿奇霉素可能具有一定的抗血管重構作用。但阿奇霉素抗血管重構作用的研究多局限在體外實驗細胞水平，本研究旨在觀察阿奇霉素對慢阻肺大鼠肺血管重構及骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達的影響，探討其對慢阻肺肺血管重構的作用及可能機制，為拓寬臨床應用阿奇霉素治療慢阻肺提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康雄性 SD 大鼠 18 只，8 周齡，白色，體重（200±20）g，購自西南醫科大學動物實驗中心，飼養于恒溫空調房，室內溫度 20～24 ℃，相對濕度 40%～70%，自由攝食及飲水。
1.2 主要實驗試劑及器材
阿奇霉素（石藥集團歐意藥業有限公司）；脂多糖（美國 sigma 公司）；天下秀牌香煙（焦油量：10 mg，煙堿量：1.0 mg，一氧化碳量：11 mg。四川中煙工業有限責任公司）；大鼠 OPN ELISA 試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司）；維多利亞藍、VG 染液（ASPEN）；自制玻璃煙熏箱（60 cm×50 cm×30 cm）；OLYMPUS 光學顯微鏡（日本）；Image-pro-plus6.0 圖像分析軟件。
1.3 方法
1.3.1 慢阻肺大鼠模型建立
SD 大鼠適應性喂養 7 d 后，隨機分對照組（A 組）、慢阻肺模型組（B 組）、阿奇霉素藥物干預組（C 組）。B 組：采用熏香煙加氣管內滴注脂多糖的方法建立慢阻肺模型：第 1、14 d，經氣管注射脂多糖 200 μg（200 μg/100 μl），第 2～13 d、15～42 d 予以熏香煙 2 次/d（每次間隔時間 6 h 以上），每次 10 支，每次 1 h，共 6 周[8]，第 15 d 開始于煙熏前 1 h 行生理鹽水 2 ml 灌胃，共 4 周。C 組：經氣管內注入脂多糖的條件、煙熏條件及持續時間同 B 組，從第 15 d 起每天熏煙前 1 h 用阿奇霉素灌胃治療（劑量 50 mg/kg）4 周。A 組：不予被動吸煙，第 15 d 煙熏前 1 h 行生理鹽水 2 ml 灌胃，共 4 周。
1.3.2 血清采集
于實驗第 42 d 稱重所有大鼠，采用 1% 戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔麻醉后固定于操作臺，開胸后經心臟取血，以 2 000 r/min 離心 10 min，分離血清，–80 ℃ 保存。
1.3.3 病理標本制備
取新鮮右肺中葉組織（1 cm×1 cm×1 cm）用 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察以下指標：① 肺組織病理改變；② 選擇直徑在 50～500 μm 之間的肺動脈 5 支，半定量評價動脈壁及周圍炎性細胞浸潤程度。炎癥評分標準：無炎性細胞浸潤為 0 分；少許炎性細胞浸潤為 1 分；浸潤的炎性細胞較多但分布不均勻為 2 分；炎性細胞浸潤較多，分布均勻，但不聚集成團為 3 分；大量炎性細胞浸潤并聚集成團為 4 分。維多利亞藍+Van Gieson（VG）染色后利用圖像分析軟件測定肺血管重構指標：200 倍鏡下選擇直徑 50～100 μm 的肺腺泡內肺動脈總數并分類，計算肌性動脈（muscular artery，MA）、部分肌性動脈（partial muscular artery，PMA）和非肌性動脈（non-muscular artery，NMA）的構成比；400 倍高倍鏡下選擇 50～100 μm 的 MA 進行圖像分析，計算血管壁面積和血管總面積之比（WA%）、血管壁厚度與血管外徑長度之比（WT%）。
1.3.4 ELISA 法檢測血清 OPN 的含量
利用大鼠 OPN ELISA 試劑盒檢測血清 OPN 水平，按照操作說明書進行，將標準品配制成以下濃度：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0 ng/ml，標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml，分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，各組樣品設 2 個復孔，空白孔加標準品&樣品稀釋液 100 μl，余孔分別加標準品或待測樣品 100 μl，37 ℃ 孵育 90 min，倒去孔內液體，每個孔中加入生物素化抗體工作液 100 μl，37 ℃ 孵育 1 h，磷酸鹽緩沖液洗滌 3 次，每孔加酶結合物工作液 100 μl，37 ℃ 孵育 30 min，洗滌 5 次，每孔加底物溶液（TMB）90 μl，37 ℃ 避光孵育 15 min，最后加終止液 50 μl，終止反應，此時藍色立轉黃色，立即用酶標儀在 450 nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。
1.3.5 免疫組化法測定肺組織 OPN 的蛋白表達含量
采用即用型（Envison）快速酶免疫組化二步法，操作按試劑盒說明書進行。石蠟切片脫蠟至水，置于乙二胺四乙酸四鈉緩沖液中微波修復，置于 3% 過氧化氫溶液中，以阻斷內源性過氧化物酶，5% 胎牛血清白蛋白封閉 20 min，加入 OPN 一抗，4 ℃ 過夜，隨后加入相應種屬的二抗、二氨基聯苯胺溶液，顯微鏡控制顯色，蘇木素復染，1% 鹽酸酒精分化，氨水返藍，再經梯度酒精脫水干燥、二甲苯透明、中性樹膠封固。同時利用磷酸鹽緩沖液代替一抗染色做陰性對照。每張切片隨機選取 5 個高倍鏡視野，采用平均陽性染色百分比法分析免疫組化結果。
1.3.6 實時熒光定量 PCR 法檢測肺組織 OPN mRNA 的表達
取新鮮左肺組織，參照 Trizol Reagent 試劑盒提取總 RNA，將 RNA 逆轉錄為 cDNA，并進行 PCR 擴增目的基因，產物進行瓊脂糖凝膠膠電泳。擴增引物：① OPN 上游引物：5′-AGCACACAAGCAGACGTTTTG-3′，下游引物：5′-GCAACTGGGATGACCTTGATAG-3′。產物長度：206 bp。② 甘油醛-3-磷酸脫氫酶上游引物：5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下游引物：5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。產物長度：201 bp。熒光定量 PCR 反應程序為：95 ℃ 變性 15 s，58 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 45 s，循環 40 次。PCR 熔解曲線程序設定為：60 ℃ 升溫至 95 ℃ 的過程中，每 20 s 升溫 1 ℃，并檢測一次熒光信號。利用熒光定量 PCR 儀自動計算出每個樣本的 CT 值，OPN mRNA 的相對表達含量為 2–ΔΔCT。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件，數據以均數±標準差（
）表示，組間比較采用單因素方差分析，并采用 SNK-q 檢驗進行兩兩間比較。Pearson 相關分析進行各因素的相關性檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織病理改變
與 A 組比較，B 組大鼠肺組織可見氣道纖毛倒伏、脫落，纖毛柱狀上皮細胞壞死脫落，杯狀細胞增生；氣道管壁增厚，管腔狹窄，周圍可見大量炎細胞浸潤；肺泡擴張，肺泡間隔變薄、斷裂，相鄰肺泡融合成肺大泡；肺小動脈內膜增厚，平滑肌增生、肥大，管腔狹窄，血管周圍大量炎細胞浸潤。B、C 組大鼠肺組織病理改變均符合慢性阻塞性肺疾病病理改變，而 C 組上述改變較 B 組均有不同程度減輕。結果見圖 1。
圖1
各組肺組織病理檢查像（HE ×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
2.2 肺血管炎癥及肺血管重構評價
與 A 組比較，B 組和 C 組的肺血管炎癥情況比 A 組嚴重，C 組與 B 組比較，肺血管炎癥減輕（圖 2），各組炎癥評分見表 1。維多利亞藍+VG 染色后 MA 主要表現為具有內外雙層完整彈力板，PMA 表現為內層完整彈力板，外層部分彈力板，NMA 表現為單層彈力板（圖 3）；與 A 組比較，B、C 組 MA 明顯增多（P<0.05），B 組 MA 比 C 組明顯增多（P<0.05），見表 1。此外，B 組和 C 組肺血管重構指標 WA%、WT% 明顯高于 A 組（P<0.05），C 組 WT%、WA% 與 B 組比較明顯減低（P<0.05），差異有統計學意義，見表 1。
圖2
各組肺組織血管炎癥情況（HE ×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
圖3
肺血管病理檢查像（維多利亞藍+VG ×200）
a. NMA；b. MA；c. PMA
表1
各組大鼠肺血管炎癥及肺血管重構評價（
）
2.3 血清 OPN 含量
ELISA 檢測結果顯示，B、C 組血清 OPN 濃度明顯高于 A 組（P<0.01），C 組血清 OPN 濃度顯著低于 B 組（P<0.01）。結果見表 2。
2.4 免疫組化法測定肺組織 OPN 的蛋白表達含量
OPN 在肺組織主要表達于支氣管黏膜上皮、血管內皮、氣道和肺血管周圍的炎癥細胞，以胞漿著色為主，陽性產物為棕黃色沉淀。B、C 組肺組織 OPN 的表達高于 A 組（P<0.05），C 組肺組織 OPN 的表達低于 B 組（P<0.05），結果見圖 4、表 2。
圖4
各組大鼠肺組織 OPN 的表達（免疫組化法 ×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
2.5 實時熒光定量 PCR 法檢測肺組織 OPN mRNA 的表達
B、C 組 OPN mRNA 的含量顯著高于 A 組（P<0.01），C 組 OPN mRNA 的含量低于 B 組（P<0.01）。結果見表 2。
表2
各組大鼠血清 OPN 濃度、OPN 蛋白含量、OPN mRNA 表達量（
）
2.6 相關性分析
相關性分析結果顯示：肺組織 OPN 含量與肺血管炎癥評分、血管重塑指標 WT%、WA% 成正相關（r=0.836、0.654、0.796，P<0.005）；血清 OPN 含量與肺血管炎癥評分與 WT%、WA% 成正相關（r=0.922、0.730、0.810，P<0.005）；OPN mRNA 含量與肺血管炎癥評與 WT%、WA% 成正相關（r=0.982、0.812、0.778，P<0.005）。結果見圖 5。
圖5
相關性分析散點圖
3 討論
肺血管重構是肺血管管壁細胞外基質因低氧、高血流剪應力、炎癥等損傷因子發生的血管結構的改變，其主要病理特征為細胞外基質增多，膜平滑肌細胞肥大和增生，導致肺動脈管壁增厚和管腔狹窄[9]，是肺動脈高壓的主要發病機制之一。雖然肺動脈高壓常在慢阻肺疾病進展期才診斷，但肺血管改變已經發生在疾病早期階段患者和沒有氣流受限的吸煙者[10]。本實驗發現，煙熏聯合脂多糖刺激大鼠 6 周后已經發生肺血管重構，這與張偉等[11]報道一致。
近年來，大環內酯類抗生素的非抗菌作用得到了廣泛關注，尤其是其免疫調節作用，在支氣管擴張、彌漫性泛細支氣管炎、囊性纖維化、支氣管哮喘等呼吸系統疾病中的治療已受到了廣泛的關注和肯定[12-14]。本實驗研究結果顯示：阿奇霉素干預的大鼠肺血管周圍炎癥細胞數較沒有干預的大鼠明顯減少，這可能與阿奇霉素抑制中性粒細胞趨化性及活性、促進中性粒細胞凋亡，改善巨噬細胞的吞噬能力有關[6]。郭彩霞[15]發現阿奇霉素可通過抑制 TLR4/NF-κB 信號通路來減少慢阻肺大鼠釋放 TNF-α、IL-1β、IL-6 等細胞因子，從而減輕慢阻肺大鼠肺組織炎癥。Hodge 等[16]證實小劑量阿奇霉素可減少顆粒酶 B 的釋放，抑制氣道上皮細胞凋亡，減輕慢阻肺患者氣道再修復和氣道慢性炎癥，而氣道炎癥和氣道重塑逐漸進展可導致氣道狹窄、氣道阻塞、肺實質破壞與肺血管異常。Rosenberg 等[17]研究表明，OPN 是影響肺動脈高壓預后的獨立危險因素。OPN 作為一種促細胞黏附和遷移因子，有助于增強血管外膜成纖維細胞的增殖、遷移、侵襲性及表型轉換[18]，促進血管平滑肌細胞的增殖、遷移，并通過調節炎癥細胞的趨化作用引起血管炎癥，從而促進血管重塑[19]。OPN 還可通過 Akt1/AP-1 信號通路，誘導 MMP-2 的釋放，造成基質金屬蛋白酶系統失衡引起肺血管及氣道重塑[20]。本實驗發現阿奇霉素干預大鼠的肺血管 WT%、WA% 及 MA% 較沒有干預的大鼠明顯減少，且血清 OPN、肺組織 OPN 以及 mRNA OPN 含量也明顯降低，表明阿奇霉素可抑制肺血管重構，其機制可能與抑制 OPN 的表達有關。
綜上，本研究通過體內實驗證實了阿奇霉素可減輕肺血管炎癥和肺血管重構，其機制可能與抑制 OPN 的表達有關，為阿奇霉素用于治療慢阻肺提供了新的理論依據。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的以持續性呼吸道癥狀和氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病，呼吸道癥狀和氣流受限是由有毒顆粒或氣體導致的氣道和（或）肺泡異常引起的[1]。氣道、肺實質、肺血管炎癥是慢阻肺的主要特征，長期炎癥刺激和慢性缺氧可導致氣道重塑、肺實質破壞、肺血管收縮及重構，肺血管重構是肺動脈高壓、慢性肺源性心臟病的主要發病機制之一。
阿奇霉素是第二代大環內酯類抗生素，國外已有多項研究證實，長期小劑量使用阿奇霉素可減少慢阻肺的急性發作次數，提高患者的生活質量[2-4]，這表明阿奇霉素具有抗菌以外的其他作用。阿奇霉素可抑制中性粒細胞活性、促進中性粒細胞凋亡，改善巨噬細胞的吞噬能力，減少促炎因子白細胞介素（interleukin，IL）-8、粒-巨噬細胞集落刺激因子、IL-6 及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 等的釋放[5-6]，這可能是其用于預防慢阻肺急性加重的重要依據。有研究報道阿奇霉素可抑制氣道平滑肌細胞 P38MAPK 途徑激活，導致平滑肌細胞釋放的血管內皮生長因子顯著下降[7]，表明阿奇霉素可能具有一定的抗血管重構作用。但阿奇霉素抗血管重構作用的研究多局限在體外實驗細胞水平，本研究旨在觀察阿奇霉素對慢阻肺大鼠肺血管重構及骨橋蛋白（osteopontin，OPN）表達的影響，探討其對慢阻肺肺血管重構的作用及可能機制，為拓寬臨床應用阿奇霉素治療慢阻肺提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康雄性 SD 大鼠 18 只，8 周齡，白色，體重（200±20）g，購自西南醫科大學動物實驗中心，飼養于恒溫空調房，室內溫度 20～24 ℃，相對濕度 40%～70%，自由攝食及飲水。
1.2 主要實驗試劑及器材
阿奇霉素（石藥集團歐意藥業有限公司）；脂多糖（美國 sigma 公司）；天下秀牌香煙（焦油量：10 mg，煙堿量：1.0 mg，一氧化碳量：11 mg。四川中煙工業有限責任公司）；大鼠 OPN ELISA 試劑盒（伊萊瑞特生物科技有限公司）；維多利亞藍、VG 染液（ASPEN）；自制玻璃煙熏箱（60 cm×50 cm×30 cm）；OLYMPUS 光學顯微鏡（日本）；Image-pro-plus6.0 圖像分析軟件。
1.3 方法
1.3.1 慢阻肺大鼠模型建立
SD 大鼠適應性喂養 7 d 后，隨機分對照組（A 組）、慢阻肺模型組（B 組）、阿奇霉素藥物干預組（C 組）。B 組：采用熏香煙加氣管內滴注脂多糖的方法建立慢阻肺模型：第 1、14 d，經氣管注射脂多糖 200 μg（200 μg/100 μl），第 2～13 d、15～42 d 予以熏香煙 2 次/d（每次間隔時間 6 h 以上），每次 10 支，每次 1 h，共 6 周[8]，第 15 d 開始于煙熏前 1 h 行生理鹽水 2 ml 灌胃，共 4 周。C 組：經氣管內注入脂多糖的條件、煙熏條件及持續時間同 B 組，從第 15 d 起每天熏煙前 1 h 用阿奇霉素灌胃治療（劑量 50 mg/kg）4 周。A 組：不予被動吸煙，第 15 d 煙熏前 1 h 行生理鹽水 2 ml 灌胃，共 4 周。
1.3.2 血清采集
于實驗第 42 d 稱重所有大鼠，采用 1% 戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔麻醉后固定于操作臺，開胸后經心臟取血，以 2 000 r/min 離心 10 min，分離血清，–80 ℃ 保存。
1.3.3 病理標本制備
取新鮮右肺中葉組織（1 cm×1 cm×1 cm）用 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察以下指標：① 肺組織病理改變；② 選擇直徑在 50～500 μm 之間的肺動脈 5 支，半定量評價動脈壁及周圍炎性細胞浸潤程度。炎癥評分標準：無炎性細胞浸潤為 0 分；少許炎性細胞浸潤為 1 分；浸潤的炎性細胞較多但分布不均勻為 2 分；炎性細胞浸潤較多，分布均勻，但不聚集成團為 3 分；大量炎性細胞浸潤并聚集成團為 4 分。維多利亞藍+Van Gieson（VG）染色后利用圖像分析軟件測定肺血管重構指標：200 倍鏡下選擇直徑 50～100 μm 的肺腺泡內肺動脈總數并分類，計算肌性動脈（muscular artery，MA）、部分肌性動脈（partial muscular artery，PMA）和非肌性動脈（non-muscular artery，NMA）的構成比；400 倍高倍鏡下選擇 50～100 μm 的 MA 進行圖像分析，計算血管壁面積和血管總面積之比（WA%）、血管壁厚度與血管外徑長度之比（WT%）。
1.3.4 ELISA 法檢測血清 OPN 的含量
利用大鼠 OPN ELISA 試劑盒檢測血清 OPN 水平，按照操作說明書進行，將標準品配制成以下濃度：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0 ng/ml，標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml，分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，各組樣品設 2 個復孔，空白孔加標準品&樣品稀釋液 100 μl，余孔分別加標準品或待測樣品 100 μl，37 ℃ 孵育 90 min，倒去孔內液體，每個孔中加入生物素化抗體工作液 100 μl，37 ℃ 孵育 1 h，磷酸鹽緩沖液洗滌 3 次，每孔加酶結合物工作液 100 μl，37 ℃ 孵育 30 min，洗滌 5 次，每孔加底物溶液（TMB）90 μl，37 ℃ 避光孵育 15 min，最后加終止液 50 μl，終止反應，此時藍色立轉黃色，立即用酶標儀在 450 nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。
1.3.5 免疫組化法測定肺組織 OPN 的蛋白表達含量
采用即用型（Envison）快速酶免疫組化二步法，操作按試劑盒說明書進行。石蠟切片脫蠟至水，置于乙二胺四乙酸四鈉緩沖液中微波修復，置于 3% 過氧化氫溶液中，以阻斷內源性過氧化物酶，5% 胎牛血清白蛋白封閉 20 min，加入 OPN 一抗，4 ℃ 過夜，隨后加入相應種屬的二抗、二氨基聯苯胺溶液，顯微鏡控制顯色，蘇木素復染，1% 鹽酸酒精分化，氨水返藍，再經梯度酒精脫水干燥、二甲苯透明、中性樹膠封固。同時利用磷酸鹽緩沖液代替一抗染色做陰性對照。每張切片隨機選取 5 個高倍鏡視野，采用平均陽性染色百分比法分析免疫組化結果。
1.3.6 實時熒光定量 PCR 法檢測肺組織 OPN mRNA 的表達
取新鮮左肺組織，參照 Trizol Reagent 試劑盒提取總 RNA，將 RNA 逆轉錄為 cDNA，并進行 PCR 擴增目的基因，產物進行瓊脂糖凝膠膠電泳。擴增引物：① OPN 上游引物：5′-AGCACACAAGCAGACGTTTTG-3′，下游引物：5′-GCAACTGGGATGACCTTGATAG-3′。產物長度：206 bp。② 甘油醛-3-磷酸脫氫酶上游引物：5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下游引物：5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。產物長度：201 bp。熒光定量 PCR 反應程序為：95 ℃ 變性 15 s，58 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 45 s，循環 40 次。PCR 熔解曲線程序設定為：60 ℃ 升溫至 95 ℃ 的過程中，每 20 s 升溫 1 ℃，并檢測一次熒光信號。利用熒光定量 PCR 儀自動計算出每個樣本的 CT 值，OPN mRNA 的相對表達含量為 2–ΔΔCT。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件，數據以均數±標準差（
）表示，組間比較采用單因素方差分析，并采用 SNK-q 檢驗進行兩兩間比較。Pearson 相關分析進行各因素的相關性檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織病理改變
與 A 組比較，B 組大鼠肺組織可見氣道纖毛倒伏、脫落，纖毛柱狀上皮細胞壞死脫落，杯狀細胞增生；氣道管壁增厚，管腔狹窄，周圍可見大量炎細胞浸潤；肺泡擴張，肺泡間隔變薄、斷裂，相鄰肺泡融合成肺大泡；肺小動脈內膜增厚，平滑肌增生、肥大，管腔狹窄，血管周圍大量炎細胞浸潤。B、C 組大鼠肺組織病理改變均符合慢性阻塞性肺疾病病理改變，而 C 組上述改變較 B 組均有不同程度減輕。結果見圖 1。
圖1
各組肺組織病理檢查像（HE ×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
2.2 肺血管炎癥及肺血管重構評價
與 A 組比較，B 組和 C 組的肺血管炎癥情況比 A 組嚴重，C 組與 B 組比較，肺血管炎癥減輕（圖 2），各組炎癥評分見表 1。維多利亞藍+VG 染色后 MA 主要表現為具有內外雙層完整彈力板，PMA 表現為內層完整彈力板，外層部分彈力板，NMA 表現為單層彈力板（圖 3）；與 A 組比較，B、C 組 MA 明顯增多（P<0.05），B 組 MA 比 C 組明顯增多（P<0.05），見表 1。此外，B 組和 C 組肺血管重構指標 WA%、WT% 明顯高于 A 組（P<0.05），C 組 WT%、WA% 與 B 組比較明顯減低（P<0.05），差異有統計學意義，見表 1。
圖2
各組肺組織血管炎癥情況（HE ×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
圖3
肺血管病理檢查像（維多利亞藍+VG ×200）
a. NMA；b. MA；c. PMA
表1
各組大鼠肺血管炎癥及肺血管重構評價（
）
2.3 血清 OPN 含量
ELISA 檢測結果顯示，B、C 組血清 OPN 濃度明顯高于 A 組（P<0.01），C 組血清 OPN 濃度顯著低于 B 組（P<0.01）。結果見表 2。
2.4 免疫組化法測定肺組織 OPN 的蛋白表達含量
OPN 在肺組織主要表達于支氣管黏膜上皮、血管內皮、氣道和肺血管周圍的炎癥細胞，以胞漿著色為主，陽性產物為棕黃色沉淀。B、C 組肺組織 OPN 的表達高于 A 組（P<0.05），C 組肺組織 OPN 的表達低于 B 組（P<0.05），結果見圖 4、表 2。
圖4
各組大鼠肺組織 OPN 的表達（免疫組化法 ×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
2.5 實時熒光定量 PCR 法檢測肺組織 OPN mRNA 的表達
B、C 組 OPN mRNA 的含量顯著高于 A 組（P<0.01），C 組 OPN mRNA 的含量低于 B 組（P<0.01）。結果見表 2。
表2
各組大鼠血清 OPN 濃度、OPN 蛋白含量、OPN mRNA 表達量（
）
2.6 相關性分析
相關性分析結果顯示：肺組織 OPN 含量與肺血管炎癥評分、血管重塑指標 WT%、WA% 成正相關（r=0.836、0.654、0.796，P<0.005）；血清 OPN 含量與肺血管炎癥評分與 WT%、WA% 成正相關（r=0.922、0.730、0.810，P<0.005）；OPN mRNA 含量與肺血管炎癥評與 WT%、WA% 成正相關（r=0.982、0.812、0.778，P<0.005）。結果見圖 5。
圖5
相關性分析散點圖
3 討論
肺血管重構是肺血管管壁細胞外基質因低氧、高血流剪應力、炎癥等損傷因子發生的血管結構的改變，其主要病理特征為細胞外基質增多，膜平滑肌細胞肥大和增生，導致肺動脈管壁增厚和管腔狹窄[9]，是肺動脈高壓的主要發病機制之一。雖然肺動脈高壓常在慢阻肺疾病進展期才診斷，但肺血管改變已經發生在疾病早期階段患者和沒有氣流受限的吸煙者[10]。本實驗發現，煙熏聯合脂多糖刺激大鼠 6 周后已經發生肺血管重構，這與張偉等[11]報道一致。
近年來，大環內酯類抗生素的非抗菌作用得到了廣泛關注，尤其是其免疫調節作用，在支氣管擴張、彌漫性泛細支氣管炎、囊性纖維化、支氣管哮喘等呼吸系統疾病中的治療已受到了廣泛的關注和肯定[12-14]。本實驗研究結果顯示：阿奇霉素干預的大鼠肺血管周圍炎癥細胞數較沒有干預的大鼠明顯減少，這可能與阿奇霉素抑制中性粒細胞趨化性及活性、促進中性粒細胞凋亡，改善巨噬細胞的吞噬能力有關[6]。郭彩霞[15]發現阿奇霉素可通過抑制 TLR4/NF-κB 信號通路來減少慢阻肺大鼠釋放 TNF-α、IL-1β、IL-6 等細胞因子，從而減輕慢阻肺大鼠肺組織炎癥。Hodge 等[16]證實小劑量阿奇霉素可減少顆粒酶 B 的釋放，抑制氣道上皮細胞凋亡，減輕慢阻肺患者氣道再修復和氣道慢性炎癥，而氣道炎癥和氣道重塑逐漸進展可導致氣道狹窄、氣道阻塞、肺實質破壞與肺血管異常。Rosenberg 等[17]研究表明，OPN 是影響肺動脈高壓預后的獨立危險因素。OPN 作為一種促細胞黏附和遷移因子，有助于增強血管外膜成纖維細胞的增殖、遷移、侵襲性及表型轉換[18]，促進血管平滑肌細胞的增殖、遷移，并通過調節炎癥細胞的趨化作用引起血管炎癥，從而促進血管重塑[19]。OPN 還可通過 Akt1/AP-1 信號通路，誘導 MMP-2 的釋放，造成基質金屬蛋白酶系統失衡引起肺血管及氣道重塑[20]。本實驗發現阿奇霉素干預大鼠的肺血管 WT%、WA% 及 MA% 較沒有干預的大鼠明顯減少，且血清 OPN、肺組織 OPN 以及 mRNA OPN 含量也明顯降低，表明阿奇霉素可抑制肺血管重構，其機制可能與抑制 OPN 的表達有關。
綜上，本研究通過體內實驗證實了阿奇霉素可減輕肺血管炎癥和肺血管重構，其機制可能與抑制 OPN 的表達有關，為阿奇霉素用于治療慢阻肺提供了新的理論依據。
