引用本文： 羅汶鑫, 李為民. 肺癌的表觀遺傳學研究進展及其臨床意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(3): 313-318. doi: 10.7507/1671-6205.201709012 復制
肺癌是目前中國及全世界范圍內發病率與死亡率最高的惡性腫瘤，其中 85% 的病例為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），主要包括肺腺癌和肺鱗癌[1-3]。肺癌的總體 5 年生存率約為 18%，其根本原因在于肺癌的早期診斷困難，超過 70% 的患者確診時已處于晚期階段，缺乏有效的治療措施[4]。因此，深入研究肺癌的發生發展機制對肺癌的早期診斷及精準治療有著重要意義。長期以來，人們一直認為遺傳變異對肺癌的形成具有非常重要的作用。研究也已證實肺腺癌及肺鱗癌存在多種驅動基因變異，前者包括表皮生長因子受體基因（EGFR）突變、間變性淋巴瘤激酶基因（ALK）重排和 PIK3CA 突變等，后者有成纖維細胞生長因子受體 1 基因（FGFR1）擴增、磷酸酯酶張力蛋白同源物基因（PTEN） 突變和盤狀結構域受體 2（DDR2）突變等[5]。然而，近年來越來越多的證據表明，肺癌的發生發展不僅取決于遺傳變異，同時也受表觀遺傳異常的影響[6]。“表觀遺傳學”的概念是由 C. H. Waddinton 于 1939 年最早提出，后來被統一定義為：在基因組 DNA 序列不變的情況下，基因的表達及功能發生可逆的、可遺傳的變化[3]。表觀遺傳能從多個水平調控基因的表達，包括 DNA 水平上的 DNA 甲基化修飾，RNA 水平上的非編碼 RNA 調控，蛋白質水平上的組蛋白修飾，以及染色質水平上的染色質重塑[7]。本文將對表觀遺傳學在肺癌中的研究進展及其臨床意義進行闡述。
1 DNA 甲基化
1.1 DNA 甲基化的機制與意義
DNA 甲基化是指在 DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，CpG 二聯核苷酸上的胞嘧啶第 5 位碳原子與甲基間共價結合，被修飾為 5-甲基胞嘧啶。人類的 CpG 以兩種形式存在：一種是分散于基因組 DNA 中；另一種是高度聚集形成 CpG 島，存在于多種基因的啟動子區域或第 1 外顯子區域。目前已發現在哺乳動物細胞中有三種具有催化活性的 DNMT：DNMT1 主要維持 DNA 甲基化狀態，DNMT3A 和 DNMT3B 則以催化新的 DNA 甲基化為主[8]。健康人基因組中，CpG 島中的 CpG 位點通常處于非甲基化狀態，而在 CpG 島外的 CpG 位點則是甲基化的。當腫瘤發生時，CpG 島以外的 CpG 位點非甲基化程度增加，而 CpG 島中的 CpG 位點則呈高度甲基化狀態，引起基因組整體甲基化水平降低，以及某些基因 CpG 島局部甲基化水平異常升高，從而導致基因組的不穩定，如染色體的不穩定、原癌基因的活化以及抑癌基因的沉默[7, 9]。
1.2 DNA 甲基化在肺癌中的研究
DNA 甲基化是目前肺癌中研究得最廣泛、也最深入的表觀遺傳調控機制。抑癌基因、修復基因等重要蛋白編碼基因啟動子區域 CpG 島的局部高度甲基化發生于腫瘤的癌前病變或癌變早期；而且全基因組的低甲基化也隨著腫瘤發生而出現，并隨著腫瘤惡性程度的增加而顯著[3, 8]。因此，DNA 甲基化的檢測可以用于腫瘤的早期診斷及預后判斷。目前，已發現肺癌中存在多種基因處于高度甲基化狀態，這些基因涉及重要的細胞功能，包括DNA 修復（MGMT、hMLH1、MSH2），凋亡（DAPK、CASP8、TNFRSF6、DR4、DR5），細胞周期調控（P16、PTEN、RASSF1A），細胞侵襲與轉移（CDH1、CDH13、TSLC1），以及轉錄調控（APC、RARβ-2、SHOX2、RUNX3）等[8]。Selamat 等[10]發現在肺腺癌形成的不同階段（包括癌旁正常組織、非典型瘤樣增生、原位腺癌及浸潤性腺癌）相關基因的甲基化狀態也不同。Sandoval 等[11]用 DNA 甲基化微陣列芯片檢測了Ⅰ期 NSCLC 腫瘤組織的 450 000 個 CpG 位點，發現 HIST1H4F、PCDHGB6、NPBWR1、ALX1 和 HOXA9 這 5 個基因的高度甲基化與患者的術后無復發生存期呈顯著負相關。此外，肺癌的形成伴隨著 DNMT 的過表達。吸煙者肺癌中存在著 DNMT1 的過表達，且與預后不良呈相關性[12]。DNMT3A 的過表達與肺腺癌非浸潤性亞型存在相關性，可作為肺腺癌預后良好的一個預測指標[13]。
隨著 DNA 甲基化檢測技術的發展，現今肺癌 DNA 甲基化的研究更多地集中于液體活檢 DNA 甲基化。研究已證實，在肺癌患者血漿、痰液、支氣管肺泡灌洗液等體液中可檢測到相關基因啟動子 CpG 島甲基化狀態的異常變化，使其可成為無創性或微創性肺癌早期診斷的分子標志物[14-17]。Diaz-Lagares 等[17]發現采用焦磷酸測序法聯合檢測肺癌患者的支氣管肺泡灌洗液和痰液中的 BCAT1、CDO1、TRIM58 和 ZNF177 四個基因啟動子甲基化狀態，可獲得理想的診斷價值（受試者工作特征曲線下面積分別為 0.85 和 0.93）。近期的另一項研究中，Hulbert 等[18]采用甲基化特異性 PCR 方法檢測了 150 例早期肺癌（Ⅰ期和Ⅱa 期）患者和 60 例健康者的血漿和痰液中的腫瘤特異性基因啟動子甲基化狀態，發現聯合檢測痰液中三個相關基因（TAC1、HOXA17 和 SOX17）啟動子甲基化狀態用于早期肺癌診斷的特異性及敏感性分別為 98% 和 71%；聯合檢測血漿中 3 個相關基因啟動子甲基化狀態用于早期肺癌診斷的特異性及敏感性分別為 93% 和 62%。
2 組蛋白修飾
2.1 組蛋白修飾的機制與意義
除 DNA 甲基化修飾外，受各種修飾的組蛋白在基因表達和肺癌的發生發展中也起著重要的作用。核小體是構成染色質的基本單位，一個核小體由組蛋白 H2A、H2B、H3、H4 各 2 個組成的八聚體和纏繞在其外部長約 147 bp 的 DNA 組成。組蛋白不僅能保護 DNA 結構、保護遺傳信息，也能參與基因表達調控[4]。組蛋白游離在外的氨基末端可以被多種酶進行各種翻譯后修飾（包括乙酰化、甲基化、磷酸化及泛素化等），形成特定的“組蛋白密碼”，改變局部染色質結構的“開放”或“關閉”狀態，或決定何種蛋白結合到特定 DNA 區域，從而調控 DNA 的多種功能，包括轉錄及損傷修復等[19-20]。
2.2 組蛋白修飾在肺癌中的研究
肺癌中調控組蛋白功能最為突出的兩種機制為組蛋白乙酰化和甲基化。組蛋白乙酰化修飾具有較高的動態性，由組蛋白乙酰轉移酶（HATs）和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）協同調控，發生在組蛋白氨基末端特定賴氨酸殘基上。組蛋白甲基化修飾則由組蛋白甲基轉移酶（HMT）催化完成，發生在組蛋白氨基末端某些賴氨酸和精氨酸殘基上，組蛋白賴氨酸甲基化是一種基因表達調控較為穩定的標記，而精氨酸甲基化是一種相對動態的標記[21]。Van Den Broeck 等[22]采用免疫組化方法研究了肺癌組織及其配對正常組織中組蛋白 H4 的修飾模式，發現肺癌組織表現出異常的組蛋白 H4 修飾模式，包括 H4K5/H4K8 的高乙酰化，H4K12/H4K16 的低乙酰化，以及 H4K20 三甲基化（H4K20me3）的缺失，提示組蛋白 H4 修飾在肺癌的發生中起著重要作用。他們還發現 H4K20me3 存在于 67% 的鱗癌，且出現在鱗癌癌前病變中，且隨疾病進展，其表達量減少，而在腺癌中，28% 出現 H4K20me3 的下調，但它出現于預后較差的 Ⅰ 期腺癌。這提示 H4K20me3 可作為肺鱗癌的早期診斷標志物，還可能成為肺腺癌的預后因子[22]。Seligson 等[23]發現，肺腺癌中組蛋白乙酰化修飾水平整體低下預示其侵襲性高，預后差。此外，HDAC-I 的高表達與肺腺癌的良好預后呈顯著相關性[24]。
3 RNA 調控
3.1 信使 RNA 修飾
N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是現今最常見的真核生物信使 RNA（messenger RNA，mRNA）內部修飾，是在轉錄后由 m6A 甲基轉移酶在序列的 G（m6A）C 或 A（m6A）C 部位上加工形成的，對于細胞的存活和發育必不可少[25]。其他 mRNA 修飾有 N1-甲基腺苷（m1A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）和假尿嘧啶，它們與 m6A 一起形成表觀轉錄組（epitranscriptome），共同編碼、控制蛋白質合成[26]。
m6A 脫甲基酶的發現以及整體轉錄組范圍內 m6A 修飾的分析證明了 m6A 甲基化修飾是一種可逆和動態的 RNA 修飾，可影響細胞中數千個 mRNA 和非編碼 RNA[27-28]。m6A 的甲基化是由甲基轉移酶復合物（MTC，包括 METTL3 和 METTL14）及其輔助因子（WTAP）催化完成；而 m6A 的脫甲基則被 YTH 結構域家族蛋白選擇性識別，由兩種 m6A 脫甲基酶（FTO 和 ALKBH5）催化完成[27]。Lin 等[29]發現，METTL3 在人類肺腺癌細胞系中表達上調，起著促進腫瘤細胞生長、存活和侵襲的致癌作用。值得注意的是，METTL3 通過與翻譯起始機制的相互作用促進其靶 mRNA 轉錄本（如 EGFR 和 TAZ）的翻譯，其方式獨立于其甲基轉移酶活性。魏文平等[30]檢測了 METTL3 在 NSCLC 組織中的表達水平，發現癌組織中 METTL3 較癌旁組織呈顯著高表達，且高 METTL3 表達的患者預后較差。這提示 METTL3 具有作為 NSCLC 診斷及治療靶點的潛能。
3.2 非編碼 RNA 調控
人類基因組中，具有編碼蛋白質功能的基因僅占全部基因組序列的 2%，其余 98% 的序列中絕大多數被轉錄成非編碼 RNA，而不被翻譯成蛋白質。這些非編碼 RNA 根據分子大小可分為短鏈非編碼 RNA 和長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs），在表觀遺傳調控中發揮重要的作用[31]。
微小 RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一種大小為 19～22 個核苷酸的短鏈非編碼 RNA，可通過結合靶 mRNAs 中的 3' UTR 結合，從而降解靶 mRNAs 或阻遏靶 mRNAs 的翻譯[32]。miRNAs 能夠調控多個腫瘤相關基因的表達，根據 miRNAs 的靶基因的功能，可以將其分為具有癌基因或抑癌基因作用的兩類[33]。目前已發現超過 1 000 個 miRNAs，它們調控超過 1/3 的 mRNAs。大量研究發現，miRNAs 的異常表達與肺癌的發生發展相關，如 let-7a miRNA 可通過靶向 KRAS 和 C-Myc 抑制腫瘤的生長[34-35]，miRNA-17 靶向 TGFβR2，進而抑制 NSCLC 細胞的遷移性[36]。
MiRNAs 可穩定存在于外周血、痰液及其他體液中，使得液體活檢 miRNAs 檢測有望成為肺癌早期診斷及預后判斷的分子標志物[2]。Heegaard 等[37]采用 RT-PCR 方法檢測了早期 NSCLC 患者及正常健康人血漿中的 miRNAs 水平，發現早期 NSCLC 具有獨特的循環 miRNAs 表達模式。Yu 等[38]對比了肺腺癌患者和正常健康者痰液樣本中的 miRNAs 水平，發現聯合檢測 4 個 miRNAs（miRNA-21、miRNA-486、miRNA-375 和 miRNA-200b）診斷肺腺癌的敏感性為 80.6%，特異性為 91.7%。此外，循環 miRNAs 檢測還可用于預測化療和分子靶向治療的療效。Cui 等[39]檢測了晚期 NSCLC 患者血清中miRNAs 水平，發現 miR-125b 表達上調者對順鉑的治療不敏感且預后較差。Zhao 等[40]發現循環 miRNAs可預測 EGFR 突變狀態、吉非替尼敏感性及預后。
lncRNAs 是長度超過 200 個核苷酸的非編碼 RNA，在多個層面上（轉錄、轉錄后等）調控腫瘤相關基因的表達[8]。目前，已發現的與肺癌相關的 lnRNAs 有 MALAT1、NEAT1、ANRIL、H19、HOTAIR、HOTTIP 和 MEG3 等[41]。其中，肺腺癌轉移相關轉錄本 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在許多腫瘤中表達上調，但在肺癌中表達具有較高特異性，被認定為 NSCLC，特別是肺腺癌轉移和預后不良的特異性分子標志物[42]。
4 肺癌表觀遺傳治療的方向及所面臨的挑戰
表觀遺傳調控具有潛在可逆性，因此腫瘤表觀遺傳治療已成為近年來的一個熱門研究新領域。腫瘤表觀遺傳治療的有效性不僅在細胞系和動物研究中得到了證實，在某些臨床試驗也獲得了肯定結果。
4.1 DNA 甲基轉移酶抑制劑
DNA 甲基轉移酶抑制劑（DNA methyltransferase inhibitors，DNMTIs）是一類胞嘧啶核苷類似物，通過在 DNA 復制過程中取代胞嘧啶，與 DNMT 共價結合抑制該酶的活性，進而降低 DNA 甲基化水平，恢復抑癌基因等重要基因的表達，逆轉腫瘤細胞的表型[43]。DNMTIs 的代表藥物有阿扎胞苷（azacitidine，AZA）和地西他濱（decitabine，DAC），它們已被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于急性髓系白血病及骨髓增生異常綜合征的治療，并取得一定療效[44-45]。但它們在應用于肺癌等實體腫瘤的臨床試驗中效果還不理想[46]。這主要是因為這兩種藥僅作用于細胞增殖的 S 期，且在水溶液中不穩定，在體內迅速被胞苷脫氨酶分解。對于增殖指數較小的實體腫瘤治療，無法實現藥物在體內長時間低濃度的持續暴露，這大大限制了其在實體瘤中的療效[44]。因此，如何優化 DNMTIs 的藥物代謝動力學是目前新藥開發的策略之一。近期，研究者們開發出了一個較新的復合物 SGI-110，該復合物在體內不被胞苷脫氨酶分解，且去甲基化效能更強，但其仍存在水溶液中不穩定的缺點[47]。臨床試驗證實，SGI-110 是目前所有 DNMTIs 中效能最強、最具前景的藥物[48]。
4.2 組蛋白去乙酰化酶抑制劑
組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACIs）通過抑制 HDAC 的活性，誘導組蛋白高度乙酰化，除可直接調控細胞凋亡和分化相關蛋白的表達外，還可促進 DNMT1 降解[49]。已知的 HDACIs 主要包括伏立諾他（vorinostat，SAHA）、羅咪酯肽（Romidepsin，FK228）、貝利司他（Belinostat，PXD101）和恩替諾特（Entinostat，MS275）等，其中前三者均已被美國 FDA 批準用于 T 淋巴細胞瘤的治療[50]。與在血液惡性腫瘤中取得的顯著療效不同，HDACIs 在肺癌等實體腫瘤的臨床試驗結果令人失望[51]。這些研究共同指出，由于較大的藥物劑量需求，不良反應嚴重，HDACIs 尚不能滿足臨床實體腫瘤治療的需要[52-53]。
4.3 DNA 甲基轉移酶抑制劑與組蛋白去乙酰化酶抑制劑的聯合應用
由于 DNMTIs 和 HDACIs 在腫瘤表觀遺傳治療中的作用機制不同，且單藥應用于肺癌等實體腫瘤時效果均不佳，越來越多的研究也致力于兩者的聯合應用[54]。美國霍普金斯大學癌癥研究中心進行的一項聯合阿扎胞苷和恩替諾特應用于難治性晚期 NSCLC 的Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗取得了令人振奮的結果。45 例患者中，1 例患者獲得了完全緩解，1 例部分緩解患者治療后 22 個月無腫瘤進展，10 例患者病情穩定至少 3 個月[55]。目前，還有一項聯合阿扎胞苷和恩替諾特應用于Ⅰ期 NSCLC 患者的術后輔助治療的 Ⅱ 期臨床試驗（NCT01207726）正在進行中。
4.4 表觀遺傳治療與其他治療的聯合應用
一項聯合伏立諾他和卡鉑及紫杉醇治療晚期 NSCLC 的 Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗顯示，與安慰劑組對比，客觀緩解率、疾病無進展期和整體生存期均明顯改善[56]。另一研究顯示，聯合伏立諾他和吉非替尼治療 EGFR 敏感型晚期 NSCLC 患者，可增強吉非替尼的效用[57]。目前，FDA 已批準了抗 PD-1 和抗 PD-L1 藥物在 NSCLC 中的臨床應用[58]。但臨床上許多患者對該治療不敏感，聯合治療可能成為未來的一種選擇。在一項聯合表觀遺傳治療與免疫治療的研究中，5 例接受了低劑量表觀遺傳藥物治療后進展的晚期 NSCLC 患者入組了抗 PD-1 和抗 PD-L1 免疫治療，與整體僅有的 20% 緩解率相比，該 5 例患者全部實現了臨床緩解，而且其中 3 例患者按照 RECIST 標準實現了高級反應[55, 59]。越來越多的研究顯示，表觀遺傳藥物引起的表觀遺傳學改變可增強腫瘤對其他藥物的敏感性。特別是 DNMTIs，可通過內源性逆轉錄病毒和癌-睪丸抗原相關基因的去甲基化來上調上皮性腫瘤細胞的免疫信號[60]。
4.5 其他新型抗腫瘤表觀遺傳藥物
除了針對 DNA 甲基化和組蛋白乙酰化修飾的的 DNMTIs 和 HDACIs，近 5 年來也相繼出現了通過新的表觀遺傳調控機制開發的藥物。這些新機制包括 bromodomain and extra terminal protein（BET）抑制劑、異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變抑制劑、賴氨酸特異性脫甲基酶 1（LSD1/KDM1A）抑制劑和 HMT 抑制劑等。
BET 蛋白是一類可以和乙酰化組蛋白結合的表觀遺傳學調控蛋白，它控制 c-MYC 等促生長、抗凋亡靶基因的轉錄，已在血液系統惡性腫瘤中顯示出有效的抗腫瘤增殖作用[61]。它的抗腫瘤作用在人類肺腺癌細胞系實驗中也得到了證實，用 BET 抑制劑 JQ1 處理細胞后，后者表現出 c-MYC 的表達下調[62]。另一研究顯示，JQ1 可通過抑制 MYC 的功能，抑制 KRAS 突變型/LKB1 野生型 NSCLC 小鼠模型的腫瘤生長。這都提示 BET 抑制劑可能成為治療 NSCLC 的另一有效藥物。目前，一項 BET 抑制劑（GSK525762）治療包括肺癌等實體腫瘤的Ⅰ期臨床試驗（NCT01587703）正在進行中。
IDH 是三羧酸循環中的一種關鍵酶，它將異檸檬酸轉化為 α-酮戊二酸（α-KG）。IDH 突變將會導致其下游代謝產物 R-2-羥基戊二酸（R-2-HG）水平升高，導致 DNA 甲基化和組蛋白甲基化水平的改變，進而改變轉錄調控而促進腫瘤的發生發展[63-65]。近年來，在包括急性髓性白血病、膠質瘤和肺癌在內的多種腫瘤中發現了 IDH1/2 突變[65-68]。2017 年 8 月，FDA 批準了全球首個 IDH2 抑制劑 Enasidenib 上市，用于治療攜帶 IDH2 突變的急性髓系白血病[69]。有研究發現，IDH 抑制劑 DTDQ 在人類 NSCLC-A549 細胞系中，可使 RK 和 P38 信號通路相繼失活，進而抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移[70]。相信將來會有越來越多關于 IDH 抑制劑應用于肺癌等實體腫瘤的基礎研究和臨床轉化。
LSD1/KDM1A 是首先被發現的賴氨酸脫甲基酶，可使單甲基化和二甲基化的 H3K4 或 H3K9 脫甲基化，已被發現在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達。LSD1/KDM1A 抑制劑通過抑制腫瘤細胞中 LSD1 的高表達或活性，進而影響腫瘤細胞的生長、轉移和侵襲[71]。已有的 LSD1/KDM1A 抑制劑包括 GSK2879552、ORY-1001 等[72]。目前，GSK2879552 正處于用于治療小細胞肺癌、急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NCT02034123、NCT02177812 和 NCT02929498）。
EZH2 是一種 HMT，它是 PRC2 蛋白質復合物的組成部分，能對 H3K27 進行三甲基化，起到基因沉默的作用，因此 EZH2 是一個具有應用前景的潛在作用靶點。已知的 EZH2 抑制劑有 CPI-1205 和 Tazemetostat 等[73]。Fillmore 等[74]發現抑制 EZH2 對接受拓撲異構酶 Ⅱ 抑制劑治療的 EGFR 和 BRG1 突變與非突變 NSCLC 具有不同影響，表明可根據 NSCLC 不同基因背景設計針對性藥物治療癌癥，或可成為 NSCLC 患者的又一治療策略。
5 總結與展望
如今，人們已明確認識到表觀遺傳調控在肺癌的發生發展中的重要作用。越來越多的研究致力于探索肺癌早期診斷、療效及預后判斷的表觀遺傳分子標志物。同時，由于表觀遺傳的可逆性和易調控性，表觀遺傳藥物為肺癌的治療提供了一個新的方向。目前，液體活檢 DNA 甲基化檢測及液體活檢 miRNAs 都展現出了理想的臨床應用價值；并陸續出現 BET 抑制劑、LSD1/KDM1A 抑制劑等多種新型表觀遺傳藥物，它們用于肺癌等實體腫瘤患者的臨床試驗正在進行。接下來，將有更多的關于肺癌的表觀遺傳學基礎研究及臨床轉化，它們將會為肺癌的精準診治提供新的策略。
肺癌是目前中國及全世界范圍內發病率與死亡率最高的惡性腫瘤，其中 85% 的病例為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），主要包括肺腺癌和肺鱗癌[1-3]。肺癌的總體 5 年生存率約為 18%，其根本原因在于肺癌的早期診斷困難，超過 70% 的患者確診時已處于晚期階段，缺乏有效的治療措施[4]。因此，深入研究肺癌的發生發展機制對肺癌的早期診斷及精準治療有著重要意義。長期以來，人們一直認為遺傳變異對肺癌的形成具有非常重要的作用。研究也已證實肺腺癌及肺鱗癌存在多種驅動基因變異，前者包括表皮生長因子受體基因（EGFR）突變、間變性淋巴瘤激酶基因（ALK）重排和 PIK3CA 突變等，后者有成纖維細胞生長因子受體 1 基因（FGFR1）擴增、磷酸酯酶張力蛋白同源物基因（PTEN） 突變和盤狀結構域受體 2（DDR2）突變等[5]。然而，近年來越來越多的證據表明，肺癌的發生發展不僅取決于遺傳變異，同時也受表觀遺傳異常的影響[6]。“表觀遺傳學”的概念是由 C. H. Waddinton 于 1939 年最早提出，后來被統一定義為：在基因組 DNA 序列不變的情況下，基因的表達及功能發生可逆的、可遺傳的變化[3]。表觀遺傳能從多個水平調控基因的表達，包括 DNA 水平上的 DNA 甲基化修飾，RNA 水平上的非編碼 RNA 調控，蛋白質水平上的組蛋白修飾，以及染色質水平上的染色質重塑[7]。本文將對表觀遺傳學在肺癌中的研究進展及其臨床意義進行闡述。
1 DNA 甲基化
1.1 DNA 甲基化的機制與意義
DNA 甲基化是指在 DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，CpG 二聯核苷酸上的胞嘧啶第 5 位碳原子與甲基間共價結合，被修飾為 5-甲基胞嘧啶。人類的 CpG 以兩種形式存在：一種是分散于基因組 DNA 中；另一種是高度聚集形成 CpG 島，存在于多種基因的啟動子區域或第 1 外顯子區域。目前已發現在哺乳動物細胞中有三種具有催化活性的 DNMT：DNMT1 主要維持 DNA 甲基化狀態，DNMT3A 和 DNMT3B 則以催化新的 DNA 甲基化為主[8]。健康人基因組中，CpG 島中的 CpG 位點通常處于非甲基化狀態，而在 CpG 島外的 CpG 位點則是甲基化的。當腫瘤發生時，CpG 島以外的 CpG 位點非甲基化程度增加，而 CpG 島中的 CpG 位點則呈高度甲基化狀態，引起基因組整體甲基化水平降低，以及某些基因 CpG 島局部甲基化水平異常升高，從而導致基因組的不穩定，如染色體的不穩定、原癌基因的活化以及抑癌基因的沉默[7, 9]。
1.2 DNA 甲基化在肺癌中的研究
DNA 甲基化是目前肺癌中研究得最廣泛、也最深入的表觀遺傳調控機制。抑癌基因、修復基因等重要蛋白編碼基因啟動子區域 CpG 島的局部高度甲基化發生于腫瘤的癌前病變或癌變早期；而且全基因組的低甲基化也隨著腫瘤發生而出現，并隨著腫瘤惡性程度的增加而顯著[3, 8]。因此，DNA 甲基化的檢測可以用于腫瘤的早期診斷及預后判斷。目前，已發現肺癌中存在多種基因處于高度甲基化狀態，這些基因涉及重要的細胞功能，包括DNA 修復（MGMT、hMLH1、MSH2），凋亡（DAPK、CASP8、TNFRSF6、DR4、DR5），細胞周期調控（P16、PTEN、RASSF1A），細胞侵襲與轉移（CDH1、CDH13、TSLC1），以及轉錄調控（APC、RARβ-2、SHOX2、RUNX3）等[8]。Selamat 等[10]發現在肺腺癌形成的不同階段（包括癌旁正常組織、非典型瘤樣增生、原位腺癌及浸潤性腺癌）相關基因的甲基化狀態也不同。Sandoval 等[11]用 DNA 甲基化微陣列芯片檢測了Ⅰ期 NSCLC 腫瘤組織的 450 000 個 CpG 位點，發現 HIST1H4F、PCDHGB6、NPBWR1、ALX1 和 HOXA9 這 5 個基因的高度甲基化與患者的術后無復發生存期呈顯著負相關。此外，肺癌的形成伴隨著 DNMT 的過表達。吸煙者肺癌中存在著 DNMT1 的過表達，且與預后不良呈相關性[12]。DNMT3A 的過表達與肺腺癌非浸潤性亞型存在相關性，可作為肺腺癌預后良好的一個預測指標[13]。
隨著 DNA 甲基化檢測技術的發展，現今肺癌 DNA 甲基化的研究更多地集中于液體活檢 DNA 甲基化。研究已證實，在肺癌患者血漿、痰液、支氣管肺泡灌洗液等體液中可檢測到相關基因啟動子 CpG 島甲基化狀態的異常變化，使其可成為無創性或微創性肺癌早期診斷的分子標志物[14-17]。Diaz-Lagares 等[17]發現采用焦磷酸測序法聯合檢測肺癌患者的支氣管肺泡灌洗液和痰液中的 BCAT1、CDO1、TRIM58 和 ZNF177 四個基因啟動子甲基化狀態，可獲得理想的診斷價值（受試者工作特征曲線下面積分別為 0.85 和 0.93）。近期的另一項研究中，Hulbert 等[18]采用甲基化特異性 PCR 方法檢測了 150 例早期肺癌（Ⅰ期和Ⅱa 期）患者和 60 例健康者的血漿和痰液中的腫瘤特異性基因啟動子甲基化狀態，發現聯合檢測痰液中三個相關基因（TAC1、HOXA17 和 SOX17）啟動子甲基化狀態用于早期肺癌診斷的特異性及敏感性分別為 98% 和 71%；聯合檢測血漿中 3 個相關基因啟動子甲基化狀態用于早期肺癌診斷的特異性及敏感性分別為 93% 和 62%。
2 組蛋白修飾
2.1 組蛋白修飾的機制與意義
除 DNA 甲基化修飾外，受各種修飾的組蛋白在基因表達和肺癌的發生發展中也起著重要的作用。核小體是構成染色質的基本單位，一個核小體由組蛋白 H2A、H2B、H3、H4 各 2 個組成的八聚體和纏繞在其外部長約 147 bp 的 DNA 組成。組蛋白不僅能保護 DNA 結構、保護遺傳信息，也能參與基因表達調控[4]。組蛋白游離在外的氨基末端可以被多種酶進行各種翻譯后修飾（包括乙酰化、甲基化、磷酸化及泛素化等），形成特定的“組蛋白密碼”，改變局部染色質結構的“開放”或“關閉”狀態，或決定何種蛋白結合到特定 DNA 區域，從而調控 DNA 的多種功能，包括轉錄及損傷修復等[19-20]。
2.2 組蛋白修飾在肺癌中的研究
肺癌中調控組蛋白功能最為突出的兩種機制為組蛋白乙酰化和甲基化。組蛋白乙酰化修飾具有較高的動態性，由組蛋白乙酰轉移酶（HATs）和組蛋白去乙酰化酶（HDACs）協同調控，發生在組蛋白氨基末端特定賴氨酸殘基上。組蛋白甲基化修飾則由組蛋白甲基轉移酶（HMT）催化完成，發生在組蛋白氨基末端某些賴氨酸和精氨酸殘基上，組蛋白賴氨酸甲基化是一種基因表達調控較為穩定的標記，而精氨酸甲基化是一種相對動態的標記[21]。Van Den Broeck 等[22]采用免疫組化方法研究了肺癌組織及其配對正常組織中組蛋白 H4 的修飾模式，發現肺癌組織表現出異常的組蛋白 H4 修飾模式，包括 H4K5/H4K8 的高乙酰化，H4K12/H4K16 的低乙酰化，以及 H4K20 三甲基化（H4K20me3）的缺失，提示組蛋白 H4 修飾在肺癌的發生中起著重要作用。他們還發現 H4K20me3 存在于 67% 的鱗癌，且出現在鱗癌癌前病變中，且隨疾病進展，其表達量減少，而在腺癌中，28% 出現 H4K20me3 的下調，但它出現于預后較差的 Ⅰ 期腺癌。這提示 H4K20me3 可作為肺鱗癌的早期診斷標志物，還可能成為肺腺癌的預后因子[22]。Seligson 等[23]發現，肺腺癌中組蛋白乙酰化修飾水平整體低下預示其侵襲性高，預后差。此外，HDAC-I 的高表達與肺腺癌的良好預后呈顯著相關性[24]。
3 RNA 調控
3.1 信使 RNA 修飾
N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是現今最常見的真核生物信使 RNA（messenger RNA，mRNA）內部修飾，是在轉錄后由 m6A 甲基轉移酶在序列的 G（m6A）C 或 A（m6A）C 部位上加工形成的，對于細胞的存活和發育必不可少[25]。其他 mRNA 修飾有 N1-甲基腺苷（m1A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）和假尿嘧啶，它們與 m6A 一起形成表觀轉錄組（epitranscriptome），共同編碼、控制蛋白質合成[26]。
m6A 脫甲基酶的發現以及整體轉錄組范圍內 m6A 修飾的分析證明了 m6A 甲基化修飾是一種可逆和動態的 RNA 修飾，可影響細胞中數千個 mRNA 和非編碼 RNA[27-28]。m6A 的甲基化是由甲基轉移酶復合物（MTC，包括 METTL3 和 METTL14）及其輔助因子（WTAP）催化完成；而 m6A 的脫甲基則被 YTH 結構域家族蛋白選擇性識別，由兩種 m6A 脫甲基酶（FTO 和 ALKBH5）催化完成[27]。Lin 等[29]發現，METTL3 在人類肺腺癌細胞系中表達上調，起著促進腫瘤細胞生長、存活和侵襲的致癌作用。值得注意的是，METTL3 通過與翻譯起始機制的相互作用促進其靶 mRNA 轉錄本（如 EGFR 和 TAZ）的翻譯，其方式獨立于其甲基轉移酶活性。魏文平等[30]檢測了 METTL3 在 NSCLC 組織中的表達水平，發現癌組織中 METTL3 較癌旁組織呈顯著高表達，且高 METTL3 表達的患者預后較差。這提示 METTL3 具有作為 NSCLC 診斷及治療靶點的潛能。
3.2 非編碼 RNA 調控
人類基因組中，具有編碼蛋白質功能的基因僅占全部基因組序列的 2%，其余 98% 的序列中絕大多數被轉錄成非編碼 RNA，而不被翻譯成蛋白質。這些非編碼 RNA 根據分子大小可分為短鏈非編碼 RNA 和長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs），在表觀遺傳調控中發揮重要的作用[31]。
微小 RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一種大小為 19～22 個核苷酸的短鏈非編碼 RNA，可通過結合靶 mRNAs 中的 3' UTR 結合，從而降解靶 mRNAs 或阻遏靶 mRNAs 的翻譯[32]。miRNAs 能夠調控多個腫瘤相關基因的表達，根據 miRNAs 的靶基因的功能，可以將其分為具有癌基因或抑癌基因作用的兩類[33]。目前已發現超過 1 000 個 miRNAs，它們調控超過 1/3 的 mRNAs。大量研究發現，miRNAs 的異常表達與肺癌的發生發展相關，如 let-7a miRNA 可通過靶向 KRAS 和 C-Myc 抑制腫瘤的生長[34-35]，miRNA-17 靶向 TGFβR2，進而抑制 NSCLC 細胞的遷移性[36]。
MiRNAs 可穩定存在于外周血、痰液及其他體液中，使得液體活檢 miRNAs 檢測有望成為肺癌早期診斷及預后判斷的分子標志物[2]。Heegaard 等[37]采用 RT-PCR 方法檢測了早期 NSCLC 患者及正常健康人血漿中的 miRNAs 水平，發現早期 NSCLC 具有獨特的循環 miRNAs 表達模式。Yu 等[38]對比了肺腺癌患者和正常健康者痰液樣本中的 miRNAs 水平，發現聯合檢測 4 個 miRNAs（miRNA-21、miRNA-486、miRNA-375 和 miRNA-200b）診斷肺腺癌的敏感性為 80.6%，特異性為 91.7%。此外，循環 miRNAs 檢測還可用于預測化療和分子靶向治療的療效。Cui 等[39]檢測了晚期 NSCLC 患者血清中miRNAs 水平，發現 miR-125b 表達上調者對順鉑的治療不敏感且預后較差。Zhao 等[40]發現循環 miRNAs可預測 EGFR 突變狀態、吉非替尼敏感性及預后。
lncRNAs 是長度超過 200 個核苷酸的非編碼 RNA，在多個層面上（轉錄、轉錄后等）調控腫瘤相關基因的表達[8]。目前，已發現的與肺癌相關的 lnRNAs 有 MALAT1、NEAT1、ANRIL、H19、HOTAIR、HOTTIP 和 MEG3 等[41]。其中，肺腺癌轉移相關轉錄本 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在許多腫瘤中表達上調，但在肺癌中表達具有較高特異性，被認定為 NSCLC，特別是肺腺癌轉移和預后不良的特異性分子標志物[42]。
4 肺癌表觀遺傳治療的方向及所面臨的挑戰
表觀遺傳調控具有潛在可逆性，因此腫瘤表觀遺傳治療已成為近年來的一個熱門研究新領域。腫瘤表觀遺傳治療的有效性不僅在細胞系和動物研究中得到了證實，在某些臨床試驗也獲得了肯定結果。
4.1 DNA 甲基轉移酶抑制劑
DNA 甲基轉移酶抑制劑（DNA methyltransferase inhibitors，DNMTIs）是一類胞嘧啶核苷類似物，通過在 DNA 復制過程中取代胞嘧啶，與 DNMT 共價結合抑制該酶的活性，進而降低 DNA 甲基化水平，恢復抑癌基因等重要基因的表達，逆轉腫瘤細胞的表型[43]。DNMTIs 的代表藥物有阿扎胞苷（azacitidine，AZA）和地西他濱（decitabine，DAC），它們已被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準用于急性髓系白血病及骨髓增生異常綜合征的治療，并取得一定療效[44-45]。但它們在應用于肺癌等實體腫瘤的臨床試驗中效果還不理想[46]。這主要是因為這兩種藥僅作用于細胞增殖的 S 期，且在水溶液中不穩定，在體內迅速被胞苷脫氨酶分解。對于增殖指數較小的實體腫瘤治療，無法實現藥物在體內長時間低濃度的持續暴露，這大大限制了其在實體瘤中的療效[44]。因此，如何優化 DNMTIs 的藥物代謝動力學是目前新藥開發的策略之一。近期，研究者們開發出了一個較新的復合物 SGI-110，該復合物在體內不被胞苷脫氨酶分解，且去甲基化效能更強，但其仍存在水溶液中不穩定的缺點[47]。臨床試驗證實，SGI-110 是目前所有 DNMTIs 中效能最強、最具前景的藥物[48]。
4.2 組蛋白去乙酰化酶抑制劑
組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACIs）通過抑制 HDAC 的活性，誘導組蛋白高度乙酰化，除可直接調控細胞凋亡和分化相關蛋白的表達外，還可促進 DNMT1 降解[49]。已知的 HDACIs 主要包括伏立諾他（vorinostat，SAHA）、羅咪酯肽（Romidepsin，FK228）、貝利司他（Belinostat，PXD101）和恩替諾特（Entinostat，MS275）等，其中前三者均已被美國 FDA 批準用于 T 淋巴細胞瘤的治療[50]。與在血液惡性腫瘤中取得的顯著療效不同，HDACIs 在肺癌等實體腫瘤的臨床試驗結果令人失望[51]。這些研究共同指出，由于較大的藥物劑量需求，不良反應嚴重，HDACIs 尚不能滿足臨床實體腫瘤治療的需要[52-53]。
4.3 DNA 甲基轉移酶抑制劑與組蛋白去乙酰化酶抑制劑的聯合應用
由于 DNMTIs 和 HDACIs 在腫瘤表觀遺傳治療中的作用機制不同，且單藥應用于肺癌等實體腫瘤時效果均不佳，越來越多的研究也致力于兩者的聯合應用[54]。美國霍普金斯大學癌癥研究中心進行的一項聯合阿扎胞苷和恩替諾特應用于難治性晚期 NSCLC 的Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗取得了令人振奮的結果。45 例患者中，1 例患者獲得了完全緩解，1 例部分緩解患者治療后 22 個月無腫瘤進展，10 例患者病情穩定至少 3 個月[55]。目前，還有一項聯合阿扎胞苷和恩替諾特應用于Ⅰ期 NSCLC 患者的術后輔助治療的 Ⅱ 期臨床試驗（NCT01207726）正在進行中。
4.4 表觀遺傳治療與其他治療的聯合應用
一項聯合伏立諾他和卡鉑及紫杉醇治療晚期 NSCLC 的 Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗顯示，與安慰劑組對比，客觀緩解率、疾病無進展期和整體生存期均明顯改善[56]。另一研究顯示，聯合伏立諾他和吉非替尼治療 EGFR 敏感型晚期 NSCLC 患者，可增強吉非替尼的效用[57]。目前，FDA 已批準了抗 PD-1 和抗 PD-L1 藥物在 NSCLC 中的臨床應用[58]。但臨床上許多患者對該治療不敏感，聯合治療可能成為未來的一種選擇。在一項聯合表觀遺傳治療與免疫治療的研究中，5 例接受了低劑量表觀遺傳藥物治療后進展的晚期 NSCLC 患者入組了抗 PD-1 和抗 PD-L1 免疫治療，與整體僅有的 20% 緩解率相比，該 5 例患者全部實現了臨床緩解，而且其中 3 例患者按照 RECIST 標準實現了高級反應[55, 59]。越來越多的研究顯示，表觀遺傳藥物引起的表觀遺傳學改變可增強腫瘤對其他藥物的敏感性。特別是 DNMTIs，可通過內源性逆轉錄病毒和癌-睪丸抗原相關基因的去甲基化來上調上皮性腫瘤細胞的免疫信號[60]。
4.5 其他新型抗腫瘤表觀遺傳藥物
除了針對 DNA 甲基化和組蛋白乙酰化修飾的的 DNMTIs 和 HDACIs，近 5 年來也相繼出現了通過新的表觀遺傳調控機制開發的藥物。這些新機制包括 bromodomain and extra terminal protein（BET）抑制劑、異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變抑制劑、賴氨酸特異性脫甲基酶 1（LSD1/KDM1A）抑制劑和 HMT 抑制劑等。
BET 蛋白是一類可以和乙酰化組蛋白結合的表觀遺傳學調控蛋白，它控制 c-MYC 等促生長、抗凋亡靶基因的轉錄，已在血液系統惡性腫瘤中顯示出有效的抗腫瘤增殖作用[61]。它的抗腫瘤作用在人類肺腺癌細胞系實驗中也得到了證實，用 BET 抑制劑 JQ1 處理細胞后，后者表現出 c-MYC 的表達下調[62]。另一研究顯示，JQ1 可通過抑制 MYC 的功能，抑制 KRAS 突變型/LKB1 野生型 NSCLC 小鼠模型的腫瘤生長。這都提示 BET 抑制劑可能成為治療 NSCLC 的另一有效藥物。目前，一項 BET 抑制劑（GSK525762）治療包括肺癌等實體腫瘤的Ⅰ期臨床試驗（NCT01587703）正在進行中。
IDH 是三羧酸循環中的一種關鍵酶，它將異檸檬酸轉化為 α-酮戊二酸（α-KG）。IDH 突變將會導致其下游代謝產物 R-2-羥基戊二酸（R-2-HG）水平升高，導致 DNA 甲基化和組蛋白甲基化水平的改變，進而改變轉錄調控而促進腫瘤的發生發展[63-65]。近年來，在包括急性髓性白血病、膠質瘤和肺癌在內的多種腫瘤中發現了 IDH1/2 突變[65-68]。2017 年 8 月，FDA 批準了全球首個 IDH2 抑制劑 Enasidenib 上市，用于治療攜帶 IDH2 突變的急性髓系白血病[69]。有研究發現，IDH 抑制劑 DTDQ 在人類 NSCLC-A549 細胞系中，可使 RK 和 P38 信號通路相繼失活，進而抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移[70]。相信將來會有越來越多關于 IDH 抑制劑應用于肺癌等實體腫瘤的基礎研究和臨床轉化。
LSD1/KDM1A 是首先被發現的賴氨酸脫甲基酶，可使單甲基化和二甲基化的 H3K4 或 H3K9 脫甲基化，已被發現在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達。LSD1/KDM1A 抑制劑通過抑制腫瘤細胞中 LSD1 的高表達或活性，進而影響腫瘤細胞的生長、轉移和侵襲[71]。已有的 LSD1/KDM1A 抑制劑包括 GSK2879552、ORY-1001 等[72]。目前，GSK2879552 正處于用于治療小細胞肺癌、急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合征的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NCT02034123、NCT02177812 和 NCT02929498）。
EZH2 是一種 HMT，它是 PRC2 蛋白質復合物的組成部分，能對 H3K27 進行三甲基化，起到基因沉默的作用，因此 EZH2 是一個具有應用前景的潛在作用靶點。已知的 EZH2 抑制劑有 CPI-1205 和 Tazemetostat 等[73]。Fillmore 等[74]發現抑制 EZH2 對接受拓撲異構酶 Ⅱ 抑制劑治療的 EGFR 和 BRG1 突變與非突變 NSCLC 具有不同影響，表明可根據 NSCLC 不同基因背景設計針對性藥物治療癌癥，或可成為 NSCLC 患者的又一治療策略。
5 總結與展望
如今，人們已明確認識到表觀遺傳調控在肺癌的發生發展中的重要作用。越來越多的研究致力于探索肺癌早期診斷、療效及預后判斷的表觀遺傳分子標志物。同時，由于表觀遺傳的可逆性和易調控性，表觀遺傳藥物為肺癌的治療提供了一個新的方向。目前，液體活檢 DNA 甲基化檢測及液體活檢 miRNAs 都展現出了理想的臨床應用價值；并陸續出現 BET 抑制劑、LSD1/KDM1A 抑制劑等多種新型表觀遺傳藥物，它們用于肺癌等實體腫瘤患者的臨床試驗正在進行。接下來，將有更多的關于肺癌的表觀遺傳學基礎研究及臨床轉化，它們將會為肺癌的精準診治提供新的策略。