引用本文： 劉春雨, 高占成. 抑癌基因 PTEN 與特發性肺間質纖維化. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(2): 200-205. doi: 10.7507/1671-6205.201708021 復制
特發性肺間質纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IFP）是一種呈慢性進展不可逆和致死性的特發性間質性肺病，肺間質成纖維細胞廣泛增殖，細胞外基質沉積并最終導致肺結構重塑或破壞。其發病機制仍不明確，臨床表現具有異質性，尚缺乏早期診斷方法[1-6]。過去 10 年間，IPF 總體發病率呈上升趨勢，年發病率為（4.6～16.3）/100 000，患病率（13～20）/100 000，男性發病率高于女性（1.5～1.7∶1），不同人種間無顯著差異，吸煙和有害粉塵暴露是獨立危險因素[7-8]。IPF 發病率隨年齡逐漸升高，平均就診年齡為 66 歲（55～75 歲），目前認為 IPF 是年齡相關性疾病，具體機制尚不明確，可能與端粒驅動、表觀修飾異常有關[1, 9]。明確診斷后該病的平均生存期約為 2.5～5 年[1]。尚無特效藥物能夠逆轉或終止其纖維化進展。第 10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是人類惡性腫瘤中突變頻率最高的抑癌基因之一，在早期胚胎分化、發育中起重要作用。PTEN 蛋白雙特異性磷酸酶活性廣泛作用于細胞內多條信號通路，在細胞凋亡、細胞周期調控、細胞遷移等過程中均發揮關鍵作用，是腫瘤領域研究的熱點。近年來，實驗研究逐漸發現 PTEN 基因在 IFP 中也發揮著重要作用。本文就 PTEN 抑癌基因與 IPF 發病機制之間的相關性進行文獻綜述，以期為深入探討 IPF 致病機制及治療靶點提供新思路。
1 PTEN 基因結構、功能及其組織分布
PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）即第 10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因，是在 1997 年由三個獨立的研究小組發現的位于人第 10 號染色體（10q23.3）上的抑癌基因，又名多種進展期癌中突變基因 1（mutated in multiple advanced cancers，MMAC1）或 TGF-β 調控和上皮細胞富集磷酸酶（TGF-β regulated and epithelial-cell-enriched phosphatase，TEP1）[10-12]。PTEN 基因是迄今為止發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，其缺失、突變和失活與多種惡性腫瘤包括神經膠質母細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌等的發生密切相關[10]。
1.1 PTEN 基因結構
該基因由 9 個外顯子和 8 個內含子組成，全長約 200 kb，其 cDNA 由 1 209 個核苷酸構成，編碼的 PTEN 蛋白由 403 個氨基酸組成。PTEN 蛋白由位于 N 端的磷酸酯酶區和位于 C 端的 C2 結構域組成。磷酸酯酶區包含蛋白酪氨酸磷酸酯酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）特征序列，以及與痘苗病毒 H1 相關雙特異性蛋白磷酸酶（Vaccinia H1-related，VHR）相似的結構區，PTEN 磷酸酶活性中心比 VHR 與 PTP 大，更加利于其與底物的結合。C 端的 C2 結構域結合磷脂膜，這種結合不依賴鈣離子，介導細胞膜募集信號蛋白，對 PTEN 抑癌功能起重要作用。PTEN 蛋白 N 端尾部短，C 端尾部長，有富含絲/蘇氨酸殘基的 PEST 序列和 PDZ 結合結構域[13]。PTEN 基因經可變剪切與多個翻譯起始密碼子翻譯產生多種 PTEN 蛋白亞型，Hopkins 等[14]發現一種在經典 PTEN 蛋白 N 端增加 173 個氨基酸的翻譯變異體，該種變異體是經細胞旁分泌后可穿透細胞膜的脂質磷酸酶，拮抗 PI3K 信號通路并誘導腫瘤細胞死亡。另一項研究發現該變異體與經典 PTEN 形成復合體，增加 PTEN 誘導推定激酶 1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）蛋白水平，維持線粒體穩定，促進線粒體產能[15]。
1.2 PTEN 蛋白分布
PTEN 與張力蛋白（細胞骨架黏著斑相關蛋白）、輔助蛋白（突觸囊泡運輸相關蛋白）有同源性，在細胞質廣泛表達。PTEN 蛋白在細胞核中以單泛素化形式存在，其特殊位點賴氨酸殘基泛素化可調節 PTEN 在細胞核-細胞質中的分布，泛素特異性蛋白酶 7（ubiquitin specific protease 7，USP7）輔助 PTEN 蛋白進入細胞核，并與早幼粒細胞白血病體（functional promyelocytic leukaemia protein nuclear bodies，PML nuclear bodies）異常分布于細胞核中[16-18]。
1.3 PTEN 蛋白功能
PTEN 雙特異性磷酸酶的主要底物是磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3），通過 PIP3 去磷酸化為磷脂酰肌醇 4,5-雙磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2），抑制絲/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）活性，負性調節 PI3K-AKT 通路，影響細胞能量代謝、細胞生長、細胞凋亡和遷移。PTEN 蛋白酪氨酸磷酸酶作用于黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及 SH2 包含蛋白（SH2 containing protein，Shc），通過去磷酸化作用調節細胞通路，影響細胞黏附和遷移[19]。PTEN 蛋白在細胞核內調節著絲點穩定性，維持濃縮染色質結構，修復損傷的雙鏈 DNA，調節細胞周期、調控細胞衰老[20-24]。
PTEN 蛋白在整個胚胎發育期廣泛、高度表達，早在 3.5 d 囊胚期的胚胎組織以及胚外組織中即可檢測到，是胚胎細胞增殖、發育、遷移、死亡等一系列生長發育活動的重要標志。PTEN 基因表達調控 T 細胞增殖與功能，參與 NK 細胞發育以及抗體類型轉換，也參與肺臟發育、代謝和功能[25]。
2 PTEN 抑癌基因在 IPF 發病機制中的作用
2.1 IPF 發病機制現狀
2.1.1 肺泡上皮細胞微損傷
肺泡上皮細胞位于肺泡腔與肺間質間，是肺天然的物理屏障與免疫屏障。持續刺激導致肺泡上皮細胞損傷以及肺泡結構破壞，肺泡再生障礙以及異常激活是引起 IPF 的始動因素。編碼調節肺泡上皮細胞抗壓能力、表面活性物質穩定性，染色體端粒酶長度等基因突變導致肺泡上皮細胞對外界刺激敏感性增加[26]。環境中金屬或有機成分的可吸入顆粒增加 IPF 發病風險，EB 病毒、皰疹病毒等病毒感染導致潛在的肺泡上皮損傷[8, 27]。慢性病如胃食管反流病、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥與肺泡低通氣等對 IPF 發生、發展有促進作用[28-29]。衰老導致肺泡上皮細胞老化以及再生能力衰竭在肺纖維化中亦起到一定作用[30]。
具有遺傳易感性個體暴露在特定環境中，在自身基礎疾病相互作用下肺泡上皮持續受到刺激，肺泡上皮損傷再生修復功能受損，最終導致肺泡完整性破壞、肺泡陷閉，啟動纖維化程序，發生級聯效應。
2.1.2 肺泡上皮細胞異常激活
肺泡上皮損傷后釋放炎癥因子導致毛細血管通透性增加，纖維蛋白原、纖維連接蛋白滲出至肺間質及肺泡腔，形成最初暫時的細胞外基質，間質內其他細胞成分對細胞增殖信號產生應答，遷移至裸露肺泡基底膜維持上皮屏障，釋放細胞因子刺激肺泡間質細胞遷移參與修復。激活的凝血因子 X（factor X，FX）使凝血酶原轉化為凝血酶，剪切纖維蛋白原為纖維蛋白。肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cells，AEC）分泌纖溶酶原激活物抑制因子 1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI1），形成抗纖溶和高凝的微環境，使基質降解減少。Ⅱ型肺泡上皮細胞分化為Ⅰ型肺泡上皮細胞受到抑制，細胞內促凋亡蛋白[半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和 Bcl-2 相關 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表達升高，抗凋亡作用的 B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2 gene，Bcl-2）蛋白表達降低，凋亡增加[31]。晚期糖機化終產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）和 CD151 等減少可抑制Ⅰ型肺泡上皮識別基底膜，出現再上皮化障礙[32-33]。肺泡內含 SH2 結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶-2（SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2，Shp2）蛋白減少導致表面活性物質穩定性降低，促進上皮細胞凋亡[34]。
細胞外基質和凝血級聯反應中釋放的活性蛋白酶參與纖維化組織重塑以及上皮細胞向間質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。凝血酶和活化 FX 通過蛋白酶活性受體-1 誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化[32]。同時涉及形態發生相關細胞因子 TGF-β、shh、Wnt/β-catenin、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor ，FGF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、Notch 等在此過程中被激活，促進 EMT 轉化增加[35]。
EMT 是極化的上皮細胞轉變為間葉細胞，通常發生在胚胎細胞層運動和腫瘤細胞浸潤中，是上皮細胞可塑性的表現。EMT 過程中上皮細胞相關蛋白上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）和閉鎖小帶（zonula occludens，ZO-1）表達下調，間質細胞特征蛋白波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和纖連蛋白（fibronectin）表達上調[36]。EMT 直接增加間質細胞數量，細胞本身合成細胞外基質能力增強，釋放大量趨化因子，細胞因子激活，募集附近的成纖維細胞使信號級聯放大。
2.1.3 上皮細胞-成纖維細胞信號關聯并激活成纖維細胞增殖
肺泡上皮損傷后可分泌 TGF-β，能夠直接促進纖維化[37]。具體表現為上皮細胞表面傳感系統整合素（αvβ6、αvβ6 和 α3β1）和鈣黏著蛋白（如 E-cadherin/β-catenin）與基質中促炎因子溶血磷脂受體蛋白 2（LPA2）、Xa 及前體 TGF-β1 聯合，將其激活[38, 41]。同時細胞表面 Wnt 受體 LRP6 磷酸化增加，通過經典 Wnt 通路，產生酪氨酸磷酸化 β-catenin 以及磷酸化 Smads 等轉錄復合體，積累于細胞核，改變其基因轉錄狀態，釋放炎癥因子共同活化成纖維細胞，同時使其自身向肌成纖維細胞轉變[40, 42]。另外，基質中 TGF-β 誘導上皮細胞能夠高表達 shh 蛋白，通過正反饋模式進一步促進成纖維細胞 TGF-β 和 α-SMA 高表達，進一步增強纖維化效應[43-44]。
成纖維細胞與肌成纖維細胞過度合成和分泌細胞外基質，導致肺結構重塑，是 IPF 的最終表現。IPF 肺間質中肌成纖維細胞來源于三種成分：（1）外周循環血中一組特殊的白細胞亞群，能夠特異性表達 CD45、CD34 和纖維連接蛋白，通過細胞因子受體 CXCR4 識別 IPF 中 AEC 表達的 CXCL12 募集于肺泡間質[45]；（2）Ⅲ型肺泡上皮細胞，轉化為能夠表達 α-SMA 和神經鈣黏著蛋白（N-cadherin）的成纖維細胞；（3）肺間質組織中固有的成纖維細胞，在局部促纖維化生長因子 TGF-β、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）和腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）作用下轉變為肌成纖維細胞[46]。
2.2 PTEN 基因在 IPF 發病機制中的作用
PTEN 基因功能異常在遺傳性和散發的惡性腫瘤中均扮演重要“角色”。在腫瘤發生過程中，PTEN 基因突變或缺失直接導致 PTEN 蛋白雙特異性磷酸酶功能缺失，直接促進細胞增值、侵襲，抑制細胞發生凋亡。P53、PPARγ、NF-kB 等在轉錄水平上調節 PTEN 基因的表達，非編碼 RNA 調節轉錄后 mRNA 水平，PTEN 蛋白的泛素化、乙酰化以及與其他細胞內蛋白相互作用均與腫瘤的發生密切相關[47]。在 IPF 發生過程中，成纖維細胞廣泛增殖、遷移、抗凋亡，其本身即具有惡性疾病特征，而 IPF 患者本身易同時合并肺癌，與此同時，抑癌基因 PTEN 已被證實在 IPF 的發生、發展中起到重要作用，現總結如下。
2.2.1 PTEN 蛋白在 IPF 中活性顯著缺失
PTEN 在細胞內作用廣泛，針對蛋白表達的調控是復雜且精細的。多種信號通路調節 PTEN 基因轉錄，miRNA 和 ceRNA 調節 PTEN 轉錄后 mRNA 穩定性，PTEN 蛋白的磷酸化、乙酰化等可正性或負性調節 PTEN 蛋白穩定性，酶活性以及細胞內定位[25]。PTEN 基因表達、PTEN 蛋白水平、PTEN 蛋白磷酸酶活性在 IPF 來源的成纖維細胞中較正常成纖維細胞顯著降低[48]。IPF 成纖維細胞灶中與 PTEN 結合的膜蛋白微囊蛋白 1（caveolin-1）低表達，從而導致細胞膜微環境中 PTEN 磷酸酶活性的相對缺失，進而導致 PI3K/AKT 異常激活[49]。PTEN 在 IPF 中功能缺失還與翻譯后修飾有關，Geng 等[50]發現 USP13 與 PTEN 相互作用，并介導 PTEN 蛋白在 IPF 成纖維細胞中泛素化。
2.2.2 PTEN 蛋白缺失具有顯著致纖維化作用
（1）肺泡上皮完整性被破壞：小鼠支氣管肺泡上皮特異性敲除 PTEN 基因后發現肺泡上皮緊密連接（TJs）分解及基底膜降解增加，上皮來源的肌成纖維細胞增加。博來霉素處理后上皮細胞磷酸化 AKT、磷酸化 S6K、Snail 和基質金屬蛋白酶表達增加，緊密連接蛋白-4（Claudin-4）、E-cadherin、β-catenin 和層黏連蛋白 β1（laminin-β1）表達下降[51]。在 IPF 中，PTEN 對肺泡上皮細胞完整性起關鍵的門控作用，PTEN 缺失使上皮細胞對損傷刺激因素敏感性增加。
（2）促進成纖維細胞分化，促進成纖維細胞侵襲、遷移：PTEN 基因敲除后成纖維細胞 α-SMA、膠原蛋白表達上調，PTEN 基因過表達后抑制 TGF-β 誘導其分化為肌成纖維細胞[48]。Geng 等[52]進一步研究表明 PTEN 表達缺失使正常的成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，細胞增殖加快，侵襲、遷移能力增加，并且低氧可下調 PTEN 表達。對成纖維細胞侵襲表型進行轉錄組測定，PTEN 基因與基質金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinase，MMP-13）、TGF-β1、caveolin-1 和分泌型卷曲相關蛋白 1（secreted frizzled-related proteins 1，Sfrp1）對成纖維細胞侵襲行有明顯調控作用[53]。動物實驗發現 PTEN 基因缺失小鼠博來霉素誘導發生 IPF 后死亡率明顯增加，PTEN 缺失使肺泡上皮細胞易損傷，同時導致參與修復的成纖維細胞功能異常（圖 1）。PTEN 基因及其功能在肺間質纖維化發病的多個關鍵環節起到重要作用。
圖1
PTEN 基因在 IFP 發病過程中的作用
PTEN 對肺泡上皮細胞穩定性起到門控作用，PTEN 缺失促進損傷導致基底膜降解，緊密連接，抑制上皮細胞發生 EMT，抑制肺間質來源的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞、分泌細胞外基質，促進外周的巨噬細胞、T 淋巴細胞募集至成纖維細胞灶參與損傷引起的炎癥與修復（→為促進作用，┻為抑制或拮抗作用）
（3）誘導成纖維細胞抗凋亡表型，抑制成纖維細胞發生自噬：細胞外基質收縮可激活正常成纖維細胞內 PTEN 蛋白，發揮雙特異性磷酸酶活性，拮抗 PI3K 活性，下調磷酸化 AKT 水平，誘導成纖維細胞發生凋亡。而 PTEN 基因缺失的成纖維細胞通過 β1 整合素激活 PI3K-Akt-S6K1 通路，使得磷酸化 AKT 水平升高，使成纖維細胞具有抗膠原誘導的細胞凋亡表型，并通過激活 PI3K-AKT-mTOR 途徑，抑制成纖維細胞自噬活性，最終導致 IPF 中成纖維細胞在 ECM 異常增殖（圖 2）[54-56]。
Fox3a 轉錄因子通過上調細胞周期抑制因子 P27 阻抑有絲分裂細胞 G1 期向 S 期過渡。Fox3a 與 caveolin-1 啟動子區結合后，可增加其轉錄和蛋白表達，caveolin-1 過表達可增加 Fas 水平以及 caspase-3/7 活性，促進成纖維細胞發生Ⅰ型膠原誘導的凋亡。而 IPF 患者肺組織活檢中發現 caveolin-1、Fas、caspase-3/7 表達下降，PTEN 缺失導致高活性 AKT 磷酸化 Fox3a 而使其失去活性，導致微管相關蛋白 1a/1b 輕鏈 3B（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B，LC3-B）轉錄減少，降低成纖維細胞自噬活性，促進其在膠原基質中增殖（圖 2）[57-59]。
（4）纖維化相關細胞因子分泌失衡：IPF 肺纖維化發生初期，損傷修復反應中亦產生抑制纖維化的細胞因子（如前列腺素 E2），但研究發現纖維化反應中的成纖維細胞對前列腺素 E2 并不敏感，主要是由于具有高度活性的磷酸化 AKT 介導前列腺素 E2 受體啟動子區甲基化，使細胞合成前列腺素 E2 受體減少，降低了細胞對基質中前列腺素 E2 的敏感性（圖 2）[60]。
圖2
PTEN 基因促纖維化的分子機制
PTEN 特異性雙磷酸酶活性作用于底物 PIP3，去磷酸化從而抑制 PI3K-AKT 通路。當 PTEN 缺乏時，細胞 AKT 活性增強，通過磷酸化使活性 FoxO3a 減少，P27 轉錄減少，對 CDK 抑制作用減弱，促進細胞增殖；活性 FoxO3a 的降低減少 Caveolin-1 轉錄與表達，降低 Fas 水平，降低 Caspase-3/7 活性，誘導抗凋亡表型；FoxO3a 降低通過減少 LC3-B 轉錄抑制細胞自噬；磷酸化 AKT 激活下游 mTOR，通過抑制 LC3-B 降低細胞自噬活性。活性 AKT 通過前列腺素 E2 受體基因上啟動子區甲基化作用，減少前列腺素 E2 受體表達，使細胞對抗纖維化細胞因子前列腺素 E2 不敏感
骨髓 PTEN 缺陷小鼠在應用博來霉素誘導后，肺組織表現出 TGF-β1 活化，膠原沉積增加，前膠原蛋白、賴氨酰氧化酶表達增加；肺泡灌洗液中巨噬細胞、T 細胞數量下降，炎癥細胞募集功能受損（圖 1），肺巨噬細胞極化異常，促纖維化因子 IL-6 以及 TNF-α 合成、分泌增加[61]。PTEN 缺失可導致細胞炎癥反應失衡，促纖維化因子釋放增多，抗纖維化因子相對不足，維持纖維化狀態。
應用 VEGF 抑制劑治療博來霉素誘導 IPF 蛋白組學的研究顯示，PI3K-Akt 信號通路與 Wnt 信號通路有顯著促纖維化作用；自然殺傷細胞信號通路（NK signaling）與 PTEN 信號通路具有顯著抗纖維化作用，VEGF 抑制劑誘導 SHIP-1 過表達，導致 PTEN 信號增加，介導抗纖維化效應；雷帕霉素（mTOR）和細胞外信號調節激酶（ERK）為促纖維化和抗纖維化反應的關鍵介質，PTEN 通過抑制 PI3K-AKT-mTOR 通路調節纖維化反應中 mTOR[62]。
3 結論與展望
PTEN 作為具有特異性雙磷酸酶活性的抑癌基因，通過去磷酸化細胞內重要信號分子如 PIP3，抑制 PI3K-AKT 信號通路，抑制活化 AKT 下游細胞信號分子。PTEN 蛋白及其活性在 IPF 時顯著降低，PTEN 缺失破壞肺泡上皮細胞完整性，促進成纖維細胞分化、遷移，抑制成纖維細胞發生自噬、凋亡，導致細胞炎癥反應失衡，促纖維化細胞因子分泌增加，抗纖維化細胞因子分泌不足。PTEN 基因在 IPF 發生、發展過程中起重要作用，為該病的基因治療提供了新靶點。
特發性肺間質纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IFP）是一種呈慢性進展不可逆和致死性的特發性間質性肺病，肺間質成纖維細胞廣泛增殖，細胞外基質沉積并最終導致肺結構重塑或破壞。其發病機制仍不明確，臨床表現具有異質性，尚缺乏早期診斷方法[1-6]。過去 10 年間，IPF 總體發病率呈上升趨勢，年發病率為（4.6～16.3）/100 000，患病率（13～20）/100 000，男性發病率高于女性（1.5～1.7∶1），不同人種間無顯著差異，吸煙和有害粉塵暴露是獨立危險因素[7-8]。IPF 發病率隨年齡逐漸升高，平均就診年齡為 66 歲（55～75 歲），目前認為 IPF 是年齡相關性疾病，具體機制尚不明確，可能與端粒驅動、表觀修飾異常有關[1, 9]。明確診斷后該病的平均生存期約為 2.5～5 年[1]。尚無特效藥物能夠逆轉或終止其纖維化進展。第 10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是人類惡性腫瘤中突變頻率最高的抑癌基因之一，在早期胚胎分化、發育中起重要作用。PTEN 蛋白雙特異性磷酸酶活性廣泛作用于細胞內多條信號通路，在細胞凋亡、細胞周期調控、細胞遷移等過程中均發揮關鍵作用，是腫瘤領域研究的熱點。近年來，實驗研究逐漸發現 PTEN 基因在 IFP 中也發揮著重要作用。本文就 PTEN 抑癌基因與 IPF 發病機制之間的相關性進行文獻綜述，以期為深入探討 IPF 致病機制及治療靶點提供新思路。
1 PTEN 基因結構、功能及其組織分布
PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）即第 10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因，是在 1997 年由三個獨立的研究小組發現的位于人第 10 號染色體（10q23.3）上的抑癌基因，又名多種進展期癌中突變基因 1（mutated in multiple advanced cancers，MMAC1）或 TGF-β 調控和上皮細胞富集磷酸酶（TGF-β regulated and epithelial-cell-enriched phosphatase，TEP1）[10-12]。PTEN 基因是迄今為止發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，其缺失、突變和失活與多種惡性腫瘤包括神經膠質母細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌等的發生密切相關[10]。
1.1 PTEN 基因結構
該基因由 9 個外顯子和 8 個內含子組成，全長約 200 kb，其 cDNA 由 1 209 個核苷酸構成，編碼的 PTEN 蛋白由 403 個氨基酸組成。PTEN 蛋白由位于 N 端的磷酸酯酶區和位于 C 端的 C2 結構域組成。磷酸酯酶區包含蛋白酪氨酸磷酸酯酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）特征序列，以及與痘苗病毒 H1 相關雙特異性蛋白磷酸酶（Vaccinia H1-related，VHR）相似的結構區，PTEN 磷酸酶活性中心比 VHR 與 PTP 大，更加利于其與底物的結合。C 端的 C2 結構域結合磷脂膜，這種結合不依賴鈣離子，介導細胞膜募集信號蛋白，對 PTEN 抑癌功能起重要作用。PTEN 蛋白 N 端尾部短，C 端尾部長，有富含絲/蘇氨酸殘基的 PEST 序列和 PDZ 結合結構域[13]。PTEN 基因經可變剪切與多個翻譯起始密碼子翻譯產生多種 PTEN 蛋白亞型，Hopkins 等[14]發現一種在經典 PTEN 蛋白 N 端增加 173 個氨基酸的翻譯變異體，該種變異體是經細胞旁分泌后可穿透細胞膜的脂質磷酸酶，拮抗 PI3K 信號通路并誘導腫瘤細胞死亡。另一項研究發現該變異體與經典 PTEN 形成復合體，增加 PTEN 誘導推定激酶 1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）蛋白水平，維持線粒體穩定，促進線粒體產能[15]。
1.2 PTEN 蛋白分布
PTEN 與張力蛋白（細胞骨架黏著斑相關蛋白）、輔助蛋白（突觸囊泡運輸相關蛋白）有同源性，在細胞質廣泛表達。PTEN 蛋白在細胞核中以單泛素化形式存在，其特殊位點賴氨酸殘基泛素化可調節 PTEN 在細胞核-細胞質中的分布，泛素特異性蛋白酶 7（ubiquitin specific protease 7，USP7）輔助 PTEN 蛋白進入細胞核，并與早幼粒細胞白血病體（functional promyelocytic leukaemia protein nuclear bodies，PML nuclear bodies）異常分布于細胞核中[16-18]。
1.3 PTEN 蛋白功能
PTEN 雙特異性磷酸酶的主要底物是磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3），通過 PIP3 去磷酸化為磷脂酰肌醇 4,5-雙磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2），抑制絲/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）活性，負性調節 PI3K-AKT 通路，影響細胞能量代謝、細胞生長、細胞凋亡和遷移。PTEN 蛋白酪氨酸磷酸酶作用于黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）以及 SH2 包含蛋白（SH2 containing protein，Shc），通過去磷酸化作用調節細胞通路，影響細胞黏附和遷移[19]。PTEN 蛋白在細胞核內調節著絲點穩定性，維持濃縮染色質結構，修復損傷的雙鏈 DNA，調節細胞周期、調控細胞衰老[20-24]。
PTEN 蛋白在整個胚胎發育期廣泛、高度表達，早在 3.5 d 囊胚期的胚胎組織以及胚外組織中即可檢測到，是胚胎細胞增殖、發育、遷移、死亡等一系列生長發育活動的重要標志。PTEN 基因表達調控 T 細胞增殖與功能，參與 NK 細胞發育以及抗體類型轉換，也參與肺臟發育、代謝和功能[25]。
2 PTEN 抑癌基因在 IPF 發病機制中的作用
2.1 IPF 發病機制現狀
2.1.1 肺泡上皮細胞微損傷
肺泡上皮細胞位于肺泡腔與肺間質間，是肺天然的物理屏障與免疫屏障。持續刺激導致肺泡上皮細胞損傷以及肺泡結構破壞，肺泡再生障礙以及異常激活是引起 IPF 的始動因素。編碼調節肺泡上皮細胞抗壓能力、表面活性物質穩定性，染色體端粒酶長度等基因突變導致肺泡上皮細胞對外界刺激敏感性增加[26]。環境中金屬或有機成分的可吸入顆粒增加 IPF 發病風險，EB 病毒、皰疹病毒等病毒感染導致潛在的肺泡上皮損傷[8, 27]。慢性病如胃食管反流病、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥與肺泡低通氣等對 IPF 發生、發展有促進作用[28-29]。衰老導致肺泡上皮細胞老化以及再生能力衰竭在肺纖維化中亦起到一定作用[30]。
具有遺傳易感性個體暴露在特定環境中，在自身基礎疾病相互作用下肺泡上皮持續受到刺激，肺泡上皮損傷再生修復功能受損，最終導致肺泡完整性破壞、肺泡陷閉，啟動纖維化程序，發生級聯效應。
2.1.2 肺泡上皮細胞異常激活
肺泡上皮損傷后釋放炎癥因子導致毛細血管通透性增加，纖維蛋白原、纖維連接蛋白滲出至肺間質及肺泡腔，形成最初暫時的細胞外基質，間質內其他細胞成分對細胞增殖信號產生應答，遷移至裸露肺泡基底膜維持上皮屏障，釋放細胞因子刺激肺泡間質細胞遷移參與修復。激活的凝血因子 X（factor X，FX）使凝血酶原轉化為凝血酶，剪切纖維蛋白原為纖維蛋白。肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cells，AEC）分泌纖溶酶原激活物抑制因子 1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI1），形成抗纖溶和高凝的微環境，使基質降解減少。Ⅱ型肺泡上皮細胞分化為Ⅰ型肺泡上皮細胞受到抑制，細胞內促凋亡蛋白[半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和 Bcl-2 相關 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表達升高，抗凋亡作用的 B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2 gene，Bcl-2）蛋白表達降低，凋亡增加[31]。晚期糖機化終產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）和 CD151 等減少可抑制Ⅰ型肺泡上皮識別基底膜，出現再上皮化障礙[32-33]。肺泡內含 SH2 結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶-2（SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2，Shp2）蛋白減少導致表面活性物質穩定性降低，促進上皮細胞凋亡[34]。
細胞外基質和凝血級聯反應中釋放的活性蛋白酶參與纖維化組織重塑以及上皮細胞向間質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。凝血酶和活化 FX 通過蛋白酶活性受體-1 誘導肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化[32]。同時涉及形態發生相關細胞因子 TGF-β、shh、Wnt/β-catenin、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor ，FGF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、Notch 等在此過程中被激活，促進 EMT 轉化增加[35]。
EMT 是極化的上皮細胞轉變為間葉細胞，通常發生在胚胎細胞層運動和腫瘤細胞浸潤中，是上皮細胞可塑性的表現。EMT 過程中上皮細胞相關蛋白上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）和閉鎖小帶（zonula occludens，ZO-1）表達下調，間質細胞特征蛋白波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和纖連蛋白（fibronectin）表達上調[36]。EMT 直接增加間質細胞數量，細胞本身合成細胞外基質能力增強，釋放大量趨化因子，細胞因子激活，募集附近的成纖維細胞使信號級聯放大。
2.1.3 上皮細胞-成纖維細胞信號關聯并激活成纖維細胞增殖
肺泡上皮損傷后可分泌 TGF-β，能夠直接促進纖維化[37]。具體表現為上皮細胞表面傳感系統整合素（αvβ6、αvβ6 和 α3β1）和鈣黏著蛋白（如 E-cadherin/β-catenin）與基質中促炎因子溶血磷脂受體蛋白 2（LPA2）、Xa 及前體 TGF-β1 聯合，將其激活[38, 41]。同時細胞表面 Wnt 受體 LRP6 磷酸化增加，通過經典 Wnt 通路，產生酪氨酸磷酸化 β-catenin 以及磷酸化 Smads 等轉錄復合體，積累于細胞核，改變其基因轉錄狀態，釋放炎癥因子共同活化成纖維細胞，同時使其自身向肌成纖維細胞轉變[40, 42]。另外，基質中 TGF-β 誘導上皮細胞能夠高表達 shh 蛋白，通過正反饋模式進一步促進成纖維細胞 TGF-β 和 α-SMA 高表達，進一步增強纖維化效應[43-44]。
成纖維細胞與肌成纖維細胞過度合成和分泌細胞外基質，導致肺結構重塑，是 IPF 的最終表現。IPF 肺間質中肌成纖維細胞來源于三種成分：（1）外周循環血中一組特殊的白細胞亞群，能夠特異性表達 CD45、CD34 和纖維連接蛋白，通過細胞因子受體 CXCR4 識別 IPF 中 AEC 表達的 CXCL12 募集于肺泡間質[45]；（2）Ⅲ型肺泡上皮細胞，轉化為能夠表達 α-SMA 和神經鈣黏著蛋白（N-cadherin）的成纖維細胞；（3）肺間質組織中固有的成纖維細胞，在局部促纖維化生長因子 TGF-β、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）和腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）作用下轉變為肌成纖維細胞[46]。
2.2 PTEN 基因在 IPF 發病機制中的作用
PTEN 基因功能異常在遺傳性和散發的惡性腫瘤中均扮演重要“角色”。在腫瘤發生過程中，PTEN 基因突變或缺失直接導致 PTEN 蛋白雙特異性磷酸酶功能缺失，直接促進細胞增值、侵襲，抑制細胞發生凋亡。P53、PPARγ、NF-kB 等在轉錄水平上調節 PTEN 基因的表達，非編碼 RNA 調節轉錄后 mRNA 水平，PTEN 蛋白的泛素化、乙酰化以及與其他細胞內蛋白相互作用均與腫瘤的發生密切相關[47]。在 IPF 發生過程中，成纖維細胞廣泛增殖、遷移、抗凋亡，其本身即具有惡性疾病特征，而 IPF 患者本身易同時合并肺癌，與此同時，抑癌基因 PTEN 已被證實在 IPF 的發生、發展中起到重要作用，現總結如下。
2.2.1 PTEN 蛋白在 IPF 中活性顯著缺失
PTEN 在細胞內作用廣泛，針對蛋白表達的調控是復雜且精細的。多種信號通路調節 PTEN 基因轉錄，miRNA 和 ceRNA 調節 PTEN 轉錄后 mRNA 穩定性，PTEN 蛋白的磷酸化、乙酰化等可正性或負性調節 PTEN 蛋白穩定性，酶活性以及細胞內定位[25]。PTEN 基因表達、PTEN 蛋白水平、PTEN 蛋白磷酸酶活性在 IPF 來源的成纖維細胞中較正常成纖維細胞顯著降低[48]。IPF 成纖維細胞灶中與 PTEN 結合的膜蛋白微囊蛋白 1（caveolin-1）低表達，從而導致細胞膜微環境中 PTEN 磷酸酶活性的相對缺失，進而導致 PI3K/AKT 異常激活[49]。PTEN 在 IPF 中功能缺失還與翻譯后修飾有關，Geng 等[50]發現 USP13 與 PTEN 相互作用，并介導 PTEN 蛋白在 IPF 成纖維細胞中泛素化。
2.2.2 PTEN 蛋白缺失具有顯著致纖維化作用
（1）肺泡上皮完整性被破壞：小鼠支氣管肺泡上皮特異性敲除 PTEN 基因后發現肺泡上皮緊密連接（TJs）分解及基底膜降解增加，上皮來源的肌成纖維細胞增加。博來霉素處理后上皮細胞磷酸化 AKT、磷酸化 S6K、Snail 和基質金屬蛋白酶表達增加，緊密連接蛋白-4（Claudin-4）、E-cadherin、β-catenin 和層黏連蛋白 β1（laminin-β1）表達下降[51]。在 IPF 中，PTEN 對肺泡上皮細胞完整性起關鍵的門控作用，PTEN 缺失使上皮細胞對損傷刺激因素敏感性增加。
（2）促進成纖維細胞分化，促進成纖維細胞侵襲、遷移：PTEN 基因敲除后成纖維細胞 α-SMA、膠原蛋白表達上調，PTEN 基因過表達后抑制 TGF-β 誘導其分化為肌成纖維細胞[48]。Geng 等[52]進一步研究表明 PTEN 表達缺失使正常的成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，細胞增殖加快，侵襲、遷移能力增加，并且低氧可下調 PTEN 表達。對成纖維細胞侵襲表型進行轉錄組測定，PTEN 基因與基質金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinase，MMP-13）、TGF-β1、caveolin-1 和分泌型卷曲相關蛋白 1（secreted frizzled-related proteins 1，Sfrp1）對成纖維細胞侵襲行有明顯調控作用[53]。動物實驗發現 PTEN 基因缺失小鼠博來霉素誘導發生 IPF 后死亡率明顯增加，PTEN 缺失使肺泡上皮細胞易損傷，同時導致參與修復的成纖維細胞功能異常（圖 1）。PTEN 基因及其功能在肺間質纖維化發病的多個關鍵環節起到重要作用。
圖1
PTEN 基因在 IFP 發病過程中的作用
PTEN 對肺泡上皮細胞穩定性起到門控作用，PTEN 缺失促進損傷導致基底膜降解，緊密連接，抑制上皮細胞發生 EMT，抑制肺間質來源的成纖維細胞分化為肌成纖維細胞、分泌細胞外基質，促進外周的巨噬細胞、T 淋巴細胞募集至成纖維細胞灶參與損傷引起的炎癥與修復（→為促進作用，┻為抑制或拮抗作用）
（3）誘導成纖維細胞抗凋亡表型，抑制成纖維細胞發生自噬：細胞外基質收縮可激活正常成纖維細胞內 PTEN 蛋白，發揮雙特異性磷酸酶活性，拮抗 PI3K 活性，下調磷酸化 AKT 水平，誘導成纖維細胞發生凋亡。而 PTEN 基因缺失的成纖維細胞通過 β1 整合素激活 PI3K-Akt-S6K1 通路，使得磷酸化 AKT 水平升高，使成纖維細胞具有抗膠原誘導的細胞凋亡表型，并通過激活 PI3K-AKT-mTOR 途徑，抑制成纖維細胞自噬活性，最終導致 IPF 中成纖維細胞在 ECM 異常增殖（圖 2）[54-56]。
Fox3a 轉錄因子通過上調細胞周期抑制因子 P27 阻抑有絲分裂細胞 G1 期向 S 期過渡。Fox3a 與 caveolin-1 啟動子區結合后，可增加其轉錄和蛋白表達，caveolin-1 過表達可增加 Fas 水平以及 caspase-3/7 活性，促進成纖維細胞發生Ⅰ型膠原誘導的凋亡。而 IPF 患者肺組織活檢中發現 caveolin-1、Fas、caspase-3/7 表達下降，PTEN 缺失導致高活性 AKT 磷酸化 Fox3a 而使其失去活性，導致微管相關蛋白 1a/1b 輕鏈 3B（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B，LC3-B）轉錄減少，降低成纖維細胞自噬活性，促進其在膠原基質中增殖（圖 2）[57-59]。
（4）纖維化相關細胞因子分泌失衡：IPF 肺纖維化發生初期，損傷修復反應中亦產生抑制纖維化的細胞因子（如前列腺素 E2），但研究發現纖維化反應中的成纖維細胞對前列腺素 E2 并不敏感，主要是由于具有高度活性的磷酸化 AKT 介導前列腺素 E2 受體啟動子區甲基化，使細胞合成前列腺素 E2 受體減少，降低了細胞對基質中前列腺素 E2 的敏感性（圖 2）[60]。
圖2
PTEN 基因促纖維化的分子機制
PTEN 特異性雙磷酸酶活性作用于底物 PIP3，去磷酸化從而抑制 PI3K-AKT 通路。當 PTEN 缺乏時，細胞 AKT 活性增強，通過磷酸化使活性 FoxO3a 減少，P27 轉錄減少，對 CDK 抑制作用減弱，促進細胞增殖；活性 FoxO3a 的降低減少 Caveolin-1 轉錄與表達，降低 Fas 水平，降低 Caspase-3/7 活性，誘導抗凋亡表型；FoxO3a 降低通過減少 LC3-B 轉錄抑制細胞自噬；磷酸化 AKT 激活下游 mTOR，通過抑制 LC3-B 降低細胞自噬活性。活性 AKT 通過前列腺素 E2 受體基因上啟動子區甲基化作用，減少前列腺素 E2 受體表達，使細胞對抗纖維化細胞因子前列腺素 E2 不敏感
骨髓 PTEN 缺陷小鼠在應用博來霉素誘導后，肺組織表現出 TGF-β1 活化，膠原沉積增加，前膠原蛋白、賴氨酰氧化酶表達增加；肺泡灌洗液中巨噬細胞、T 細胞數量下降，炎癥細胞募集功能受損（圖 1），肺巨噬細胞極化異常，促纖維化因子 IL-6 以及 TNF-α 合成、分泌增加[61]。PTEN 缺失可導致細胞炎癥反應失衡，促纖維化因子釋放增多，抗纖維化因子相對不足，維持纖維化狀態。
應用 VEGF 抑制劑治療博來霉素誘導 IPF 蛋白組學的研究顯示，PI3K-Akt 信號通路與 Wnt 信號通路有顯著促纖維化作用；自然殺傷細胞信號通路（NK signaling）與 PTEN 信號通路具有顯著抗纖維化作用，VEGF 抑制劑誘導 SHIP-1 過表達，導致 PTEN 信號增加，介導抗纖維化效應；雷帕霉素（mTOR）和細胞外信號調節激酶（ERK）為促纖維化和抗纖維化反應的關鍵介質，PTEN 通過抑制 PI3K-AKT-mTOR 通路調節纖維化反應中 mTOR[62]。
3 結論與展望
PTEN 作為具有特異性雙磷酸酶活性的抑癌基因，通過去磷酸化細胞內重要信號分子如 PIP3，抑制 PI3K-AKT 信號通路，抑制活化 AKT 下游細胞信號分子。PTEN 蛋白及其活性在 IPF 時顯著降低，PTEN 缺失破壞肺泡上皮細胞完整性，促進成纖維細胞分化、遷移，抑制成纖維細胞發生自噬、凋亡，導致細胞炎癥反應失衡，促纖維化細胞因子分泌增加，抗纖維化細胞因子分泌不足。PTEN 基因在 IPF 發生、發展過程中起重要作用，為該病的基因治療提供了新靶點。
