引用本文： 孫云暉, 王一新, 馬雪梅, 楊曉東, 鮑文華. 白細胞介素-37 及相關因子在急性肺損傷大鼠模型中的作用及意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(6): 586-590. doi: 10.7507/1671-6205.201705055 復制
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指由嚴重感染、損傷、休克等多種因素所導致的進行性加重以低氧血癥為特征的急性呼吸功能不全或呼吸衰竭[1]。其發病機制尚未完全闡明，現有的研究結果認為過度失調的炎癥反應是導致 ALI 發生、發展的最為重要的因素之一[2]。白細胞介素（interleukin，IL）-37 是 IL-1 家族細胞因子，目前認為 IL-37 可通過負反饋調節機制調節先天性及固有免疫應答，通過抑制促炎細胞因子、趨化因子等的產生和對基因轉錄調節，從而抑制過度炎癥反應[3]。已有研究表明 IL-37 可通過調控 IL-18、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）在類風濕關節炎、潰瘍性結腸炎等炎癥及免疫性疾病中起重要作用，但在 ALI 中鮮有研究。本實驗觀察 ALI 大鼠肺組織中 IL-37 水平、IL-18 mRNA 表達以及血清 TNF-α 含量，旨在闡明 IL-37 及相關因子在 ALI 發病機制中的作用及意義。
1 材料與方法
1.1 材料
注射用鹽酸博來霉素（海正輝瑞制藥有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑（湖北錦源醫療科技有限公司）；Nikon eclipse 50i 顯微鏡（北京中儀光科科技發展有限公司提供）；IL-37、TNF-α 大鼠酶聯免疫吸附試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司），RNA 提取試劑盒 (北京艾德萊生物科技有限公司)，cDNA 反轉錄試劑盒及 PCR 試劑盒 (大連寶生物工程有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物和分組
健康清潔級 Wistar 大鼠 45 只（雌雄各半），6 周齡，體重 180～220 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物學部提供[許可證號：SCXK(黑)2013-001]。隨機分為健康對照組、博來霉素組和地塞米松治療組，每組各 15 只大鼠，于佳木斯大學實驗動物中心飼養。并按實驗動物使用 3R 原則給予人道主義關懷。
1.2.2 模型建立及標本留取
博來霉素組、地塞米松治療組處理方案參照文獻[4]的方法并在該方法上改進，以博來霉素 4 mg/kg 劑量一次性快速推注至氣管內，健康對照組給予等體積生理鹽水。地塞米松治療組大鼠于 ALI 造模基礎上第 2 d 開始每日腹腔注射地塞米松 3 mg/kg，健康對照組、博來霉素組大鼠腹腔注射生理鹽水作為對照。各組大鼠于造模后 7、14、28 d 處死，收集大鼠血液 5 ml，離心留取血清，用于檢測 TNF-α 水平；取右肺組織置于 10% 甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋、常規切片 HE 染色，觀察肺組織結構的動態變化；左肺組織放入 Eppendorf 管內，–80 ℃ 保存，用于 IL-37 水平、IL-18 mRNA 檢測。
1.2.3 酶聯免疫吸附法檢測肺組織 IL-37、血清 TNF-α 水平
嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用全自動酶標儀依序測量 450 nm 處各孔的吸光度，各標本檢測 3 次，取其平均值。
1.2.4 實時熒光定量 PCR 法檢測肺組織 IL-18 mRNA 表達水平
提取肺組織總 RNA，反轉錄為 cDNA。目的基因 IL-18 mRNA 上游引物 5′-GAGGACTGGCTGTGACCCTATC-3′，下游引物 5′-CCTGGCACACGTTTCTGAAA-3′，擴增片段 151 bp；內參照 β-actin mRNA 上游引物 5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增片段 150 bp。PCR 反應條件嚴格按照試劑盒說明書進行，各標本檢測 3 次，取其平均值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件。實驗結果采用均數±標準差（
）表示，多組均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較應用 LSD-t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠肺組織病理觀察
健康對照組大鼠在各時間點肺組織結構完整，氣道上皮光滑，肺泡壁正常，肺間質無炎細胞滲出浸潤，無纖維化改變。博來霉素組、地塞米松治療組大鼠肺組織在建模早期階段表現為肺泡炎改變，肺間質和肺泡腔內可見大量炎細胞浸潤，此后炎癥隨時間推移逐漸減輕；第 14 d 炎癥細胞較前減少，肺泡間隔增寬，肺泡結構消失，成纖維細胞增生；第 28 d 時肺組織結構紊亂，肺實質片狀融合，肺泡間隔明顯增寬，肺組織呈明顯纖維化改變。地塞米松治療組與博來霉素組比較，同一時間纖維化程度減輕，肺泡間隔增厚減輕。結果見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理像（HE×200） a. 健康對照組，大鼠肺組織結構完整，氣道上皮光滑，肺泡壁正常，肺間質無炎細胞滲出浸潤，無纖維化改變； b. 博來霉素組第 7 d，肺間質和肺泡腔內可見大量巨噬細胞等炎細胞浸潤； c. 博來霉素組第 28 d，肺組織結構紊亂，肺實質片狀融合，肺泡間隔明顯增寬，肺組織呈明顯纖維化改變； d. 地塞米松治療組第 28 d，肺泡結構存在，炎癥細胞浸潤減少，肺泡間隔輕微增厚
2.2 大鼠肺組織 IL-37 及血清 TNF-α 含量
博來霉素組、地塞米松治療組 IL-37、TNF-α 含量于第 7 d 達高峰，后逐漸降低，于第 28 d 仍高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表 1、2。
表1
IL-37 在各組大鼠肺組織中含量比較（pg/ml，
）
表2
TNF-α 在各組大鼠血清中表達水平（pg/ml，
）
2.3 大鼠肺組織中 IL-18 mRNA 表達水平
IL-18 mRNA 擴增圖見圖 2。隨著時間進展博來霉素組、地塞米松治療組肺組織 IL-18 mRNA 表達于第 7 d 達高峰，后逐漸下降，于第 28 d 仍高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 3。
表3
IL-18 mRNA 在各組大鼠肺組織中表達水平（
）
圖2
IL-18 mRNA 擴增圖
3 討論
IL-37 是由 Kumar 等[5]于 2000 年利用計算機序列分析發現，2001 年被證實為 IL-1 家族第 7 個細胞因子，遂命名為 IL-1F7，2010 年更名為 IL-37[6]。IL-37 可顯著性抑制體內多種促炎因子、趨化因子表達，從而產生免疫抑制效應[7]。IL-18 是 1995 年 Okamura 等[8]在脂多糖誘導的小鼠中毒性休克的肝臟中提取出來的，可誘導 T 細胞產生 TNF-α、IL-1β、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子及一氧化氮等的生成[9]。TNF-α 一直被認為是一種促炎因子，可以影響調節性 T 細胞表達、擴增及其抑制功能，并參與炎癥的啟動與發展。
IL-37 參與機體炎癥反應及多種免疫性疾病。在感染性疾病中，有學者通過流式細胞計數檢測細菌脂多糖誘導的感染性休克小鼠的脾細胞內雙陽性樹突狀細胞（dendritic cell，DC）占 DC 的百分率，發現 IL-37 轉基因小鼠脾臟內雙陽性 DC 細胞比例明顯低于野生型小鼠，表明 IL-37 可通過抑制炎性細胞因子合成和下調 DC 活化，發揮抗炎作用[10]。Sakai 等[11]發現，重組 IL-37a 能夠改善小鼠肝臟缺血再灌注損傷，建立小鼠肝臟缺血再灌注模型后，部分小鼠腹腔注射重組 IL-37a，與非注射組小鼠相比，血清中 TNF-α 表達量下降。IL-37 可與 IL-18 結合蛋白結合形成復合物而抑制 IL-18 的信號轉導通路，抑制促炎因子表達，下調炎癥應答反應[12]。ALI 中，促炎細胞因子激活，肺泡巨噬細胞、中性粒細胞在肺內大量聚集，釋放多種介質加重肺損傷。本實驗旨在探討 IL-37 細胞相關因子在 ALI 中的炎癥作用及意義。
本研究結果顯示，在建模早期階段大鼠肺組織 IL-37 含量、IL-18 mRNA 表達明顯升高，隨后逐漸降低，推測主要因為抑炎因子 IL-37 與促炎因子 IL-18 發揮相互抑制作用。急性炎癥中，高水平表達的 IL-37 可反饋性抑制炎癥因子 IL-18 表達，從而下調炎癥反應，保護機體免受炎癥損害。許桂芳等[13]通過檢測痛風患者急性發作期及完全緩解期血清 IL-37、IL-18 表達，發現急性發作期 IL-37、IL-18 水平遠高于完全緩解期，與本研究結果相似。表明 IL-37、IL-18 確實參與炎癥反應階段，并發揮作用。此外，本研究發現，血清中 TNF-α 與肺組織 IL-37 在早期炎癥反應階段均呈明顯升高趨勢，后期逐漸降低。相關研究表明，在類風濕關節炎疾病活動期，IL-37 表達水平與促炎因子 TNF-α 和 IL-17A 呈正相關[14]，這與本研究結果類似。證明抑炎因子 IL-37 與炎癥因子 IL-18、TNF-α 確實在急性炎癥反應階段發揮相互作用，并抑制炎癥的進一步發展。ALI 主要表現為急性肺泡炎，肺泡上皮的損傷導致屏障功能下降，肺泡滲出增多，上皮細胞及Ⅱ型上皮細胞的完整性的破壞導致肺泡清除障礙，表面活性物質合成減少，后期導致肺纖維化形成。Imaeda 等[15]研究證實 IL-37 可通過阻止 T 細胞激活，抑制 DC 活化增殖；可以下調 TLR-4/NF-κB 信號通路，抑制 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表達；明顯抑制 p38 的磷酸化，并少許抑制 ERK1/2 的磷酸化反應；抑制 DC 激活幼稚 T 細胞和抗原特異性 T 細胞的能力，而促進 DC 誘導 Treg 細胞，增強 Treg 細胞在致敏期的作用[16]。IL-18 可促進 IL-9、IL-13、TNF-α 及粒細胞巨噬細胞集落刺激因子等的表達[17]，并誘導細胞間黏附分子-1 的表達促進炎細胞募集，上調 NF-κB 的表達和活性[18]。IL-18 參與肺纖維化模型早期肺損傷階段，并與調控多種細胞因子表達有關。在本研究中，與博來霉素組比較，地塞米松治療組肺組織 IL-37 和 TNF-α 的含量與血清中 IL-18 mRNA 的表達均不同程度地降低，在建模早期階段的肺泡炎改變以及后期的肺纖維化改變均更輕微，表明地塞米松干預可有效抑制建模早期的肺組織炎癥反應和后期的纖維化。作為糖皮質激素類藥物，地塞米松的抗纖維化作用機制與抑制淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，以及抑制巨噬細胞增殖和分泌等有關[19-20]。本研究進一步印證了地塞米松的抗纖維化作用。
本研究僅初步探討了 IL-37 及相關因子在 ALI 中的作用及意義，結果表明 IL-37 在大鼠 ALI 發病過程中起重要作用，該作用可能與調控 IL-18、TNF-α 轉導有關。其具體機制有待進一步探究。同時本實驗樣本量較小，各因子之間是否呈相關性有待進一步研究。
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指由嚴重感染、損傷、休克等多種因素所導致的進行性加重以低氧血癥為特征的急性呼吸功能不全或呼吸衰竭[1]。其發病機制尚未完全闡明，現有的研究結果認為過度失調的炎癥反應是導致 ALI 發生、發展的最為重要的因素之一[2]。白細胞介素（interleukin，IL）-37 是 IL-1 家族細胞因子，目前認為 IL-37 可通過負反饋調節機制調節先天性及固有免疫應答，通過抑制促炎細胞因子、趨化因子等的產生和對基因轉錄調節，從而抑制過度炎癥反應[3]。已有研究表明 IL-37 可通過調控 IL-18、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）在類風濕關節炎、潰瘍性結腸炎等炎癥及免疫性疾病中起重要作用，但在 ALI 中鮮有研究。本實驗觀察 ALI 大鼠肺組織中 IL-37 水平、IL-18 mRNA 表達以及血清 TNF-α 含量，旨在闡明 IL-37 及相關因子在 ALI 發病機制中的作用及意義。
1 材料與方法
1.1 材料
注射用鹽酸博來霉素（海正輝瑞制藥有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑（湖北錦源醫療科技有限公司）；Nikon eclipse 50i 顯微鏡（北京中儀光科科技發展有限公司提供）；IL-37、TNF-α 大鼠酶聯免疫吸附試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司），RNA 提取試劑盒 (北京艾德萊生物科技有限公司)，cDNA 反轉錄試劑盒及 PCR 試劑盒 (大連寶生物工程有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物和分組
健康清潔級 Wistar 大鼠 45 只（雌雄各半），6 周齡，體重 180～220 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物學部提供[許可證號：SCXK(黑)2013-001]。隨機分為健康對照組、博來霉素組和地塞米松治療組，每組各 15 只大鼠，于佳木斯大學實驗動物中心飼養。并按實驗動物使用 3R 原則給予人道主義關懷。
1.2.2 模型建立及標本留取
博來霉素組、地塞米松治療組處理方案參照文獻[4]的方法并在該方法上改進，以博來霉素 4 mg/kg 劑量一次性快速推注至氣管內，健康對照組給予等體積生理鹽水。地塞米松治療組大鼠于 ALI 造模基礎上第 2 d 開始每日腹腔注射地塞米松 3 mg/kg，健康對照組、博來霉素組大鼠腹腔注射生理鹽水作為對照。各組大鼠于造模后 7、14、28 d 處死，收集大鼠血液 5 ml，離心留取血清，用于檢測 TNF-α 水平；取右肺組織置于 10% 甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋、常規切片 HE 染色，觀察肺組織結構的動態變化；左肺組織放入 Eppendorf 管內，–80 ℃ 保存，用于 IL-37 水平、IL-18 mRNA 檢測。
1.2.3 酶聯免疫吸附法檢測肺組織 IL-37、血清 TNF-α 水平
嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用全自動酶標儀依序測量 450 nm 處各孔的吸光度，各標本檢測 3 次，取其平均值。
1.2.4 實時熒光定量 PCR 法檢測肺組織 IL-18 mRNA 表達水平
提取肺組織總 RNA，反轉錄為 cDNA。目的基因 IL-18 mRNA 上游引物 5′-GAGGACTGGCTGTGACCCTATC-3′，下游引物 5′-CCTGGCACACGTTTCTGAAA-3′，擴增片段 151 bp；內參照 β-actin mRNA 上游引物 5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增片段 150 bp。PCR 反應條件嚴格按照試劑盒說明書進行，各標本檢測 3 次，取其平均值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件。實驗結果采用均數±標準差（
）表示，多組均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較應用 LSD-t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠肺組織病理觀察
健康對照組大鼠在各時間點肺組織結構完整，氣道上皮光滑，肺泡壁正常，肺間質無炎細胞滲出浸潤，無纖維化改變。博來霉素組、地塞米松治療組大鼠肺組織在建模早期階段表現為肺泡炎改變，肺間質和肺泡腔內可見大量炎細胞浸潤，此后炎癥隨時間推移逐漸減輕；第 14 d 炎癥細胞較前減少，肺泡間隔增寬，肺泡結構消失，成纖維細胞增生；第 28 d 時肺組織結構紊亂，肺實質片狀融合，肺泡間隔明顯增寬，肺組織呈明顯纖維化改變。地塞米松治療組與博來霉素組比較，同一時間纖維化程度減輕，肺泡間隔增厚減輕。結果見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理像（HE×200） a. 健康對照組，大鼠肺組織結構完整，氣道上皮光滑，肺泡壁正常，肺間質無炎細胞滲出浸潤，無纖維化改變； b. 博來霉素組第 7 d，肺間質和肺泡腔內可見大量巨噬細胞等炎細胞浸潤； c. 博來霉素組第 28 d，肺組織結構紊亂，肺實質片狀融合，肺泡間隔明顯增寬，肺組織呈明顯纖維化改變； d. 地塞米松治療組第 28 d，肺泡結構存在，炎癥細胞浸潤減少，肺泡間隔輕微增厚
2.2 大鼠肺組織 IL-37 及血清 TNF-α 含量
博來霉素組、地塞米松治療組 IL-37、TNF-α 含量于第 7 d 達高峰，后逐漸降低，于第 28 d 仍高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表 1、2。
表1
IL-37 在各組大鼠肺組織中含量比較（pg/ml，
）
表2
TNF-α 在各組大鼠血清中表達水平（pg/ml，
）
2.3 大鼠肺組織中 IL-18 mRNA 表達水平
IL-18 mRNA 擴增圖見圖 2。隨著時間進展博來霉素組、地塞米松治療組肺組織 IL-18 mRNA 表達于第 7 d 達高峰，后逐漸下降，于第 28 d 仍高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 3。
表3
IL-18 mRNA 在各組大鼠肺組織中表達水平（
）
圖2
IL-18 mRNA 擴增圖
3 討論
IL-37 是由 Kumar 等[5]于 2000 年利用計算機序列分析發現，2001 年被證實為 IL-1 家族第 7 個細胞因子，遂命名為 IL-1F7，2010 年更名為 IL-37[6]。IL-37 可顯著性抑制體內多種促炎因子、趨化因子表達，從而產生免疫抑制效應[7]。IL-18 是 1995 年 Okamura 等[8]在脂多糖誘導的小鼠中毒性休克的肝臟中提取出來的，可誘導 T 細胞產生 TNF-α、IL-1β、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子及一氧化氮等的生成[9]。TNF-α 一直被認為是一種促炎因子，可以影響調節性 T 細胞表達、擴增及其抑制功能，并參與炎癥的啟動與發展。
IL-37 參與機體炎癥反應及多種免疫性疾病。在感染性疾病中，有學者通過流式細胞計數檢測細菌脂多糖誘導的感染性休克小鼠的脾細胞內雙陽性樹突狀細胞（dendritic cell，DC）占 DC 的百分率，發現 IL-37 轉基因小鼠脾臟內雙陽性 DC 細胞比例明顯低于野生型小鼠，表明 IL-37 可通過抑制炎性細胞因子合成和下調 DC 活化，發揮抗炎作用[10]。Sakai 等[11]發現，重組 IL-37a 能夠改善小鼠肝臟缺血再灌注損傷，建立小鼠肝臟缺血再灌注模型后，部分小鼠腹腔注射重組 IL-37a，與非注射組小鼠相比，血清中 TNF-α 表達量下降。IL-37 可與 IL-18 結合蛋白結合形成復合物而抑制 IL-18 的信號轉導通路，抑制促炎因子表達，下調炎癥應答反應[12]。ALI 中，促炎細胞因子激活，肺泡巨噬細胞、中性粒細胞在肺內大量聚集，釋放多種介質加重肺損傷。本實驗旨在探討 IL-37 細胞相關因子在 ALI 中的炎癥作用及意義。
本研究結果顯示，在建模早期階段大鼠肺組織 IL-37 含量、IL-18 mRNA 表達明顯升高，隨后逐漸降低，推測主要因為抑炎因子 IL-37 與促炎因子 IL-18 發揮相互抑制作用。急性炎癥中，高水平表達的 IL-37 可反饋性抑制炎癥因子 IL-18 表達，從而下調炎癥反應，保護機體免受炎癥損害。許桂芳等[13]通過檢測痛風患者急性發作期及完全緩解期血清 IL-37、IL-18 表達，發現急性發作期 IL-37、IL-18 水平遠高于完全緩解期，與本研究結果相似。表明 IL-37、IL-18 確實參與炎癥反應階段，并發揮作用。此外，本研究發現，血清中 TNF-α 與肺組織 IL-37 在早期炎癥反應階段均呈明顯升高趨勢，后期逐漸降低。相關研究表明，在類風濕關節炎疾病活動期，IL-37 表達水平與促炎因子 TNF-α 和 IL-17A 呈正相關[14]，這與本研究結果類似。證明抑炎因子 IL-37 與炎癥因子 IL-18、TNF-α 確實在急性炎癥反應階段發揮相互作用，并抑制炎癥的進一步發展。ALI 主要表現為急性肺泡炎，肺泡上皮的損傷導致屏障功能下降，肺泡滲出增多，上皮細胞及Ⅱ型上皮細胞的完整性的破壞導致肺泡清除障礙，表面活性物質合成減少，后期導致肺纖維化形成。Imaeda 等[15]研究證實 IL-37 可通過阻止 T 細胞激活，抑制 DC 活化增殖；可以下調 TLR-4/NF-κB 信號通路，抑制 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表達；明顯抑制 p38 的磷酸化，并少許抑制 ERK1/2 的磷酸化反應；抑制 DC 激活幼稚 T 細胞和抗原特異性 T 細胞的能力，而促進 DC 誘導 Treg 細胞，增強 Treg 細胞在致敏期的作用[16]。IL-18 可促進 IL-9、IL-13、TNF-α 及粒細胞巨噬細胞集落刺激因子等的表達[17]，并誘導細胞間黏附分子-1 的表達促進炎細胞募集，上調 NF-κB 的表達和活性[18]。IL-18 參與肺纖維化模型早期肺損傷階段，并與調控多種細胞因子表達有關。在本研究中，與博來霉素組比較，地塞米松治療組肺組織 IL-37 和 TNF-α 的含量與血清中 IL-18 mRNA 的表達均不同程度地降低，在建模早期階段的肺泡炎改變以及后期的肺纖維化改變均更輕微，表明地塞米松干預可有效抑制建模早期的肺組織炎癥反應和后期的纖維化。作為糖皮質激素類藥物，地塞米松的抗纖維化作用機制與抑制淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，以及抑制巨噬細胞增殖和分泌等有關[19-20]。本研究進一步印證了地塞米松的抗纖維化作用。
本研究僅初步探討了 IL-37 及相關因子在 ALI 中的作用及意義，結果表明 IL-37 在大鼠 ALI 發病過程中起重要作用，該作用可能與調控 IL-18、TNF-α 轉導有關。其具體機制有待進一步探究。同時本實驗樣本量較小，各因子之間是否呈相關性有待進一步研究。
