引用本文： 李娟芝, 余勤, 汪小亞, 張秀麗, 趙宏. 慢性間歇性低氧激活內質網應激介導大鼠腎臟損傷. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(4): 350-353. doi: 10.7507/1671-6205.201702002 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是一種常見的呼吸系統疾病，特征為睡眠期間上呼氣道的部分或完全反復發生阻塞，導致睡眠片段化、低氧血癥和高碳酸血癥。OSAHS患病率較高，在一般人群中為 2%~4%，在肥胖人群中為 35%~45%[1]。慢性間歇缺氧（CIH）是 OSAHS 最主要的特征。CIH 可以引起一系列靶器官功能受損，在不伴高血壓或糖尿病的重度 OSAHS 患者中可導致慢性腎臟病（CKD）[2]，但其機制尚不明確。因此，我們假設 CIH 可能參與腎損傷的發生和發展過程。內質網是細胞中最大的細胞器之一，是蛋白折疊、合成、轉運及蛋白轉錄后修飾的主要場所，而低氧環境會引起內質網功能障礙，影響蛋白質的折疊，使得未折疊和錯誤折疊的蛋白在內質網內腔中聚集，從而導致內質網應激（ERS）[3-4]。研究已證實ERS的激活參與足細胞損傷、系膜細胞損傷、腎小管上皮細胞損傷及腎臟纖維化[5-8]，而抑制ERS可以保護腎臟[9]。正常情況下，ERS能夠調節并使細胞內環境保持平衡，但持續長時間或強度過大的ERS能誘導細胞凋亡，這是ERS導致腎臟損傷的主要原因。ERS主要存在三條通路，其中包括 CHOP 通路，CHOP 作為一種轉錄因子，在ERS凋亡過程中起關鍵作用[10]。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和主要材料
SPF 級 Wistar 大鼠（180～210 g）購于蘭州大學基礎醫學院實驗動物中心。間歇性低氧倉及間歇性低氧設備，醫用壓縮氧氣（濃度>99.5%）、高純壓縮氮氣（濃度>99.99%）、壓縮空氣。普通飲食，高脂飲食（3% 膽固醇，0.2% 丙硫氧嘧啶，0.3% 膽酸鈉，10% 豬油，2% 蛋黃粉）。
1.2 方法
1.2.1 動物分組 SPF 級 48 只健康雄性 Wistar 大鼠，隨機分成 4 組，每組 6 只，分別為 A 組（常氧并普通飲食）、B 組（常氧并高脂飲食）、C 組（CIH 并普通飲食）和 D 組（CIH 并高脂飲食）。
1.2.2 CIH 動物模型 通過氣體控制程序向間歇性低氧模擬艙內循環充入純氮氣、純氧氣和壓縮空氣，每一循環為 120 s，其中包括低氧期（純氮氣 30 s+靜息 10 s）和復氧期（純氧氣 20 s+壓縮空氣 60 s），使低氧期模擬艙內氧濃度為 6%～7%，復氧期恢復至20%～21%。普通 CIH 組和高脂 CIH 組大鼠分別置于間歇性低氧艙內，而對照組和高脂組大鼠艙內持續給予等時間、等流量的壓縮空氣，每日通氣 8 h（9：00 AM 至 5：00 PM），連續 6 周，每周持續 7 d。
1.2.3 標本采集 造模 6 周后，大鼠禁食水 8 h。每組隨機取 6 只大鼠麻醉，取主動脈血 6 ml 置于 4 ℃ 冰箱2 h，4 ℃ 3 500 r/min 離心 15 min，抽取血清于 –80 ℃ 冰箱中保存，用于檢測血脂、半胱氨酸蛋白酶抑制劑 C（Cys-C）。快速暴露左右腎臟并取出，在冰板上去除包膜，將右腎置于 4% 多聚甲醛固定用于免疫組化，并將左腎腎皮質置于 2.5% 戊二醛中固定用于電鏡觀察。
1.2.4 電鏡觀察 取各組大鼠腎臟切成 1 mm×1 mm×1 mm 組織塊，1% 四氧化鋨后固定，緩沖液沖洗，乙醇逐級脫水，環氧樹脂浸透、包埋，切片機切片，厚度 60～80 nm，經醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染，在透射電子顯微鏡下觀察。
1.2.5 免疫組化檢測腎臟組織中 CHOP 表達 將制作好的腎臟組織蠟塊用石蠟切片機切成 4 μm 厚的石蠟切片，脫蠟脫水，0.01 mol/L PBS（pH7.4）沖洗 3 次，每次 5 min；每張切片加 3% 過氧化氫溶液。室溫下孵育 15 min，以阻斷內源性過氧化物酶。PBS 沖洗 3 次，每次 5 min。分別滴加 CHOP 抗體，4 ℃ 孵育 16 h。PBS 沖洗 3 次，每次 5 min；加入生物素標記的兔抗鼠 IgG，室溫下孵育 20 min 后用 PBS 洗 3 次，每次 5 min；加入抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶復合物室溫下孵育 30 min 后，用二氨基聯苯胺（DAB）顯色。顯色 2 min 后用蘇木精復染，常規梯度酒精脫水干燥，樹膠封片。用圖像分析系統（Image-Pro Plus 6.0）測量平均灰度值。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 22.0 軟件進行分析，數據以均數±標準差（ ）表示。組間比較用單因素方差分析和最小顯著差異法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 血清中 Cys-C 指標
B、C 組血清中 Cys-C 水平高于 A 組（P<0.05），D 組高于 A、B、C 組（P<0.05），而 B、C 組差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1。
表1
各組大鼠血清中 Cys-C 水平（n=6，
）
2.2 大鼠腎臟組織的腎小管上皮細胞超微結構變化
B、C、D 組中腎臟損傷以近曲小管為著。A 組腎小球及腎小管上皮刷狀緣未見明顯異常。B、C 組腎小管上皮細胞刷狀緣可見少量稀疏并有少量脫落，腎小球未見明顯異常。D 組腎小管上皮細胞可見刷狀緣脫落，少量的細胞核固縮及少量空泡形成，腎小球未見明顯異常。如圖 1 所示。提示 CIH、高脂飲食均可導致腎小管發生損傷，且 CIH 合并高脂飲食造成的腎小管損傷較為嚴重。
圖1
腎臟組織電鏡像 a．A 組（×7 500）：腎小管上皮細胞正常； b、c．B 組（×3 400）和 C 組（×4 600）：腎小管上皮細胞刷狀緣稀疏并有脫落； d．D 組（×1 700）：出現核固縮
2.3 腎臟組織中 CHOP 表達
CHOP 表達于近曲腎小管上皮細胞的胞漿中，陽性染色細胞呈棕黃色。圖 2 顯示四組大鼠 CHOP 蛋白表達定位，半定量分析（表 2）顯示 A 組平均灰度值與 B 組、C 組和 D 組有顯著差異（P<0.05）。B 組和 C 組無顯著差異（P>0.05）。D 組與 A、B、C 組比較有顯著差異（P<0.05）。CHOP 未表達于腎小球、遠曲腎小管及集合管中。
圖2
四組大鼠腎臟 CHOP 蛋白的免疫組化病理像（×400） a．A 組：正常腎小球及腎小管極少表達； b、c．B、C 組：腎小球無表達，近曲腎小管少量表達； d．D 組：腎小球無表達，腎小管大量表達
表2
各組大鼠腎臟組織 CHOP 蛋白表達（n=6，
）
3 討論
高脂血癥和 OSAHS 很常見，OSAHS 常伴有脂代謝功能紊亂，CIH 合并高脂飲食可引起多器官損傷，如心血管疾病、肺動脈高壓、非酒精性脂肪肝等[11]。但多數研究是以 CIH 為動物模型研究 OSAHS 病理機制。Cys-C 是評價腎早損的最優指標[12]，在 OSAHS 患者中是診斷腎早損的首選指標[13]。本實驗用血清中 Cys-C 指標檢測腎功能，通過建立 CIH 合并脂代謝紊亂的動物模型模擬 OSAHS 患者生活模式，研究 OSAHS 引起的腎臟損傷及發生機制；通過檢測大鼠血清中 Cys-C、腎臟近曲小管 CHOP 蛋白表達以及腎小球及腎小管的超微結構變化，發現 CIH、高脂可通過激活ERS使近曲腎小管上皮細胞發生凋亡從而導致腎功能異常，而 CIH 合并脂代謝紊亂對腎臟的損傷最為嚴重。
研究發現 OSAHS 患者存在氧化應激增強及炎性反應[14]。動物實驗提示 CIH 誘導氧化應激參與靶器官損傷[15-16]，高脂飲食可引起氧化損傷（活性氧類的生成和脂質過氧化）進而引起靶器官的損傷[17-18]。高脂引起組織細胞缺血，缺氧通過不同途徑引起激活細胞凋亡[19-20]，高脂還可引起血管內皮功能損傷，進而引起腎臟損傷[21]。可見 CIH、高脂可以通過不同途徑引起腎臟損傷，但兩者引起腎臟損傷的共同途徑有氧化應激反應。
研究發現 OSAHS 患者血清中有大量的游離 DNA，推測 OSAHS 患者出現了細胞凋亡[22]。高脂飲食可導致大鼠腎組織中凋亡細胞增多[23]。目前發現的凋亡途徑有兩種，其一為線粒體應激途徑，其二為ERS途徑。氧化應激可激活 ERS，并相互促進使靶器官的損傷[24]。ERS 發生于很多疾病中，包括腫瘤、糖尿病和炎癥等[25-27]。在 CIH 模型中的不同組織器官，如腦、心、肺，ERS 在通過細胞凋亡導致靶器官損傷的過程中起到重要作用。因此，我們提出 CIH 引起腎臟損傷是否也有 ERS 參與[28]。ERS 激活 PERK、IRE、ATF6 三條途徑使凋亡基因 CHOP 表達上調[29]。CHOP 的過度表達啟動凋亡途徑，使細胞發生凋亡。本實驗則發現ERS的標志性蛋白 CHOP 蛋白在高脂組、CIH 組、CIH 高脂組中大鼠腎臟組織表達較對照組升高，且在 CIH 高脂組中表達最高，提示 CIH 引起的腎功能異常與 ERS 有關。
綜上所述，我們的研究表明 CIH、高脂可激活 ERS 介導近曲腎小管上皮細胞發生凋亡，從而引起腎臟功能異常。該研究可為使用抑制 ERS 的藥物治療由 OSAHS 引起腎臟損傷提供理論基礎。
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是一種常見的呼吸系統疾病，特征為睡眠期間上呼氣道的部分或完全反復發生阻塞，導致睡眠片段化、低氧血癥和高碳酸血癥。OSAHS患病率較高，在一般人群中為 2%~4%，在肥胖人群中為 35%~45%[1]。慢性間歇缺氧（CIH）是 OSAHS 最主要的特征。CIH 可以引起一系列靶器官功能受損，在不伴高血壓或糖尿病的重度 OSAHS 患者中可導致慢性腎臟病（CKD）[2]，但其機制尚不明確。因此，我們假設 CIH 可能參與腎損傷的發生和發展過程。內質網是細胞中最大的細胞器之一，是蛋白折疊、合成、轉運及蛋白轉錄后修飾的主要場所，而低氧環境會引起內質網功能障礙，影響蛋白質的折疊，使得未折疊和錯誤折疊的蛋白在內質網內腔中聚集，從而導致內質網應激（ERS）[3-4]。研究已證實ERS的激活參與足細胞損傷、系膜細胞損傷、腎小管上皮細胞損傷及腎臟纖維化[5-8]，而抑制ERS可以保護腎臟[9]。正常情況下，ERS能夠調節并使細胞內環境保持平衡，但持續長時間或強度過大的ERS能誘導細胞凋亡，這是ERS導致腎臟損傷的主要原因。ERS主要存在三條通路，其中包括 CHOP 通路，CHOP 作為一種轉錄因子，在ERS凋亡過程中起關鍵作用[10]。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和主要材料
SPF 級 Wistar 大鼠（180～210 g）購于蘭州大學基礎醫學院實驗動物中心。間歇性低氧倉及間歇性低氧設備，醫用壓縮氧氣（濃度>99.5%）、高純壓縮氮氣（濃度>99.99%）、壓縮空氣。普通飲食，高脂飲食（3% 膽固醇，0.2% 丙硫氧嘧啶，0.3% 膽酸鈉，10% 豬油，2% 蛋黃粉）。
1.2 方法
1.2.1 動物分組 SPF 級 48 只健康雄性 Wistar 大鼠，隨機分成 4 組，每組 6 只，分別為 A 組（常氧并普通飲食）、B 組（常氧并高脂飲食）、C 組（CIH 并普通飲食）和 D 組（CIH 并高脂飲食）。
1.2.2 CIH 動物模型 通過氣體控制程序向間歇性低氧模擬艙內循環充入純氮氣、純氧氣和壓縮空氣，每一循環為 120 s，其中包括低氧期（純氮氣 30 s+靜息 10 s）和復氧期（純氧氣 20 s+壓縮空氣 60 s），使低氧期模擬艙內氧濃度為 6%～7%，復氧期恢復至20%～21%。普通 CIH 組和高脂 CIH 組大鼠分別置于間歇性低氧艙內，而對照組和高脂組大鼠艙內持續給予等時間、等流量的壓縮空氣，每日通氣 8 h（9：00 AM 至 5：00 PM），連續 6 周，每周持續 7 d。
1.2.3 標本采集 造模 6 周后，大鼠禁食水 8 h。每組隨機取 6 只大鼠麻醉，取主動脈血 6 ml 置于 4 ℃ 冰箱2 h，4 ℃ 3 500 r/min 離心 15 min，抽取血清于 –80 ℃ 冰箱中保存，用于檢測血脂、半胱氨酸蛋白酶抑制劑 C（Cys-C）。快速暴露左右腎臟并取出，在冰板上去除包膜，將右腎置于 4% 多聚甲醛固定用于免疫組化，并將左腎腎皮質置于 2.5% 戊二醛中固定用于電鏡觀察。
1.2.4 電鏡觀察 取各組大鼠腎臟切成 1 mm×1 mm×1 mm 組織塊，1% 四氧化鋨后固定，緩沖液沖洗，乙醇逐級脫水，環氧樹脂浸透、包埋，切片機切片，厚度 60～80 nm，經醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染，在透射電子顯微鏡下觀察。
1.2.5 免疫組化檢測腎臟組織中 CHOP 表達 將制作好的腎臟組織蠟塊用石蠟切片機切成 4 μm 厚的石蠟切片，脫蠟脫水，0.01 mol/L PBS（pH7.4）沖洗 3 次，每次 5 min；每張切片加 3% 過氧化氫溶液。室溫下孵育 15 min，以阻斷內源性過氧化物酶。PBS 沖洗 3 次，每次 5 min。分別滴加 CHOP 抗體，4 ℃ 孵育 16 h。PBS 沖洗 3 次，每次 5 min；加入生物素標記的兔抗鼠 IgG，室溫下孵育 20 min 后用 PBS 洗 3 次，每次 5 min；加入抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶復合物室溫下孵育 30 min 后，用二氨基聯苯胺（DAB）顯色。顯色 2 min 后用蘇木精復染，常規梯度酒精脫水干燥，樹膠封片。用圖像分析系統（Image-Pro Plus 6.0）測量平均灰度值。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 22.0 軟件進行分析，數據以均數±標準差（ ）表示。組間比較用單因素方差分析和最小顯著差異法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 血清中 Cys-C 指標
B、C 組血清中 Cys-C 水平高于 A 組（P<0.05），D 組高于 A、B、C 組（P<0.05），而 B、C 組差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1。
表1
各組大鼠血清中 Cys-C 水平（n=6，
）
2.2 大鼠腎臟組織的腎小管上皮細胞超微結構變化
B、C、D 組中腎臟損傷以近曲小管為著。A 組腎小球及腎小管上皮刷狀緣未見明顯異常。B、C 組腎小管上皮細胞刷狀緣可見少量稀疏并有少量脫落，腎小球未見明顯異常。D 組腎小管上皮細胞可見刷狀緣脫落，少量的細胞核固縮及少量空泡形成，腎小球未見明顯異常。如圖 1 所示。提示 CIH、高脂飲食均可導致腎小管發生損傷，且 CIH 合并高脂飲食造成的腎小管損傷較為嚴重。
圖1
腎臟組織電鏡像 a．A 組（×7 500）：腎小管上皮細胞正常； b、c．B 組（×3 400）和 C 組（×4 600）：腎小管上皮細胞刷狀緣稀疏并有脫落； d．D 組（×1 700）：出現核固縮
2.3 腎臟組織中 CHOP 表達
CHOP 表達于近曲腎小管上皮細胞的胞漿中，陽性染色細胞呈棕黃色。圖 2 顯示四組大鼠 CHOP 蛋白表達定位，半定量分析（表 2）顯示 A 組平均灰度值與 B 組、C 組和 D 組有顯著差異（P<0.05）。B 組和 C 組無顯著差異（P>0.05）。D 組與 A、B、C 組比較有顯著差異（P<0.05）。CHOP 未表達于腎小球、遠曲腎小管及集合管中。
圖2
四組大鼠腎臟 CHOP 蛋白的免疫組化病理像（×400） a．A 組：正常腎小球及腎小管極少表達； b、c．B、C 組：腎小球無表達，近曲腎小管少量表達； d．D 組：腎小球無表達，腎小管大量表達
表2
各組大鼠腎臟組織 CHOP 蛋白表達（n=6，
）
3 討論
高脂血癥和 OSAHS 很常見，OSAHS 常伴有脂代謝功能紊亂，CIH 合并高脂飲食可引起多器官損傷，如心血管疾病、肺動脈高壓、非酒精性脂肪肝等[11]。但多數研究是以 CIH 為動物模型研究 OSAHS 病理機制。Cys-C 是評價腎早損的最優指標[12]，在 OSAHS 患者中是診斷腎早損的首選指標[13]。本實驗用血清中 Cys-C 指標檢測腎功能，通過建立 CIH 合并脂代謝紊亂的動物模型模擬 OSAHS 患者生活模式，研究 OSAHS 引起的腎臟損傷及發生機制；通過檢測大鼠血清中 Cys-C、腎臟近曲小管 CHOP 蛋白表達以及腎小球及腎小管的超微結構變化，發現 CIH、高脂可通過激活ERS使近曲腎小管上皮細胞發生凋亡從而導致腎功能異常，而 CIH 合并脂代謝紊亂對腎臟的損傷最為嚴重。
研究發現 OSAHS 患者存在氧化應激增強及炎性反應[14]。動物實驗提示 CIH 誘導氧化應激參與靶器官損傷[15-16]，高脂飲食可引起氧化損傷（活性氧類的生成和脂質過氧化）進而引起靶器官的損傷[17-18]。高脂引起組織細胞缺血，缺氧通過不同途徑引起激活細胞凋亡[19-20]，高脂還可引起血管內皮功能損傷，進而引起腎臟損傷[21]。可見 CIH、高脂可以通過不同途徑引起腎臟損傷，但兩者引起腎臟損傷的共同途徑有氧化應激反應。
研究發現 OSAHS 患者血清中有大量的游離 DNA，推測 OSAHS 患者出現了細胞凋亡[22]。高脂飲食可導致大鼠腎組織中凋亡細胞增多[23]。目前發現的凋亡途徑有兩種，其一為線粒體應激途徑，其二為ERS途徑。氧化應激可激活 ERS，并相互促進使靶器官的損傷[24]。ERS 發生于很多疾病中，包括腫瘤、糖尿病和炎癥等[25-27]。在 CIH 模型中的不同組織器官，如腦、心、肺，ERS 在通過細胞凋亡導致靶器官損傷的過程中起到重要作用。因此，我們提出 CIH 引起腎臟損傷是否也有 ERS 參與[28]。ERS 激活 PERK、IRE、ATF6 三條途徑使凋亡基因 CHOP 表達上調[29]。CHOP 的過度表達啟動凋亡途徑，使細胞發生凋亡。本實驗則發現ERS的標志性蛋白 CHOP 蛋白在高脂組、CIH 組、CIH 高脂組中大鼠腎臟組織表達較對照組升高，且在 CIH 高脂組中表達最高，提示 CIH 引起的腎功能異常與 ERS 有關。
綜上所述，我們的研究表明 CIH、高脂可激活 ERS 介導近曲腎小管上皮細胞發生凋亡，從而引起腎臟功能異常。該研究可為使用抑制 ERS 的藥物治療由 OSAHS 引起腎臟損傷提供理論基礎。
