引用本文： 李紅娜, 韓偉, 蘇毅, 唐華平, 趙蕾. 轉化生長因子-β 對肥胖哮喘小鼠氣道重塑的影響及吡非尼酮的干預作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(3): 217-222. doi: 10.7507/1671-6205.201701037 復制
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是氣道的炎癥疾病，影響了約 9% 的成人，肥胖是另一種在成人中具有高流行性的疾病，并且在肥胖個體中發展的哮喘不同于其他形式的哮喘，其臨床表現較重，對糖皮質激素反應較差[1]。氣道重塑是哮喘的重要特征，而轉化生長因子-β（TGF-β）是哮喘氣道重塑的關鍵性因子[2]。近年來研究證實吡非尼酮能夠有效地抑制 TGF-β 誘導的膠原積聚[3-4]，目前其在治療肺間質纖維化疾病中的作用顯著，但在肥胖哮喘方面的研究甚少[4-5]。本實驗通過觀察 TGF-β 在肥胖哮喘小鼠氣道組織中的表達，探討吡非尼酮對肥胖哮喘小鼠氣道重塑的影響。現報道如下。
1 材料與方法
1.1 一般材料
1.1.1 實驗動物 3～4 周齡雌性 C57/BL6J 健康小鼠 75 只，SPF 級別，體重 9～10 g，常州卡文斯動物實驗有限公司提供 [Scxk（蘇）20110003）]）。小鼠均飼養于青島大學醫學院實驗動物房，12 h 光照/12 h 黑暗，25 ℃ 恒溫，自由飲水攝食。該研究已經青島市市立醫院倫理委員會許可。
1.1.2 主要實驗試劑與器材 60% kCal 高脂飼料（美國 Research Diets 公司），卵清蛋白（OVA；Grade V，美國 Sigma 公司），佐劑鋁凝膠（美國 Pierce 公司），霧化器（德國 PARI 公司），小鼠 TGF-β 酶聯免疫分析試劑盒（美國 R&D 公司），兔抗鼠 TGF-β 抗體（北京博奧森公司），垂直電泳槽、電轉移電泳槽、酶標儀（美國 Bio-Rad 公司），光學顯微鏡（日本 Olympus 公司），布地奈德混懸液（英國 AstraZeneca 公司），吡非尼酮（印度 Cipla 公司）。
1.2 方法
1.2.1 建立飲食誘導的肥胖模型及實驗分組 將 75 只 C57/BL6J 小鼠隨機分為 5 組，對照組（A 組）、肥胖組（B 組）、肥胖哮喘組（C 組）、布地奈德治療組（D 組）、吡非尼酮治療組（E 組），每組 15 只。其中 A 組給予普通飼料，其余四組給予 60% kCal 高脂飼料，連續喂養至 8 周，每周稱體重。超過同期 A 組小鼠平均體重的 20% 作為肥胖標準[6]。
1.2.2 肥胖小鼠哮喘模型的建立 參考文獻[3,7]的方法。以 8 周末作為第 0 d，于第 1、7、14 d C、D、E 組給予 OVA 致敏混懸液 0.2 ml 腹腔注射（含 50 μg OVA 和等體積氫氧化鋁佐劑 1 mg），第 21 d 將 C、D、E 組小鼠置于自制霧化箱（20 cm×30 cm×30 cm）中以 1% OVA 霧化激發，持續霧化 7 d 后改為隔日 1 次，每次 30 min，連續 3 周。A、B 組對應時間給予腹腔注射等量生理鹽水及生理鹽水霧化吸入。自 21 d 起 D 組每日霧化 0.5 mg/ml 布地奈德混懸液 30 min，E 組在每日飲水中加入吡非尼酮（300 mg/kg）干預，其余組自由飲水，連續 4 周。每天計飲水量，觀察小鼠精神狀態和日常表現，每周稱體重。
1.2.3 標本的采集及處理 于末次激發后 24 h 內，將小鼠以 5% 水合氯醛 0.1 ml 腹腔注射麻醉，稱重后，眼球取血約 1 ml，血樣于室溫下靜置 30 min 后分離血清（1 000 r/min，20 min），取上清液，于 EP 管中保存于 –20 ℃ 冰箱中備用。取血后將小鼠仰臥位固定，充分暴露頸部，分離氣管，打開胸腔，分離肺臟，靜脈留置針氣管插管后，結扎右肺門，自遠端分離右肺，取其中較大肺葉放入 10% 中性甲醛溶液中固定，用于石蠟標本的制作及切片待用，其余右肺組織置于液氮中備用。氣管插管接 1 ml 注射器以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）0.4 ml 緩慢注入灌洗左肺，每次保留 30 s，回抽收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），反復灌洗 3 次，回收率>80% 視為成功，共回收灌洗液 1 ml。
1.2.4 BALF 白細胞計數和分類 使用低溫離心機，低速離心 10 min。取細胞沉渣，1 ml PBS 重懸，取 20 μl 于細胞計數板計數細胞總數，另取 0.1 ml 涂片行瑞氏-吉姆薩染色，計數各種炎癥細胞比例。
1.2.5 血清中 TGF-β 水平檢測 采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測，參照試劑盒說明書步驟操作，通過標準品吸光度（A）值繪制標準曲線，然后計算各樣本的值。
1.2.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測肺組織中 TGF-β 的表達 取右側肺組織 50 mg 加入 1 ml 細胞裂解液，4 ℃、10 000 r／min，離心 10 min，取上清液測蛋白濃度。取 50 g 蛋白樣本加入加樣緩沖液，100 ℃ 煮沸 5 min 變性，經 15% SDS-PAGE 電泳，半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素濾膜上，在 5% 脫脂奶粉-PBST 溶液室溫下封閉 1 h，加入 1︰200 稀釋的兔抗鼠 TGF-β 抗體，4 ℃ 過夜。TBST 漂洗后加入 1︰200 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫下搖床雜交 1 h。TBST 漂洗后以 ECL 化學發光底物系統放射自顯影。以相同方法測定內參照 β 肌動蛋白（β-actin）的表達強度。TGF-β 蛋白的相對分子質量為 25 000，β-actin 的相對分子質量為 42 000。通過 Gelpro 32 軟件進行灰度測定。
1.2.7 病理組織處理 肺組織在 10% 中性甲醛固定 24 h后，送病理科進行性石蠟包埋、切片，對切片分別進行蘇木精-伊紅（HE）、過碘酸希夫（PAS）、Masson 染色。觀察組織形態、氣管上皮脫落、氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤情況以及氣管 杯狀細胞增生、黏液分泌情況。每張切片在顯微鏡下放大 200 倍，隨機選取橫斷面較圓、直徑 100～200 nm 完整細支氣管橫截面，采用 AxioVision 3.1 圖像分析系統進行分析，測定管腔基底膜周長（Pbm）、氣管壁總面積（WAt）、氣管平滑肌面積（WAm），用 Pbm 進行標準化，分別記錄為氣管壁厚度（WAt/Pbm）、氣管平滑肌厚度（WAm/Pbm）[8]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（ ）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較時采用 LSD 檢驗；相關性采用 Pearson 相關性分析，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般情況評價
實驗開始前各小鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。給予肥胖小鼠飲食誘導 8 周后，小鼠體重明顯增加，B、C、D、E 組小鼠體重分別為（31.08±0.67）、（31.65±0.54）、（30.68±0.81）、（31.24±0.71）g，4 組小鼠體重之間差異無統計學意義（P<0.05），均比 A 組的（25.38±0.76）g 明顯增加（P<0.01），達到肥胖標準。OVA 致敏干預后肥胖哮喘小鼠體重增長速度減慢，分別給予干預治療后 D、E 組小鼠體重增加速度較 C 組明顯，仍低于 B 組。
2.2 小鼠哮喘癥狀發作表現
C、D、E 組所有小鼠在 OVA 激發過程中均出現明顯頭面部瘙癢、打噴嚏、呼吸急促、弓背直立、前肢縮抬、不同程度的煩躁不安或安靜少動等哮喘急性發作時的癥狀，同時還出現不同程度的飲水增多、排便增加等改變。D、E 組給予藥物干預后小鼠急性發作時癥狀較 C 組減輕。A、B 組小鼠均無上述表現出現，行為及飲食均無變化。實驗結束前 5 組小鼠均無死亡。
2.3 小鼠 BALF 白細胞總數及炎性細胞分類所占比例
A、B 組兩兩比較，B 組 BALF 白細胞總數、嗜酸性粒細胞百分比均略高于 A 組，但其差異無統計學意義（t白細胞=0.910，P=0.232；t嗜酸性粒細胞=0.430，P=0.658）。C、D、E 組小鼠 BALF 白細胞總數、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞明顯高于 B 組（t白細胞=17.830、8.970 和 8.370；t嗜酸性粒細胞=27.840、22.220、19.070；t中性粒細胞=18.500，14.340、15.510；P 均<0.01），符合哮喘氣道炎癥表現。與 C 組小鼠 BALF 的細胞總數和嗜酸性粒細胞百分比相比，D、E 組明顯減少（t白細胞=8.866、9.460；t嗜酸性粒細胞=5.620、8.770；P 均<0.01）。E 組 BALF 嗜酸性粒細胞百分比較 D 組明顯減少（t=3.150，P=0.002）。結果見表 1。
表1
小鼠 BALF 中白細胞總數及細胞分類所占百分比比較（n=15，
）
2.4 小鼠氣道炎癥及重建情況
肥胖哮喘小鼠氣管黏膜水腫明顯，支氣管上皮細胞腫脹、脫落，杯狀細胞增生，黏液分泌明顯，膠原沉積明顯，氣管道及血管周圍大量炎癥細胞集聚，甚至集聚成團，部分肺泡腔融合形成肺氣腫，平滑肌及基底膜增厚，膠原沉積增多。D、E 兩組氣道及血管周圍炎癥改變較 C 組減輕。D、E 兩組相比，E 組小鼠氣管纖毛上皮排列較整齊，氣管杯狀細胞增生、黏液分泌及膠原沉積減少，氣管壁增厚減輕。肥胖組小鼠氣管黏膜可見少量炎癥細胞增多，無上皮細胞腫脹及杯狀細胞增生等情況。結果見圖 1、2。圖像分析顯示，B 組氣管壁厚度和平滑肌厚度雖較 A 組升高，但差異無統計學意義（tWAt/Pbm=0.360，P=0.291，tWAm/Pbm=0.520，P=0.133）。C、D、E 組氣管壁厚度和平滑肌厚度明顯高于 B 組（tWAt/Pbm=7.960、4.390、3.68，tWAm/Pbm=3.140、1.880、1.800，P 均<0.05）；C 組氣管壁厚度和平滑肌厚度均高于 D、E 組（tWAt/Pbm=3.570、4.280，tWAm/Pbm=1.260、1.340，P 均<0.05）；E 組氣管壁厚度較 D 組下降（t=0.710，P=0.04），但兩組的平滑肌厚度比較差異無統計學意義（t=0.080，P=0.816）。結果見表 2。
圖1
各組小鼠氣道病理檢查像（PAS ×100） 示黏液分泌情況。a～e 分別為 A～E 組。 A 組支氣管管壁光滑、上皮細胞完整，周圍未見明顯炎癥細胞浸潤、未見杯狀細胞及黏液分泌； B 組支氣管上皮細胞輕微損傷，周圍少量炎癥細胞浸潤，少量杯狀細胞增生，少量黏液分泌； C 組支氣管上皮細胞嚴重損傷，支氣管周圍大量炎性細胞浸潤，甚至聚集成團，支氣管管壁增厚，部分肺泡腔融合，形成肺氣腫，可見杯狀細胞明顯增生，大量黏液分泌； D 組支氣管上皮細胞損傷、周圍炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、黏液分泌情況較 C 組減少； E 組支氣管上皮細胞部分損傷、周圍炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、黏液情況較 D 組減輕
圖2
各組小鼠氣道病理檢查像（Masson ×100） 示膠原沉積情況。a～e 分別為 A～E 組。 A 組未見藍色膠原沉積； B 組可見少量藍色膠原沉積； C 組可見大量膠原沉積； D 組藍色膠原沉積較 C 組減少； E 組膠原沉積較 D 組減輕
2.5 各組小鼠血清中 TGF-β 水平變化
兩兩比較，B 組小鼠血清 TGF-β 水平較 A 組略升高，但差異無統計學意義（t=6.16，P=0.154），C、D、E 組小鼠血清 TGF-β 水平明顯高于 B 組（t=52.56、17.81、10.46，P 均<0.05）；C 組小鼠血清 TGF-β 均高于 D、E 組（t=34.25、42.10，P 均<0.05）；E 組小鼠血清 TGF-β 較 D 組下降（t=9.73，P=0.024 5）（表 2）。
表2
各小鼠血清 TGF-β 水平及氣管結構變化（n=15，
）
2.6 Western blot 測定肺組織中 TGF-β 的表達水平
A、B、C、D、E 組肺組織中 TGF-β 的表達水平分別為 0.06±0.05、0.12±0.05、0.68±0.06、0.30±0.04、0.19±0.05。經實驗圖像及相對灰度值測定顯示 C 組肺組織中 TGF-β 表達明顯升高，給予布地奈德及吡非尼酮干預后 TGF-β 表達下降，E 組 TGF-β 表達較 D 組下降更明顯（P<0.05）。結果見圖 3。肺組織中 TGF-β 表達與 BALF 中嗜酸性粒細胞百分比呈正相關（r=0.79，P<0.01）。
圖3
Western blot 法測定肺組織中 TGF-β 表達水平
3 討論
肥胖是促進哮喘加重及進展的一個獨立危險因素，增加了哮喘發作的風險及哮喘的嚴重程度，并且治療反應及控制狀況均較差[1,9]。既往的研究證實，肥胖哮喘發病過程中氣道炎癥和氣道重塑的表現不同于普通哮喘，表現出中性粒細胞升高明顯，氣管平滑肌增生肥厚明顯，氣管黏液分泌明顯，對糖皮質激素治療反應差等特點[10-11]。
吡非尼酮屬于一種羥基吡啶，具有抗炎、抗纖維化作用，目前應用于肺間質纖維化疾病的治療，患者肺功能、運動耐量以及無進展生存率等方法評估的疾病進展已經顯著降低[12]，其抗纖維化作用在腎臟、肝臟和心臟纖維化疾病中也被報道[13-14]。另外，許多研究報道吡非尼酮可以減輕氣道炎癥，改善氣道重塑，抑制由變應原觸發的細胞相互作用和釋放的級聯炎癥反應，減少血管原性生長因子的產生等[4-5,15]。然而，吡非尼酮對肥胖哮喘患者的治療效果不甚清楚。
我們使用高脂肪飲食誘導和 OVA 致敏方法建立肥胖哮喘小鼠的模型。與非肥胖小鼠相比，肥胖小鼠在氣道炎癥及氣道重塑方面與對照組小鼠未見明顯差異，提示單純肥胖對哮喘氣道炎癥、重塑及肺組織結構改變影響有限。然而，Sutherland 等[16]證實肥胖哮喘小鼠較單純哮喘小鼠氣道炎癥及重塑更加明顯，肥胖性哮喘是難治性表型哮喘。在臨床治療過程中，哮喘患者通常使用全身糖皮質激素控制及緩解癥狀。在本研究中，我們發現布地奈德對以中性粒細胞浸潤為主的肥胖哮喘作用不甚理想。相反，本研究證實吡非尼酮在抑制氣道炎癥、黏液分泌及支氣管周圍纖維化變性方面均較布地奈德作用顯著。
TGF-β 是一種抗纖維化細胞因子，研究證實 TGF-β 的幾個亞型在氣道炎癥調節和哮喘氣道重塑過程中起重要作用[17]。TGF-β 持續過度升高，可引起組織纖維化、氣道重塑以及氣道慢性阻塞[18]。本研究顯示：肥胖哮喘小鼠血清中 TGF-β 表達明顯升高，提示 TGF-β 在肥胖哮喘氣道重塑起著舉足輕重的作用。吡非尼酮通過抑制 TGF-β 的表達主要通過以下途徑：抑制 TGF-β 基因過度表達，減少 TGF-β 生成，從而抑制依賴性膠原的產生和減少成纖維細胞增殖[15]；抑制由 TGF-β 誘導的細胞遷移、增殖和成纖維細胞的收縮性能，亦可抑制 TGF-β 誘導的 Ⅰ 型和 Ⅲ 型膠原蛋白和纖連蛋白的產生[19]。TGF-β 抗體拮抗劑可通過抑制 Smad2 磷酸化來調節 TGF-β/Smad 信號轉導通路的表達，從而減少支氣管壁周圍細胞外基質沉積，抑制氣管平滑肌細胞增殖[20]。我們使用吡非尼酮干預肥胖哮喘小鼠，小鼠血清及肺組織中 TGF-β 表達較肥胖哮喘小鼠顯著降低，且小鼠氣管黏液分泌及纖維沉積亦明顯改善，這與 Mansoor 等[5]研究結果一致。這些結果均提示吡非尼酮可降低 TGF-β 表達，從而達到控制哮喘炎癥細胞浸潤、抑制氣管杯狀細胞、平滑肌細胞增生，從而減輕支氣管周圍纖維化變性，改善氣道重塑。同時肥胖哮喘小鼠血管壁均有不同程度的增厚，亦說明氣道血管血管增生/血管生成亦是肥胖哮喘氣道重塑的一個重要病理生理特征，這與以往研究結果一致[12,21]。
目前，哮喘治療的重點是吸入糖皮質激素改善炎癥和逆轉支氣管收縮。然而，僅使用吸入糖皮質激素治療炎癥反應而不控制氣道組織增生并不能阻止氣道重塑，導致肺功能喪失[22]。雖然幾項臨床研究表明吸入糖皮質激素可以抑制氣道重塑，但其有效的逆轉重塑作用是有限的[22-24]。此外，雖然氣道重塑的可逆性已經在動物模型中進行了研究[25-26]，但仍舊沒有已知的預防或逆轉氣道重塑的有效治療劑。鑒于此，吡非尼酮可能是一種有希望的治療哮喘氣道重塑的藥物，可以抑制許多可致氣道高反應及氣道重塑的細胞因子，尤其在抑制肺組織 TGF-β 表達及氣管黏液分泌方面的特異性，有望對預防早期氣道重塑、氣管黏液高分泌發揮一定的治療作用。雖然我們的研究沒有顯示吡非尼酮和布地奈德在氣道重塑中的協同作用，但通過觀察各自在抗炎和抗纖維化過程中對氣道重塑的作用對以后的研究提供了有力的證據。吡非尼酮和吸入性糖皮質激素的組合可能是肥胖哮喘患者逆轉氣道重塑的治療選擇。另外，而吡非尼酮對肥胖哮喘的作用的研究還需要更多實驗加以證實。
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是氣道的炎癥疾病，影響了約 9% 的成人，肥胖是另一種在成人中具有高流行性的疾病，并且在肥胖個體中發展的哮喘不同于其他形式的哮喘，其臨床表現較重，對糖皮質激素反應較差[1]。氣道重塑是哮喘的重要特征，而轉化生長因子-β（TGF-β）是哮喘氣道重塑的關鍵性因子[2]。近年來研究證實吡非尼酮能夠有效地抑制 TGF-β 誘導的膠原積聚[3-4]，目前其在治療肺間質纖維化疾病中的作用顯著，但在肥胖哮喘方面的研究甚少[4-5]。本實驗通過觀察 TGF-β 在肥胖哮喘小鼠氣道組織中的表達，探討吡非尼酮對肥胖哮喘小鼠氣道重塑的影響。現報道如下。
1 材料與方法
1.1 一般材料
1.1.1 實驗動物 3～4 周齡雌性 C57/BL6J 健康小鼠 75 只，SPF 級別，體重 9～10 g，常州卡文斯動物實驗有限公司提供 [Scxk（蘇）20110003）]）。小鼠均飼養于青島大學醫學院實驗動物房，12 h 光照/12 h 黑暗，25 ℃ 恒溫，自由飲水攝食。該研究已經青島市市立醫院倫理委員會許可。
1.1.2 主要實驗試劑與器材 60% kCal 高脂飼料（美國 Research Diets 公司），卵清蛋白（OVA；Grade V，美國 Sigma 公司），佐劑鋁凝膠（美國 Pierce 公司），霧化器（德國 PARI 公司），小鼠 TGF-β 酶聯免疫分析試劑盒（美國 R&D 公司），兔抗鼠 TGF-β 抗體（北京博奧森公司），垂直電泳槽、電轉移電泳槽、酶標儀（美國 Bio-Rad 公司），光學顯微鏡（日本 Olympus 公司），布地奈德混懸液（英國 AstraZeneca 公司），吡非尼酮（印度 Cipla 公司）。
1.2 方法
1.2.1 建立飲食誘導的肥胖模型及實驗分組 將 75 只 C57/BL6J 小鼠隨機分為 5 組，對照組（A 組）、肥胖組（B 組）、肥胖哮喘組（C 組）、布地奈德治療組（D 組）、吡非尼酮治療組（E 組），每組 15 只。其中 A 組給予普通飼料，其余四組給予 60% kCal 高脂飼料，連續喂養至 8 周，每周稱體重。超過同期 A 組小鼠平均體重的 20% 作為肥胖標準[6]。
1.2.2 肥胖小鼠哮喘模型的建立 參考文獻[3,7]的方法。以 8 周末作為第 0 d，于第 1、7、14 d C、D、E 組給予 OVA 致敏混懸液 0.2 ml 腹腔注射（含 50 μg OVA 和等體積氫氧化鋁佐劑 1 mg），第 21 d 將 C、D、E 組小鼠置于自制霧化箱（20 cm×30 cm×30 cm）中以 1% OVA 霧化激發，持續霧化 7 d 后改為隔日 1 次，每次 30 min，連續 3 周。A、B 組對應時間給予腹腔注射等量生理鹽水及生理鹽水霧化吸入。自 21 d 起 D 組每日霧化 0.5 mg/ml 布地奈德混懸液 30 min，E 組在每日飲水中加入吡非尼酮（300 mg/kg）干預，其余組自由飲水，連續 4 周。每天計飲水量，觀察小鼠精神狀態和日常表現，每周稱體重。
1.2.3 標本的采集及處理 于末次激發后 24 h 內，將小鼠以 5% 水合氯醛 0.1 ml 腹腔注射麻醉，稱重后，眼球取血約 1 ml，血樣于室溫下靜置 30 min 后分離血清（1 000 r/min，20 min），取上清液，于 EP 管中保存于 –20 ℃ 冰箱中備用。取血后將小鼠仰臥位固定，充分暴露頸部，分離氣管，打開胸腔，分離肺臟，靜脈留置針氣管插管后，結扎右肺門，自遠端分離右肺，取其中較大肺葉放入 10% 中性甲醛溶液中固定，用于石蠟標本的制作及切片待用，其余右肺組織置于液氮中備用。氣管插管接 1 ml 注射器以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）0.4 ml 緩慢注入灌洗左肺，每次保留 30 s，回抽收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），反復灌洗 3 次，回收率>80% 視為成功，共回收灌洗液 1 ml。
1.2.4 BALF 白細胞計數和分類 使用低溫離心機，低速離心 10 min。取細胞沉渣，1 ml PBS 重懸，取 20 μl 于細胞計數板計數細胞總數，另取 0.1 ml 涂片行瑞氏-吉姆薩染色，計數各種炎癥細胞比例。
1.2.5 血清中 TGF-β 水平檢測 采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測，參照試劑盒說明書步驟操作，通過標準品吸光度（A）值繪制標準曲線，然后計算各樣本的值。
1.2.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測肺組織中 TGF-β 的表達 取右側肺組織 50 mg 加入 1 ml 細胞裂解液，4 ℃、10 000 r／min，離心 10 min，取上清液測蛋白濃度。取 50 g 蛋白樣本加入加樣緩沖液，100 ℃ 煮沸 5 min 變性，經 15% SDS-PAGE 電泳，半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素濾膜上，在 5% 脫脂奶粉-PBST 溶液室溫下封閉 1 h，加入 1︰200 稀釋的兔抗鼠 TGF-β 抗體，4 ℃ 過夜。TBST 漂洗后加入 1︰200 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫下搖床雜交 1 h。TBST 漂洗后以 ECL 化學發光底物系統放射自顯影。以相同方法測定內參照 β 肌動蛋白（β-actin）的表達強度。TGF-β 蛋白的相對分子質量為 25 000，β-actin 的相對分子質量為 42 000。通過 Gelpro 32 軟件進行灰度測定。
1.2.7 病理組織處理 肺組織在 10% 中性甲醛固定 24 h后，送病理科進行性石蠟包埋、切片，對切片分別進行蘇木精-伊紅（HE）、過碘酸希夫（PAS）、Masson 染色。觀察組織形態、氣管上皮脫落、氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤情況以及氣管 杯狀細胞增生、黏液分泌情況。每張切片在顯微鏡下放大 200 倍，隨機選取橫斷面較圓、直徑 100～200 nm 完整細支氣管橫截面，采用 AxioVision 3.1 圖像分析系統進行分析，測定管腔基底膜周長（Pbm）、氣管壁總面積（WAt）、氣管平滑肌面積（WAm），用 Pbm 進行標準化，分別記錄為氣管壁厚度（WAt/Pbm）、氣管平滑肌厚度（WAm/Pbm）[8]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（ ）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較時采用 LSD 檢驗；相關性采用 Pearson 相關性分析，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般情況評價
實驗開始前各小鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。給予肥胖小鼠飲食誘導 8 周后，小鼠體重明顯增加，B、C、D、E 組小鼠體重分別為（31.08±0.67）、（31.65±0.54）、（30.68±0.81）、（31.24±0.71）g，4 組小鼠體重之間差異無統計學意義（P<0.05），均比 A 組的（25.38±0.76）g 明顯增加（P<0.01），達到肥胖標準。OVA 致敏干預后肥胖哮喘小鼠體重增長速度減慢，分別給予干預治療后 D、E 組小鼠體重增加速度較 C 組明顯，仍低于 B 組。
2.2 小鼠哮喘癥狀發作表現
C、D、E 組所有小鼠在 OVA 激發過程中均出現明顯頭面部瘙癢、打噴嚏、呼吸急促、弓背直立、前肢縮抬、不同程度的煩躁不安或安靜少動等哮喘急性發作時的癥狀，同時還出現不同程度的飲水增多、排便增加等改變。D、E 組給予藥物干預后小鼠急性發作時癥狀較 C 組減輕。A、B 組小鼠均無上述表現出現，行為及飲食均無變化。實驗結束前 5 組小鼠均無死亡。
2.3 小鼠 BALF 白細胞總數及炎性細胞分類所占比例
A、B 組兩兩比較，B 組 BALF 白細胞總數、嗜酸性粒細胞百分比均略高于 A 組，但其差異無統計學意義（t白細胞=0.910，P=0.232；t嗜酸性粒細胞=0.430，P=0.658）。C、D、E 組小鼠 BALF 白細胞總數、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞明顯高于 B 組（t白細胞=17.830、8.970 和 8.370；t嗜酸性粒細胞=27.840、22.220、19.070；t中性粒細胞=18.500，14.340、15.510；P 均<0.01），符合哮喘氣道炎癥表現。與 C 組小鼠 BALF 的細胞總數和嗜酸性粒細胞百分比相比，D、E 組明顯減少（t白細胞=8.866、9.460；t嗜酸性粒細胞=5.620、8.770；P 均<0.01）。E 組 BALF 嗜酸性粒細胞百分比較 D 組明顯減少（t=3.150，P=0.002）。結果見表 1。
表1
小鼠 BALF 中白細胞總數及細胞分類所占百分比比較（n=15，
）
2.4 小鼠氣道炎癥及重建情況
肥胖哮喘小鼠氣管黏膜水腫明顯，支氣管上皮細胞腫脹、脫落，杯狀細胞增生，黏液分泌明顯，膠原沉積明顯，氣管道及血管周圍大量炎癥細胞集聚，甚至集聚成團，部分肺泡腔融合形成肺氣腫，平滑肌及基底膜增厚，膠原沉積增多。D、E 兩組氣道及血管周圍炎癥改變較 C 組減輕。D、E 兩組相比，E 組小鼠氣管纖毛上皮排列較整齊，氣管杯狀細胞增生、黏液分泌及膠原沉積減少，氣管壁增厚減輕。肥胖組小鼠氣管黏膜可見少量炎癥細胞增多，無上皮細胞腫脹及杯狀細胞增生等情況。結果見圖 1、2。圖像分析顯示，B 組氣管壁厚度和平滑肌厚度雖較 A 組升高，但差異無統計學意義（tWAt/Pbm=0.360，P=0.291，tWAm/Pbm=0.520，P=0.133）。C、D、E 組氣管壁厚度和平滑肌厚度明顯高于 B 組（tWAt/Pbm=7.960、4.390、3.68，tWAm/Pbm=3.140、1.880、1.800，P 均<0.05）；C 組氣管壁厚度和平滑肌厚度均高于 D、E 組（tWAt/Pbm=3.570、4.280，tWAm/Pbm=1.260、1.340，P 均<0.05）；E 組氣管壁厚度較 D 組下降（t=0.710，P=0.04），但兩組的平滑肌厚度比較差異無統計學意義（t=0.080，P=0.816）。結果見表 2。
圖1
各組小鼠氣道病理檢查像（PAS ×100） 示黏液分泌情況。a～e 分別為 A～E 組。 A 組支氣管管壁光滑、上皮細胞完整，周圍未見明顯炎癥細胞浸潤、未見杯狀細胞及黏液分泌； B 組支氣管上皮細胞輕微損傷，周圍少量炎癥細胞浸潤，少量杯狀細胞增生，少量黏液分泌； C 組支氣管上皮細胞嚴重損傷，支氣管周圍大量炎性細胞浸潤，甚至聚集成團，支氣管管壁增厚，部分肺泡腔融合，形成肺氣腫，可見杯狀細胞明顯增生，大量黏液分泌； D 組支氣管上皮細胞損傷、周圍炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、黏液分泌情況較 C 組減少； E 組支氣管上皮細胞部分損傷、周圍炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、黏液情況較 D 組減輕
圖2
各組小鼠氣道病理檢查像（Masson ×100） 示膠原沉積情況。a～e 分別為 A～E 組。 A 組未見藍色膠原沉積； B 組可見少量藍色膠原沉積； C 組可見大量膠原沉積； D 組藍色膠原沉積較 C 組減少； E 組膠原沉積較 D 組減輕
2.5 各組小鼠血清中 TGF-β 水平變化
兩兩比較，B 組小鼠血清 TGF-β 水平較 A 組略升高，但差異無統計學意義（t=6.16，P=0.154），C、D、E 組小鼠血清 TGF-β 水平明顯高于 B 組（t=52.56、17.81、10.46，P 均<0.05）；C 組小鼠血清 TGF-β 均高于 D、E 組（t=34.25、42.10，P 均<0.05）；E 組小鼠血清 TGF-β 較 D 組下降（t=9.73，P=0.024 5）（表 2）。
表2
各小鼠血清 TGF-β 水平及氣管結構變化（n=15，
）
2.6 Western blot 測定肺組織中 TGF-β 的表達水平
A、B、C、D、E 組肺組織中 TGF-β 的表達水平分別為 0.06±0.05、0.12±0.05、0.68±0.06、0.30±0.04、0.19±0.05。經實驗圖像及相對灰度值測定顯示 C 組肺組織中 TGF-β 表達明顯升高，給予布地奈德及吡非尼酮干預后 TGF-β 表達下降，E 組 TGF-β 表達較 D 組下降更明顯（P<0.05）。結果見圖 3。肺組織中 TGF-β 表達與 BALF 中嗜酸性粒細胞百分比呈正相關（r=0.79，P<0.01）。
圖3
Western blot 法測定肺組織中 TGF-β 表達水平
3 討論
肥胖是促進哮喘加重及進展的一個獨立危險因素，增加了哮喘發作的風險及哮喘的嚴重程度，并且治療反應及控制狀況均較差[1,9]。既往的研究證實，肥胖哮喘發病過程中氣道炎癥和氣道重塑的表現不同于普通哮喘，表現出中性粒細胞升高明顯，氣管平滑肌增生肥厚明顯，氣管黏液分泌明顯，對糖皮質激素治療反應差等特點[10-11]。
吡非尼酮屬于一種羥基吡啶，具有抗炎、抗纖維化作用，目前應用于肺間質纖維化疾病的治療，患者肺功能、運動耐量以及無進展生存率等方法評估的疾病進展已經顯著降低[12]，其抗纖維化作用在腎臟、肝臟和心臟纖維化疾病中也被報道[13-14]。另外，許多研究報道吡非尼酮可以減輕氣道炎癥，改善氣道重塑，抑制由變應原觸發的細胞相互作用和釋放的級聯炎癥反應，減少血管原性生長因子的產生等[4-5,15]。然而，吡非尼酮對肥胖哮喘患者的治療效果不甚清楚。
我們使用高脂肪飲食誘導和 OVA 致敏方法建立肥胖哮喘小鼠的模型。與非肥胖小鼠相比，肥胖小鼠在氣道炎癥及氣道重塑方面與對照組小鼠未見明顯差異，提示單純肥胖對哮喘氣道炎癥、重塑及肺組織結構改變影響有限。然而，Sutherland 等[16]證實肥胖哮喘小鼠較單純哮喘小鼠氣道炎癥及重塑更加明顯，肥胖性哮喘是難治性表型哮喘。在臨床治療過程中，哮喘患者通常使用全身糖皮質激素控制及緩解癥狀。在本研究中，我們發現布地奈德對以中性粒細胞浸潤為主的肥胖哮喘作用不甚理想。相反，本研究證實吡非尼酮在抑制氣道炎癥、黏液分泌及支氣管周圍纖維化變性方面均較布地奈德作用顯著。
TGF-β 是一種抗纖維化細胞因子，研究證實 TGF-β 的幾個亞型在氣道炎癥調節和哮喘氣道重塑過程中起重要作用[17]。TGF-β 持續過度升高，可引起組織纖維化、氣道重塑以及氣道慢性阻塞[18]。本研究顯示：肥胖哮喘小鼠血清中 TGF-β 表達明顯升高，提示 TGF-β 在肥胖哮喘氣道重塑起著舉足輕重的作用。吡非尼酮通過抑制 TGF-β 的表達主要通過以下途徑：抑制 TGF-β 基因過度表達，減少 TGF-β 生成，從而抑制依賴性膠原的產生和減少成纖維細胞增殖[15]；抑制由 TGF-β 誘導的細胞遷移、增殖和成纖維細胞的收縮性能，亦可抑制 TGF-β 誘導的 Ⅰ 型和 Ⅲ 型膠原蛋白和纖連蛋白的產生[19]。TGF-β 抗體拮抗劑可通過抑制 Smad2 磷酸化來調節 TGF-β/Smad 信號轉導通路的表達，從而減少支氣管壁周圍細胞外基質沉積，抑制氣管平滑肌細胞增殖[20]。我們使用吡非尼酮干預肥胖哮喘小鼠，小鼠血清及肺組織中 TGF-β 表達較肥胖哮喘小鼠顯著降低，且小鼠氣管黏液分泌及纖維沉積亦明顯改善，這與 Mansoor 等[5]研究結果一致。這些結果均提示吡非尼酮可降低 TGF-β 表達，從而達到控制哮喘炎癥細胞浸潤、抑制氣管杯狀細胞、平滑肌細胞增生，從而減輕支氣管周圍纖維化變性，改善氣道重塑。同時肥胖哮喘小鼠血管壁均有不同程度的增厚，亦說明氣道血管血管增生/血管生成亦是肥胖哮喘氣道重塑的一個重要病理生理特征，這與以往研究結果一致[12,21]。
目前，哮喘治療的重點是吸入糖皮質激素改善炎癥和逆轉支氣管收縮。然而，僅使用吸入糖皮質激素治療炎癥反應而不控制氣道組織增生并不能阻止氣道重塑，導致肺功能喪失[22]。雖然幾項臨床研究表明吸入糖皮質激素可以抑制氣道重塑，但其有效的逆轉重塑作用是有限的[22-24]。此外，雖然氣道重塑的可逆性已經在動物模型中進行了研究[25-26]，但仍舊沒有已知的預防或逆轉氣道重塑的有效治療劑。鑒于此，吡非尼酮可能是一種有希望的治療哮喘氣道重塑的藥物，可以抑制許多可致氣道高反應及氣道重塑的細胞因子，尤其在抑制肺組織 TGF-β 表達及氣管黏液分泌方面的特異性，有望對預防早期氣道重塑、氣管黏液高分泌發揮一定的治療作用。雖然我們的研究沒有顯示吡非尼酮和布地奈德在氣道重塑中的協同作用，但通過觀察各自在抗炎和抗纖維化過程中對氣道重塑的作用對以后的研究提供了有力的證據。吡非尼酮和吸入性糖皮質激素的組合可能是肥胖哮喘患者逆轉氣道重塑的治療選擇。另外，而吡非尼酮對肥胖哮喘的作用的研究還需要更多實驗加以證實。
