引用本文： 劉澤玉, 姜寶珍, 楊志偉, 劉星, 張志紅. P-選擇素糖蛋白配體在鹽酸誘導小鼠急性肺損傷中的作用機制研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(4): 394-400. doi: 10.7507/1671-6205.201701005 復制
酸性胃內容物誤吸所導致的急性肺損傷（ALI）是臨床上圍手術期和麻醉期常見的并發癥，主要表現為進行性頑固性低氧血癥、非心源性肺水腫和肺泡-毛細血管通透性增加，嚴重的 ALI 最終可發展成為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），死亡率高達 40% 以上，是重癥監護室患者死亡的首要原因[1-2]。因此，探索反流誤吸所致 ALI 的發生機制，尋找肺損傷中關鍵靶點對于有效預防和治療該類疾病具有重要意義。
肺微血管內皮是血液和肺組織的第一道屏障，它能有效預防血液中的細胞和蛋白滲入到肺間質和肺泡腔中。ALI/ARDS 患者肺泡上皮細胞和血管內皮細胞發生彌散性損傷，進而引起血管內皮功能障礙，其特點是肺微血管多形核白細胞黏附增加，同時伴有肺泡-毛細血管通透性增加，最終導致肺水腫和肺間質及肺泡腔炎癥細胞浸潤[3-5]。 P-選擇素（P-selectin）是位于血管內皮細胞棒管狀（Weibel-Palade）小體和血小板α-顆粒內的細胞黏附分子，是選擇素家族的主要成員，也是炎癥早期介導白細胞與內皮細胞最初黏附、啟動炎癥反應并維持炎癥狀態的關鍵成分[6-7]。P-選擇素糖蛋白配體 （P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）是選擇素黏附分子配體中的一種，主要表達于白細胞，能與 三種選擇素黏附分子結合，對 P-selectin 的親和力最高[8-9]。研究發現 PSGL-1 對于 P-selectin 介導的白細胞在血管中的滾動和遷移必不可少[8]。在炎癥反應 過程中，PSGL-1 通過與其相應受體 P-selectin 結合從而介導白細胞與血管管壁接觸，使白細胞在血管壁上緩慢滾動，進而啟動一系列反應，最終導致白細 胞在炎癥反應區集中。因此，我們推測在以炎癥細胞 浸潤為主要特征進而導致肺功能損傷的 ALI 病理過程中，PSGL-1 可能發揮重要的作用。本實驗采用 PSGL-1 敲除小鼠探索 PSGL-1 在鹽酸（HCl）誘導小 鼠 ALI 中的作用及其可能的作用機制，從而為臨床上吸入性肺炎所致 ALI/ARDS 的治療提供新的依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和材料
健康雄性野生型（WT）小鼠和 PSGL-1 敲除（PSGL-1 -/-）小鼠由 Oklahoma Medical Research Foundation（OMRF）Xia Lijun 教授贈予。IL-1β 及 IL-6 ELISA 試劑盒（上海信帆公司）；免疫印跡核因子-κB（NF-κB）p65、IκBa 及 p-IκBa 抗體（美國 Cell Signaling Technology 公司）；CD68 抗體（Novus 公司），CD45 抗體（美國 BD 公司）。實驗動物呼吸功能檢測儀（法國 EMKA 公司），手持式血氣分析儀和血氣生化八項測試卡片（上海雅培貿易有限公司）。實驗動物操作程序得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準（批準號：ILAS-PG-2015-017）。
1.2 實驗分組
將 30 只 WT 小鼠和 30 只 PSGL-1 敲除小鼠隨機分為鹽酸組和生理鹽水組，每組 15 只，單側肺導管滴注 0.1 mol/L 鹽酸或生理鹽水（NS，1 μl/g 體重），觀察吸入后 2 h 小鼠炎性指標及病理學等的改變。
1.3 實驗方法
鹽酸組和生理鹽水組小鼠經 1.2% 三溴乙醇（腹腔內注射，0.2 ml/10 g 體重）麻醉后，60° 傾斜仰臥位固定，頸前切口（5 mm）暴露氣管，迅速將導管（內徑 0.28 mm）插入左主支氣管，導管末端連接微量加樣器，緩慢推注 0.1 mol/L 鹽酸溶液（pH1.25）和生理鹽水（1 μl/g 體重），滴注結束時再推注適量空氣以確保全部鹽酸或生理鹽水進入靶肺，拔出導管并豎直放置小鼠 5 min。小鼠術后放置于動物加熱板保溫處理。待小鼠蘇醒后，密切觀察并單籠飼養。
1.4 觀察指標
1.4.1 呼吸功能檢測 增強呼氣間歇（enhanced pause，Penh）最常用于小鼠呼吸功能研究，反映氣道阻力大小。給予鹽酸或生理鹽水 2 h 時，進行約 15 min 的 Penh 檢測。
1.4.2 動脈血氣分析 腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠，經腹主動脈快速抽取動脈血，棄去前 1～2 滴血，迅速注滿血氣芯片，測量動脈血 pH 值、氧分壓（PaO2）和二氧化碳分壓（PaCO2）。
1.4.3 支氣管肺泡灌洗液 每組 5 只小鼠右肺門部結扎，0.3 ml 4 ℃ 預冷的生理鹽水注入左主支氣管并緩慢回吸收支氣管肺泡灌洗液（BALF），重復 3 次，收集所有灌洗液（回收率一般大于 80%），4 ℃，1 500 r/min 離心 10 min，測定 BALF 總蛋白濃度及白細胞計數。
1.4.4 病理學檢測 取小鼠左側肺，4% 多聚甲醛固定 24 h，常規修塊、脫水、石蠟包埋以及切片（4 μm），HE染色，鏡下判斷肺損傷程度。
1.4.5 免疫組化 肺部組織切片進行 CD45、CD68 和 Gr-1 的免疫組化檢測分析，棕色為陽性表達。
1.4.6 炎癥因子及 NF-κB 信號通路相關蛋白檢測 每組 5 只小鼠左肺，提取全蛋白，ELISA 方法檢測 IL-1β 和 IL-6 炎癥因子表達量，免疫印跡法檢測 NF-κB 信號通路相關蛋白 NF-κB（p65）、IκBa 和p-IκBa 表達水平。
1.4.7 肺組織濕干重比值（W/D） 取左肺，濾紙吸取組織表面的血液及雜質，稱肺濕重后，將肺組織置于 60 ℃ 烘箱內烘干 72 h 至重量恒重，稱量肺干重，計算 W/D，評估各組肺組織水腫程度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。所有數據進行正態性檢驗，計數資料用均數±標準差（ ）表示。多樣本均數間比較采用 One-way ANOVA 檢驗，兩組差異比較用 LSD 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 呼吸功能（Penh）和動脈血氣
PSGL-1 敲除小鼠在鹽酸刺激 2 h 時，其 Penh 明顯低于 WT 鼠（4.77±1.22 vs. 5.80±0.84），且均顯著高于其對應的生理鹽水組（P<0.05，圖 1），提示鹽酸刺激后小鼠氣道阻力增加且 WT 鼠氣道受阻更加嚴重。一次性吸入鹽酸 2 h 時，與對應生理鹽水組比較，WT 鼠和 PSGL-1 敲除鹽酸組的動脈血 pH 和 PaO2 明顯降低，PaCO2 明顯升高，且 WT 組較 PSGL-1 敲除組動脈血 pH 和 PaO2 降低更顯著，PaCO2 升高更明顯（P<0.05，表 1）。兩種小鼠生理鹽水組的 Penh 和動脈血氣差異均不顯著。上述結果表明鹽酸刺激后，兩組小鼠肺功能均出現不同程度酸中毒，高碳酸血癥以及低氧血癥，且 WT 小鼠肺功能降低更明顯。
圖1
4 組小鼠呼吸功能的變化情況
表1
各組小鼠肺動脈血氣（n=15，
）
2.2 BALF 白細胞計數、蛋白濃度及肺W/D
鹽酸刺激后，WT 和 PSGL-1 敲除小鼠 BALF 中白細胞計數和蛋白濃度及肺W/D與其各自相對應的生理鹽水組比較均有明顯升高，且 WT 鼠 BALF 蛋白濃度 [（4.74±0.98）μg/μl vs.（3.71±0.64）μg/μl]、白細胞計數 [（49.42±3.35）×107/L vs.（13.00± 2.18）×107/L] 和肺 W/D（5.22±0.20 vs. 4.86±0.15）升高程度較 PSGL-1 敲除小鼠更為顯著，差異有統計學意義（P<0.05，圖 2）。兩種小鼠生理鹽水組的三項檢測指標無明顯差異。這一結果提示，PSGL-1 敲除小鼠肺泡-毛細血管屏障破壞程度和肺水腫程度較 WT 鼠明顯減輕。
圖2
小鼠 BALF 白細胞計數、蛋白濃度及肺W/D a. BALF 白細胞計數； b. BALF 蛋白濃度； c. 肺W/D
2.3 肺組織 IL-6 和 IL-1β的表達
采用 ELISA 法檢測肺組織 IL-6 和 IL-1β 的表達。鹽酸刺激后 WT 和 PSGL-1 敲除小鼠肺組織炎癥因子 IL-6 和 IL-1β 蛋白表達水平與其各自相對應的生理鹽水組比較均有明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與 PSGL-1 敲除小鼠鹽酸組比較，WT 鼠肺組織 IL-6 和 IL-1β 蛋白水平升高更顯著且差異有統計學意義（P<0.05），而兩種小鼠生理鹽水組 IL-6 和 IL-1β 蛋白水平無明顯變化。結果見圖 3。
圖3
小鼠肺組織 IL-6 和 IL-1β蛋白表達水平 a. 肺組織 IL-6 蛋白含量； b. 肺組織 IL-1β 蛋白含量
2.4 免疫印跡法檢測 NF-κB（p65）、p-IκBa 和 IκBa 的表達水平
4 組小鼠肺組織蛋白 NF-κB（p65）、IκBa 及 p-IκBa 表達水平均有顯著差異（P<0.01）。兩種小鼠在給予鹽酸刺激后，與對應生理鹽水組比較，其肺組織 p65 和 p-IκBa 表達水平均有顯著性升高，IκBa 表達水平均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。且 WT 小鼠鹽酸組較 PSGL-1 敲除小鼠鹽酸組肺組織蛋白 p65 和 p-IκBa 表達水平升高更明顯（P<0.05），IκBa 表達水平降低更顯著，差異有統計學意義（P<0.05），兩種小鼠生理鹽水組肺組織 NF-κB（p65）、p-IκBa 及 IκBa 表達水平無明顯差異。結果見圖 4 和圖 5。
圖4
免疫印跡法檢測 NF-κB（p65）、IκBa 及 p-IκBa 蛋白表達情況
圖5
小鼠肺組織 NF-κB、p-IκBa 和 IκBa 蛋白表達半定量分析 a. NF-κB（p65）蛋白表達量； b. IκBa 蛋白表達量； c. p-IκBa 蛋白表達量
2.5 肺組織病理學改變
生理鹽水刺激的WT 小鼠和 PSGL-1 敲除小鼠肺組織結構均保持完整，未見明顯病變。給予鹽酸刺激后，與生理鹽水組比較，鹽酸組小鼠肺泡腔結構大量破壞，肺間質明顯水腫，肺組織中有大量炎癥細胞和紅細胞浸潤，且 WT 小鼠肺部水腫、肺部炎癥細胞浸潤及肺泡結構破壞情況較 PSGL-1 敲除組更為顯著。結果見圖 6。
圖6
小鼠肺組織病理檢查像（HE×200） a. WT 生理鹽水組：肺組織結構完整，未見炎癥細胞及紅細胞浸潤； b. PSGL-1 敲除生理鹽水組：肺組織結構完整，無明顯炎癥反應及紅細胞滲出； c. WT 鹽酸組：肺泡腔結構嚴重破壞，肺間質水腫，大量炎癥細胞和紅細胞浸潤； d. PSGL-1 敲除鹽酸組：部分肺泡結構破壞，肺間質水腫，少量炎癥細胞和紅細胞浸潤
2.6 肺組織免疫組化
CD45 為白細胞膜表面標志物，與生理鹽水組比較，WT 鹽酸組小鼠肺間質有大量白細胞浸潤且明顯多于 PSGL-1 敲除鹽酸組，結果見圖 7。CD68 主要是巨噬細胞的細胞膜表面標志物，鹽酸刺激 2 h 時，WT 小鼠肺間質和肺泡腔中可見大量巨噬細胞浸潤，而 PSGL-1 敲除小鼠浸潤較少，結果見圖 8。Gr-1 主要為粒細胞膜表面標志物，兩種小鼠生理鹽水組肺組織均無粒細胞浸潤，給予鹽酸刺激后，小鼠肺組織出現大量粒細胞浸潤，且與 PSGL-1 敲除小鼠比較，WT 組浸潤更加嚴重，結果見圖 9。
圖7
肺組織免疫組化病理檢查像（白細胞 CD45 免疫組化×400） a. WT 生理鹽水組：未見陽性細胞； b. PSGL-1 敲除生理鹽水組：未見陽性細胞； c. WT 鹽酸組：肺泡和肺間質中大量陽性細胞浸潤； d. PSGL-1 敲除鹽酸組：肺組織中見少量陽性細胞浸潤
圖8
肺組織免疫組化病理檢查像（巨噬細胞 CD68 免疫組化×400） a. WT 生理鹽水組：未見陽性細胞； b. PSGL-1 敲除生理鹽水組：未見陽性細胞； c. WT 鹽酸組：肺泡腔和肺間質中大量陽性細胞浸潤； d. PSGL-1 敲除鹽酸組：肺組織少量陽性細胞浸潤
圖9
肺組織免疫組化病理檢查像（粒細胞 Gr-1 免疫組化×400） a. WT 生理鹽水組：未見陽性細胞； b. PSGL-1 敲除生理鹽水組：未見陽性細胞； c. WT 鹽酸組：肺組織大量陽性細胞浸潤； d. PSGL-1 敲除鹽酸組：肺泡腔和肺間質少量陽性細胞浸潤
3 討論
酸性胃內容物誤吸所致吸入性肺炎是 ALI/ARDS 發生及發展的獨立危險因素，在臨床急性肺功能障礙疾病中占很高比例[10]，其中約 22% 患者將發展為 ARDS，死亡率極高。肺內炎癥反應和炎癥細胞的浸潤是 ALI/ARDS 的一個顯著標志。研究發現在感染或損傷發生部位，細胞的一系列黏附和細胞傳導信號實時調節著炎癥反應的發生[8, 11-13]，在血液循環中，白細胞必須和血管壁黏附才能啟動上述炎癥反應。而這一初始黏附過程受到位于內皮細胞的選擇素黏附分子 P-selectin 和 E-selectin 及其相應配體 PSGL-1 的調控[14]。研究發現 PSGL-1 單克隆抗體能夠抑制小鼠體內白細胞在有 P-selectin 表達的毛細血管后微靜脈上的黏附和滾動[15]。此外，在 PSGL-1 敲除小鼠創傷所致炎癥早期，白細胞在小鼠提睪肌靜脈中的滾動顯著減少[16]。研究表明 PSGL-1 在炎癥反應初期介導白細胞在血管內皮上的滾動和遷移，在啟動炎癥反應過程具有重要作用。基于以上研究結果，本研究采用 PSGL-1 敲除小鼠探索 PSGL-1 在小鼠鹽酸吸入性 ALI 模擬吸入性肺炎模型中的作用及其可能的作用機制。
本研究結果顯示，鹽酸刺激 2 h 時，WT 小鼠較 PSGL-1 敲除小鼠肺功能變化大，肺組織炎癥因子 IL-6 和 IL-1β蛋白表達水平升高更加明顯且均顯著高于對應生理鹽水組，鏡下見肺組織病理損害更為嚴重。特異性免疫組化染色可見：與生理鹽水組比較，鹽酸組小鼠肺間質和肺泡腔白細胞、巨噬細胞和粒細胞浸潤顯著增加，且 WT 小鼠肺組織浸潤更加明顯。上述結果提示，PSGL-1 在鹽酸誘導小鼠 ALI 病程中起著重要的作用，可以加重鹽酸吸入致 ALI 的炎癥反應。
NF-κB 是一種核轉錄調節蛋白，參與多種炎癥介質基因的轉錄和調控[17]，NF-κB 激活后在 ALI/ARDS 的病理損害過程中發揮重要的作用[18]。研究發現臨床上 ALI/ARDS 患者肺泡巨噬細胞激活后，其 NF-κB 活性顯著增強，進而導致促炎因子分泌增多[19]。細胞靜息狀態下，NF-κB（p50/p65 二聚體）與抑制蛋白 IκBa 結合形成三聚體復合物，在細胞質中呈現出無活性的狀態，只有在與 IκBa 脫離后，NF-κB 進入胞核才發揮活性。本研究結果顯示，鹽酸刺激后肺組織 NF-κB（p65）和 p-IκBa 蛋白表達水平顯著升高，IκBa 蛋白表達水平明顯降低，表明肺組織細胞中 NF-κB 三聚體復合物解離，p65 蛋白從 NF-κB 三聚體復合物中解離出來，NF-κB 信號通路被激活。值得一提的是，吸入鹽酸 2 h 時，WT 小鼠較 PSGL-1 敲除小鼠肺組織 NF-κB（p65）和 p-IκBa 蛋白表達水平升高更明顯，IκBa 蛋白表達水平降低更顯著，提示鹽酸刺激后，PSGL-1 可能通過激活 NF-κB 信號通路，進而上調 IL-1β和 IL-6 等炎性因子的轉錄和蛋白合成[20-21]，促進其大量釋放。釋放的炎癥因子可進一步激活 NF-κB 信號通路從而進一步加重肺部炎癥，使血管內皮細胞發生彌散性損傷，引起肺泡-毛細血管通透性增加，肺間質和肺泡腔中性粒細胞等炎癥細胞聚集，大量含有蛋白質和炎性介質的液體向肺泡腔中滲入，最終導致肺組織水腫和小鼠呼吸功能障礙[3-5]。此外，大量炎性因子的釋放和炎癥細胞的聚集會進一步加重肺通氣/血流比例的失調和氧合障礙[22]，使動脈血 PaO2 顯著降低，組織缺氧明顯，致動脈血 pH 下降；同時，由于炎癥反應加劇，氣道內炎性滲出增加，氣道內分泌物增多，小鼠出現 CO2 潴留，加重酸中毒，二者共同導致動脈血 pH 低于正常。
本研究通過鹽酸吸入誘導小鼠 ALI 模擬臨床上吸入性肺炎模型，證明了 PSGL-1 在鹽酸吸入性肺損傷病程中發揮重要作用，研究結果發現 PSGL-1 敲除小鼠肺損傷程度明顯減輕，這可能與 PSGL-1 能夠激活 NF-κB 信號通路從而誘導肺部炎癥反應發生與白細胞浸潤有關。結合已有研究證明給予小鼠單克隆抗體阻斷 PSGL-1 能減輕白細胞在小靜脈上的滾動，從而減少炎癥細胞向炎癥部位的趨化[23]，因此有理由認為 PSGL-1 可能為臨床吸入性肺損傷的治療提供新的靶點。
酸性胃內容物誤吸所導致的急性肺損傷（ALI）是臨床上圍手術期和麻醉期常見的并發癥，主要表現為進行性頑固性低氧血癥、非心源性肺水腫和肺泡-毛細血管通透性增加，嚴重的 ALI 最終可發展成為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），死亡率高達 40% 以上，是重癥監護室患者死亡的首要原因[1-2]。因此，探索反流誤吸所致 ALI 的發生機制，尋找肺損傷中關鍵靶點對于有效預防和治療該類疾病具有重要意義。
肺微血管內皮是血液和肺組織的第一道屏障，它能有效預防血液中的細胞和蛋白滲入到肺間質和肺泡腔中。ALI/ARDS 患者肺泡上皮細胞和血管內皮細胞發生彌散性損傷，進而引起血管內皮功能障礙，其特點是肺微血管多形核白細胞黏附增加，同時伴有肺泡-毛細血管通透性增加，最終導致肺水腫和肺間質及肺泡腔炎癥細胞浸潤[3-5]。 P-選擇素（P-selectin）是位于血管內皮細胞棒管狀（Weibel-Palade）小體和血小板α-顆粒內的細胞黏附分子，是選擇素家族的主要成員，也是炎癥早期介導白細胞與內皮細胞最初黏附、啟動炎癥反應并維持炎癥狀態的關鍵成分[6-7]。P-選擇素糖蛋白配體 （P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）是選擇素黏附分子配體中的一種，主要表達于白細胞，能與 三種選擇素黏附分子結合，對 P-selectin 的親和力最高[8-9]。研究發現 PSGL-1 對于 P-selectin 介導的白細胞在血管中的滾動和遷移必不可少[8]。在炎癥反應 過程中，PSGL-1 通過與其相應受體 P-selectin 結合從而介導白細胞與血管管壁接觸，使白細胞在血管壁上緩慢滾動，進而啟動一系列反應，最終導致白細 胞在炎癥反應區集中。因此，我們推測在以炎癥細胞 浸潤為主要特征進而導致肺功能損傷的 ALI 病理過程中，PSGL-1 可能發揮重要的作用。本實驗采用 PSGL-1 敲除小鼠探索 PSGL-1 在鹽酸（HCl）誘導小 鼠 ALI 中的作用及其可能的作用機制，從而為臨床上吸入性肺炎所致 ALI/ARDS 的治療提供新的依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和材料
健康雄性野生型（WT）小鼠和 PSGL-1 敲除（PSGL-1 -/-）小鼠由 Oklahoma Medical Research Foundation（OMRF）Xia Lijun 教授贈予。IL-1β 及 IL-6 ELISA 試劑盒（上海信帆公司）；免疫印跡核因子-κB（NF-κB）p65、IκBa 及 p-IκBa 抗體（美國 Cell Signaling Technology 公司）；CD68 抗體（Novus 公司），CD45 抗體（美國 BD 公司）。實驗動物呼吸功能檢測儀（法國 EMKA 公司），手持式血氣分析儀和血氣生化八項測試卡片（上海雅培貿易有限公司）。實驗動物操作程序得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準（批準號：ILAS-PG-2015-017）。
1.2 實驗分組
將 30 只 WT 小鼠和 30 只 PSGL-1 敲除小鼠隨機分為鹽酸組和生理鹽水組，每組 15 只，單側肺導管滴注 0.1 mol/L 鹽酸或生理鹽水（NS，1 μl/g 體重），觀察吸入后 2 h 小鼠炎性指標及病理學等的改變。
1.3 實驗方法
鹽酸組和生理鹽水組小鼠經 1.2% 三溴乙醇（腹腔內注射，0.2 ml/10 g 體重）麻醉后，60° 傾斜仰臥位固定，頸前切口（5 mm）暴露氣管，迅速將導管（內徑 0.28 mm）插入左主支氣管，導管末端連接微量加樣器，緩慢推注 0.1 mol/L 鹽酸溶液（pH1.25）和生理鹽水（1 μl/g 體重），滴注結束時再推注適量空氣以確保全部鹽酸或生理鹽水進入靶肺，拔出導管并豎直放置小鼠 5 min。小鼠術后放置于動物加熱板保溫處理。待小鼠蘇醒后，密切觀察并單籠飼養。
1.4 觀察指標
1.4.1 呼吸功能檢測 增強呼氣間歇（enhanced pause，Penh）最常用于小鼠呼吸功能研究，反映氣道阻力大小。給予鹽酸或生理鹽水 2 h 時，進行約 15 min 的 Penh 檢測。
1.4.2 動脈血氣分析 腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠，經腹主動脈快速抽取動脈血，棄去前 1～2 滴血，迅速注滿血氣芯片，測量動脈血 pH 值、氧分壓（PaO2）和二氧化碳分壓（PaCO2）。
1.4.3 支氣管肺泡灌洗液 每組 5 只小鼠右肺門部結扎，0.3 ml 4 ℃ 預冷的生理鹽水注入左主支氣管并緩慢回吸收支氣管肺泡灌洗液（BALF），重復 3 次，收集所有灌洗液（回收率一般大于 80%），4 ℃，1 500 r/min 離心 10 min，測定 BALF 總蛋白濃度及白細胞計數。
1.4.4 病理學檢測 取小鼠左側肺，4% 多聚甲醛固定 24 h，常規修塊、脫水、石蠟包埋以及切片（4 μm），HE染色，鏡下判斷肺損傷程度。
1.4.5 免疫組化 肺部組織切片進行 CD45、CD68 和 Gr-1 的免疫組化檢測分析，棕色為陽性表達。
1.4.6 炎癥因子及 NF-κB 信號通路相關蛋白檢測 每組 5 只小鼠左肺，提取全蛋白，ELISA 方法檢測 IL-1β 和 IL-6 炎癥因子表達量，免疫印跡法檢測 NF-κB 信號通路相關蛋白 NF-κB（p65）、IκBa 和p-IκBa 表達水平。
1.4.7 肺組織濕干重比值（W/D） 取左肺，濾紙吸取組織表面的血液及雜質，稱肺濕重后，將肺組織置于 60 ℃ 烘箱內烘干 72 h 至重量恒重，稱量肺干重，計算 W/D，評估各組肺組織水腫程度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計學分析。所有數據進行正態性檢驗，計數資料用均數±標準差（ ）表示。多樣本均數間比較采用 One-way ANOVA 檢驗，兩組差異比較用 LSD 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 呼吸功能（Penh）和動脈血氣
PSGL-1 敲除小鼠在鹽酸刺激 2 h 時，其 Penh 明顯低于 WT 鼠（4.77±1.22 vs. 5.80±0.84），且均顯著高于其對應的生理鹽水組（P<0.05，圖 1），提示鹽酸刺激后小鼠氣道阻力增加且 WT 鼠氣道受阻更加嚴重。一次性吸入鹽酸 2 h 時，與對應生理鹽水組比較，WT 鼠和 PSGL-1 敲除鹽酸組的動脈血 pH 和 PaO2 明顯降低，PaCO2 明顯升高，且 WT 組較 PSGL-1 敲除組動脈血 pH 和 PaO2 降低更顯著，PaCO2 升高更明顯（P<0.05，表 1）。兩種小鼠生理鹽水組的 Penh 和動脈血氣差異均不顯著。上述結果表明鹽酸刺激后，兩組小鼠肺功能均出現不同程度酸中毒，高碳酸血癥以及低氧血癥，且 WT 小鼠肺功能降低更明顯。
圖1
4 組小鼠呼吸功能的變化情況
表1
各組小鼠肺動脈血氣（n=15，
）
2.2 BALF 白細胞計數、蛋白濃度及肺W/D
鹽酸刺激后，WT 和 PSGL-1 敲除小鼠 BALF 中白細胞計數和蛋白濃度及肺W/D與其各自相對應的生理鹽水組比較均有明顯升高，且 WT 鼠 BALF 蛋白濃度 [（4.74±0.98）μg/μl vs.（3.71±0.64）μg/μl]、白細胞計數 [（49.42±3.35）×107/L vs.（13.00± 2.18）×107/L] 和肺 W/D（5.22±0.20 vs. 4.86±0.15）升高程度較 PSGL-1 敲除小鼠更為顯著，差異有統計學意義（P<0.05，圖 2）。兩種小鼠生理鹽水組的三項檢測指標無明顯差異。這一結果提示，PSGL-1 敲除小鼠肺泡-毛細血管屏障破壞程度和肺水腫程度較 WT 鼠明顯減輕。
圖2
小鼠 BALF 白細胞計數、蛋白濃度及肺W/D a. BALF 白細胞計數； b. BALF 蛋白濃度； c. 肺W/D
2.3 肺組織 IL-6 和 IL-1β的表達
采用 ELISA 法檢測肺組織 IL-6 和 IL-1β 的表達。鹽酸刺激后 WT 和 PSGL-1 敲除小鼠肺組織炎癥因子 IL-6 和 IL-1β 蛋白表達水平與其各自相對應的生理鹽水組比較均有明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。與 PSGL-1 敲除小鼠鹽酸組比較，WT 鼠肺組織 IL-6 和 IL-1β 蛋白水平升高更顯著且差異有統計學意義（P<0.05），而兩種小鼠生理鹽水組 IL-6 和 IL-1β 蛋白水平無明顯變化。結果見圖 3。
圖3
小鼠肺組織 IL-6 和 IL-1β蛋白表達水平 a. 肺組織 IL-6 蛋白含量； b. 肺組織 IL-1β 蛋白含量
2.4 免疫印跡法檢測 NF-κB（p65）、p-IκBa 和 IκBa 的表達水平
4 組小鼠肺組織蛋白 NF-κB（p65）、IκBa 及 p-IκBa 表達水平均有顯著差異（P<0.01）。兩種小鼠在給予鹽酸刺激后，與對應生理鹽水組比較，其肺組織 p65 和 p-IκBa 表達水平均有顯著性升高，IκBa 表達水平均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。且 WT 小鼠鹽酸組較 PSGL-1 敲除小鼠鹽酸組肺組織蛋白 p65 和 p-IκBa 表達水平升高更明顯（P<0.05），IκBa 表達水平降低更顯著，差異有統計學意義（P<0.05），兩種小鼠生理鹽水組肺組織 NF-κB（p65）、p-IκBa 及 IκBa 表達水平無明顯差異。結果見圖 4 和圖 5。
圖4
免疫印跡法檢測 NF-κB（p65）、IκBa 及 p-IκBa 蛋白表達情況
圖5
小鼠肺組織 NF-κB、p-IκBa 和 IκBa 蛋白表達半定量分析 a. NF-κB（p65）蛋白表達量； b. IκBa 蛋白表達量； c. p-IκBa 蛋白表達量
2.5 肺組織病理學改變
生理鹽水刺激的WT 小鼠和 PSGL-1 敲除小鼠肺組織結構均保持完整，未見明顯病變。給予鹽酸刺激后，與生理鹽水組比較，鹽酸組小鼠肺泡腔結構大量破壞，肺間質明顯水腫，肺組織中有大量炎癥細胞和紅細胞浸潤，且 WT 小鼠肺部水腫、肺部炎癥細胞浸潤及肺泡結構破壞情況較 PSGL-1 敲除組更為顯著。結果見圖 6。
圖6
小鼠肺組織病理檢查像（HE×200） a. WT 生理鹽水組：肺組織結構完整，未見炎癥細胞及紅細胞浸潤； b. PSGL-1 敲除生理鹽水組：肺組織結構完整，無明顯炎癥反應及紅細胞滲出； c. WT 鹽酸組：肺泡腔結構嚴重破壞，肺間質水腫，大量炎癥細胞和紅細胞浸潤； d. PSGL-1 敲除鹽酸組：部分肺泡結構破壞，肺間質水腫，少量炎癥細胞和紅細胞浸潤
2.6 肺組織免疫組化
CD45 為白細胞膜表面標志物，與生理鹽水組比較，WT 鹽酸組小鼠肺間質有大量白細胞浸潤且明顯多于 PSGL-1 敲除鹽酸組，結果見圖 7。CD68 主要是巨噬細胞的細胞膜表面標志物，鹽酸刺激 2 h 時，WT 小鼠肺間質和肺泡腔中可見大量巨噬細胞浸潤，而 PSGL-1 敲除小鼠浸潤較少，結果見圖 8。Gr-1 主要為粒細胞膜表面標志物，兩種小鼠生理鹽水組肺組織均無粒細胞浸潤，給予鹽酸刺激后，小鼠肺組織出現大量粒細胞浸潤，且與 PSGL-1 敲除小鼠比較，WT 組浸潤更加嚴重，結果見圖 9。
圖7
肺組織免疫組化病理檢查像（白細胞 CD45 免疫組化×400） a. WT 生理鹽水組：未見陽性細胞； b. PSGL-1 敲除生理鹽水組：未見陽性細胞； c. WT 鹽酸組：肺泡和肺間質中大量陽性細胞浸潤； d. PSGL-1 敲除鹽酸組：肺組織中見少量陽性細胞浸潤
圖8
肺組織免疫組化病理檢查像（巨噬細胞 CD68 免疫組化×400） a. WT 生理鹽水組：未見陽性細胞； b. PSGL-1 敲除生理鹽水組：未見陽性細胞； c. WT 鹽酸組：肺泡腔和肺間質中大量陽性細胞浸潤； d. PSGL-1 敲除鹽酸組：肺組織少量陽性細胞浸潤
圖9
肺組織免疫組化病理檢查像（粒細胞 Gr-1 免疫組化×400） a. WT 生理鹽水組：未見陽性細胞； b. PSGL-1 敲除生理鹽水組：未見陽性細胞； c. WT 鹽酸組：肺組織大量陽性細胞浸潤； d. PSGL-1 敲除鹽酸組：肺泡腔和肺間質少量陽性細胞浸潤
3 討論
酸性胃內容物誤吸所致吸入性肺炎是 ALI/ARDS 發生及發展的獨立危險因素，在臨床急性肺功能障礙疾病中占很高比例[10]，其中約 22% 患者將發展為 ARDS，死亡率極高。肺內炎癥反應和炎癥細胞的浸潤是 ALI/ARDS 的一個顯著標志。研究發現在感染或損傷發生部位，細胞的一系列黏附和細胞傳導信號實時調節著炎癥反應的發生[8, 11-13]，在血液循環中，白細胞必須和血管壁黏附才能啟動上述炎癥反應。而這一初始黏附過程受到位于內皮細胞的選擇素黏附分子 P-selectin 和 E-selectin 及其相應配體 PSGL-1 的調控[14]。研究發現 PSGL-1 單克隆抗體能夠抑制小鼠體內白細胞在有 P-selectin 表達的毛細血管后微靜脈上的黏附和滾動[15]。此外，在 PSGL-1 敲除小鼠創傷所致炎癥早期，白細胞在小鼠提睪肌靜脈中的滾動顯著減少[16]。研究表明 PSGL-1 在炎癥反應初期介導白細胞在血管內皮上的滾動和遷移，在啟動炎癥反應過程具有重要作用。基于以上研究結果，本研究采用 PSGL-1 敲除小鼠探索 PSGL-1 在小鼠鹽酸吸入性 ALI 模擬吸入性肺炎模型中的作用及其可能的作用機制。
本研究結果顯示，鹽酸刺激 2 h 時，WT 小鼠較 PSGL-1 敲除小鼠肺功能變化大，肺組織炎癥因子 IL-6 和 IL-1β蛋白表達水平升高更加明顯且均顯著高于對應生理鹽水組，鏡下見肺組織病理損害更為嚴重。特異性免疫組化染色可見：與生理鹽水組比較，鹽酸組小鼠肺間質和肺泡腔白細胞、巨噬細胞和粒細胞浸潤顯著增加，且 WT 小鼠肺組織浸潤更加明顯。上述結果提示，PSGL-1 在鹽酸誘導小鼠 ALI 病程中起著重要的作用，可以加重鹽酸吸入致 ALI 的炎癥反應。
NF-κB 是一種核轉錄調節蛋白，參與多種炎癥介質基因的轉錄和調控[17]，NF-κB 激活后在 ALI/ARDS 的病理損害過程中發揮重要的作用[18]。研究發現臨床上 ALI/ARDS 患者肺泡巨噬細胞激活后，其 NF-κB 活性顯著增強，進而導致促炎因子分泌增多[19]。細胞靜息狀態下，NF-κB（p50/p65 二聚體）與抑制蛋白 IκBa 結合形成三聚體復合物，在細胞質中呈現出無活性的狀態，只有在與 IκBa 脫離后，NF-κB 進入胞核才發揮活性。本研究結果顯示，鹽酸刺激后肺組織 NF-κB（p65）和 p-IκBa 蛋白表達水平顯著升高，IκBa 蛋白表達水平明顯降低，表明肺組織細胞中 NF-κB 三聚體復合物解離，p65 蛋白從 NF-κB 三聚體復合物中解離出來，NF-κB 信號通路被激活。值得一提的是，吸入鹽酸 2 h 時，WT 小鼠較 PSGL-1 敲除小鼠肺組織 NF-κB（p65）和 p-IκBa 蛋白表達水平升高更明顯，IκBa 蛋白表達水平降低更顯著，提示鹽酸刺激后，PSGL-1 可能通過激活 NF-κB 信號通路，進而上調 IL-1β和 IL-6 等炎性因子的轉錄和蛋白合成[20-21]，促進其大量釋放。釋放的炎癥因子可進一步激活 NF-κB 信號通路從而進一步加重肺部炎癥，使血管內皮細胞發生彌散性損傷，引起肺泡-毛細血管通透性增加，肺間質和肺泡腔中性粒細胞等炎癥細胞聚集，大量含有蛋白質和炎性介質的液體向肺泡腔中滲入，最終導致肺組織水腫和小鼠呼吸功能障礙[3-5]。此外，大量炎性因子的釋放和炎癥細胞的聚集會進一步加重肺通氣/血流比例的失調和氧合障礙[22]，使動脈血 PaO2 顯著降低，組織缺氧明顯，致動脈血 pH 下降；同時，由于炎癥反應加劇，氣道內炎性滲出增加，氣道內分泌物增多，小鼠出現 CO2 潴留，加重酸中毒，二者共同導致動脈血 pH 低于正常。
本研究通過鹽酸吸入誘導小鼠 ALI 模擬臨床上吸入性肺炎模型，證明了 PSGL-1 在鹽酸吸入性肺損傷病程中發揮重要作用，研究結果發現 PSGL-1 敲除小鼠肺損傷程度明顯減輕，這可能與 PSGL-1 能夠激活 NF-κB 信號通路從而誘導肺部炎癥反應發生與白細胞浸潤有關。結合已有研究證明給予小鼠單克隆抗體阻斷 PSGL-1 能減輕白細胞在小靜脈上的滾動，從而減少炎癥細胞向炎癥部位的趨化[23]，因此有理由認為 PSGL-1 可能為臨床吸入性肺損傷的治療提供新的靶點。
