引用本文： 索良源, 于泓波, 張錦. M3受體亞型介導內毒素誘導兔離體肺動脈舒張反應的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(5): 506-510. doi: 10.7507/1671-6205.2016116 復制
內毒素休克(endotoxic shock, ES)的發生、發展是一個連續演變和復雜的過程，雖然目前對其發病機制的研究已深入到細胞、亞微結構和分子水平，但還未能充分闡明其發病特點與具體機制[1]。而血管反應性改變是內毒素休克的主要病理特征。其中, 肺動脈高壓的形成是ES急性肺損傷的早期表現，也是引起死亡的重要原因之一[2]。因此, 探討防治ES時肺動脈高壓的形成及其作用機制已成為該領域重要的研究課題。Attinà等[3]的研究發現M毒蕈堿受體亞型M3介導了肺動脈對乙酰膽堿(ACH)舒張反應。而在內毒素作用下肺動脈的內皮依賴性的肺動脈舒張反應減低[4-5]。而ACH通路是血管張力調節的一條重要通路。但在感染性休克時，肺動脈高壓是否是由肺動脈內皮的M3受體內在活性降低使M3受體介導的舒張反應降低所造成的，并沒有得到證實。本研究通過觀察感染性休克時M3受體活性的改變探討感染性休克肺動脈血管反應性改變的機制，以解釋感染性休克時肺動脈高壓的形成機制, 并為臨床感染性休克的治療提供依據。
材料及方法
一 材料
健康成年雄性新西蘭大耳白兔，體重2.0~2.5 kg，由中國醫科大學盛京醫院動物試驗室提供。大腸桿菌內毒素E. coli脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美國Sigma公司，型號L2880，用生理鹽水稀釋成濃度為10%的溶液，-20 ℃保存)；達非那新(美國Sigma公司)；去氧腎上腺素(PE，深圳沃蘭德有限公司)；ACH(Sigma公司)；KRB液；RPMI-1640培養液(美國，Gibco公司)；器材：血管環儀器、恒溫水浴鍋(成都儀器廠), 張力換能器及生理記錄儀(Power Lab 4/25T;澳大利亞，ADI公司)。
二 方法
1.?離體肺血管環的制備：試驗前動物禁食12 h，將動物放入密閉的1 L容器中用異氟醚以1 mL/kg麻醉后快速行心肺聯合取出術，置于4 ℃改良Krebs-Ringer bicarbonate (KRB)液中，分離左肺和右下肺。小心分離肺動脈[二級，內徑(ID)1~2 mm]，將血管周圍組織清理干凈，切成3 mm長的血管環，避免損傷血管內皮。
2.?試驗分組:將血管各分為兩組正常組(N組，n=45)和內毒素組(L組，n=48)，正常組血管環用RPMI-1640培養液孵育4 h，內毒素組在培養液中加入內毒素4 μg/mL孵育4 h，觀察血管張力的變化，張力結果用kg tension/g dw表示，然后分別用達非那新終濃度為100、10、1、0.1和0.01 μmol/L孵育30 min，觀察血管張力的變化。注意在培養液中通入95%O2和5%CO2，并保持溫度在37 ℃。
3.?血管張力的檢測:將預處理的血管環垂直懸掛于兩個不銹鋼環上，置于含有5 mL KRB (37 ℃)的恒溫浴槽中，通入95% O2和5% CO2。一端固定，另一端連上張力換能器。調節血管環張力，從0 g開始，每隔5 min使張力增加0.5 g，直至最適張力1.5 g, 平衡90 min，期間每10 min換一次液，記錄平衡后的張力值。檢測血管活性，加入終濃度為1 μmol/L的PE，收縮幅度小于300 mg者棄去。待收縮反應曲線至平臺后加入終濃度為10 μmol/L ACH, 以檢測內皮細胞的完整性，若出現60%以上的舒張反應為內皮細胞完整。用KRB液反復洗脫3~5次，至回到基礎張力，平衡30 min。對照組加入生理鹽水孵育30 min, 其他組分別加入達非那新終濃度為100、10、1、0.1和0.01 μmol/L孵育30 min，然后用PE 1 μmol/L預收縮血管環，記錄預收縮值PEAX, 收縮達平臺后加入ACH濃度1、10和100 μmol/L，記錄ACH累計濃度血管張力變化。內毒素組進行相同的試驗觀察血管張力的變化。舒張反應結果用占PE(1 μmol/L)收縮值的百分比表示。
三 統計學處理
運用SPSS軟件13.0對肺動脈血管環舒張百分比做出分析。數據以x±s表示，組間比較獨立樣本t檢驗，組內比較用方差分析。P＜0.05為有統計學差異。
結果
一 兩組血管對ACH舒張反應比較
正常組肺動脈對ACH累計曲線的舒張百分比分別為(0.095±0.034)%，(0.150±0.036)%，(0.445±0.090)%，用內毒素(LPS 4 μg/mL，4 h)處理后分別為(0.044±0.016)%, (0.093±0.029)%, (0.311±0.028)%。內毒素孵育降低了肺動脈對ACH的舒張反應，并且M3受體亞型介導了此舒張反應。結果見表 1。
表1
兩組血管對ACH舒張反應百分比的比較(%，n=8, x±s)
二 不同濃度ACH的EC50值
M3受體阻斷劑達非那新對不同濃度ACH(1、10和100 μmol/L)反應, 得出的EC50值，正常組為1.483、2.757和2.958，內毒素組為6.015、6.242和6.411。從結果得出相同濃度的ACH內毒素組的EC50值要明顯大于正常組。這說明內毒素組M3受體所介導的舒張反應與正常組相比明顯降低。結果見表 2。
表2
不同濃度ACH的EC50值
三 不同濃度ACH時M3受體的內在活性a值
M3受體阻斷劑達非那新對不同濃度的ACH反應，得出的內在活性a值分別為正常組0.014 6、0.032 3和0.082 5，內毒素組0.012 4、0.024 5和0.055 6。結果見表 3。達非那新濃度取對數繪制的量效曲線圖見圖 1，從量效曲線可以看出在相同濃度ACH時，內毒素組的最大效能Emax均減低。說明內毒素降低了M3受體內在活性從而使ACH(1、10和100 μmol/L)對肺動脈的舒張反應降低。根據Lineweaver-Burk作圖法(圖 2)用最小二乘法求得方程直線：NACH1：y=-12.206x+ 68.35;NACH10: y=-4.903 7x+30.595; NACH100: y=-2.181 5x+ 12.119;LACH1:y=-12.167x+80.695;LACH10:y=-6.341 9x+40.759;LACH100:y=-3.329 9x+17.998。從圖中可以看出內毒素組在ACH(1、10和100 μmol/L)對肺動脈的舒張反應均低于正常組。這也證實了圖 1和表 3中得到的結果。
表3
不同濃度ACH時M3受體的a值
圖1
不同濃度達非那新繪制的量效曲線圖
圖2
Lineweaver-Burk作圖法
四 不同濃度的達非那新的直線回歸圖
從達非那新的量效曲線上可以發現達非那新10、1和0.1 μmol/L位于量效曲線較陡的部分，對這三個劑量進行直線回歸作圖(圖 3)，分別求得相應的斜率為：Knach1=-0.024 4；Knach10=-0.034 8; Knach100=-0.107 7; Klach1=-0.008 8, Klach10=-0.027 5; Klach100=-0.085 5。斜率的絕對值可以體現出達非那新的效能，從結果中可以看出相同濃度的ACH的斜率內毒素組均小于正常組，表明在內毒素組達非那新(M3受體)拮抗劑的效能小于正常組。這也進一步說明內毒素組M3受體內在活性低于正常組。
圖3
不同濃度達非那新的直線回歸圖
討論
感染性休克在臨床上主要表現為體循環阻力下降，肺循環阻力增高。肺臟是最易受累的器官，休克時表現為高壓、高阻[6-7]。感染性休克誘發急性肺損傷的發病機制復雜且尚未完全明確，探討其可能的發病機制有利于尋求有效的治療措施[8]。感染性休克后肺動脈內皮細胞結構受到破壞，內皮依賴性舒張反應受到抑制[2]，內毒素損傷血管內皮細胞后，抑制iNOS的表達，引起內皮源性NO的減少，使血管收縮性增強[9]。從而導致了肺動脈高壓。已有研究證實，在ACH誘發的血管調節機制中，當ACH作用于血管平滑肌上的M受體時產生收縮反應，當ACH作用于血管內皮上的M受體時，則產生內皮源性血管舒張因子NO, 從而使血管舒張[10]。內毒素休克后，ACH大量釋放，但內皮細胞中的M受體數量減少，影響NO的生成，ACH對肺血管內皮依賴性舒張抑制；同時，內毒素致肺血管平滑肌上M受體密度上調，ACH轉而通過直接刺激血管平滑肌上的M受體產生血管收縮作用，使肺循環阻力的增高[11]。毒蕈堿型乙酰膽堿受體家族是由五個(M1-M5)亞型組成。存在于大多數血管床中，毒蕈堿受體激活通過血管內皮細胞釋放血管擴張劑導致血管舒張[12]。Attinà等[3]的研究發現M3受體亞型介導了肺動脈對ACH的舒張反應。佟冬怡等[10]在兔肺動脈離體試驗中發現，應用大劑量長托寧能逆轉內毒素休克兔肺動脈對ACH的舒張反應的降低。長托寧是一種新型抗膽堿能藥物，其選擇性阻斷M1、M3受體。所以感染性休克時肺動脈高壓有可能是由于內毒素造成肺動脈內皮的M3受體內在活性降低從而使M3受體介導的舒張反應降低造成的。本研究通過觀察感染性休克時M3受體活性的改變探討感染性休克肺動脈血管反應性改變的機制，以解釋感染性休克時肺動脈高壓的形成機制, 并為臨床感染性休克的治療提供依據。
本研究結果顯示，內毒素減弱了肺動脈對ACH的舒張反應，而對PE的收縮反應沒有影響，這表明我們的內毒素孵育模型是成功的。從表 1可以知道，內毒素使肺動脈對ACH的舒張反應顯著降低，在加入M3受體特異性阻斷劑達非那新(100、10、1和0.1 μmol/L)后正常組和內毒素組肺動脈對ACH的舒張反應均降低，表明M3受體亞型介導了內毒素使ACH舒張反應的降低。但從圖 1結果可知，相同濃度的ACH下對內毒素組產生的舒張反應低于正常組。并且從圖 2和圖 3還可以知道，在內毒素的作用下M3受體的親和力明顯降低。根據達非那新對不同濃度ACH(1、10和100 μmol/L)反應得出的EC50值，從EC50值得知相同濃度的ACH下內毒素組的EC50值要明顯大于正常組。這說明內毒素組M3受體親和力與正常組相比明顯降低。而造成親和力變化主要有兩方面原因：一方面是受體的數量發生了變化，一方面是受體的內在活性發生了變化。M3受體是一種蛋白質，其合成需要一定時間，本試驗中內毒素僅僅作用了4 h，所以數量上的變化可能性極小。從表 3可以發現，M3受體在內毒素作用下其內在活性a值顯著降低。因此推斷內毒素可以使M3受體的內在活性顯著降低，從而引起肺動脈在內毒素作用下ACH反應的降低并導致肺動脈高壓。
綜上所述，M3受體亞型介導了內毒素時肺動脈舒張反應減低，并且內毒素使M3受體亞型內在活性的減低可能是肺動脈舒張反應降低的作用機制之一。感染性休克時肺動脈高壓其機制與M3受體活性改變使肺動脈舒張反應降低有關。
內毒素休克(endotoxic shock, ES)的發生、發展是一個連續演變和復雜的過程，雖然目前對其發病機制的研究已深入到細胞、亞微結構和分子水平，但還未能充分闡明其發病特點與具體機制[1]。而血管反應性改變是內毒素休克的主要病理特征。其中, 肺動脈高壓的形成是ES急性肺損傷的早期表現，也是引起死亡的重要原因之一[2]。因此, 探討防治ES時肺動脈高壓的形成及其作用機制已成為該領域重要的研究課題。Attinà等[3]的研究發現M毒蕈堿受體亞型M3介導了肺動脈對乙酰膽堿(ACH)舒張反應。而在內毒素作用下肺動脈的內皮依賴性的肺動脈舒張反應減低[4-5]。而ACH通路是血管張力調節的一條重要通路。但在感染性休克時，肺動脈高壓是否是由肺動脈內皮的M3受體內在活性降低使M3受體介導的舒張反應降低所造成的，并沒有得到證實。本研究通過觀察感染性休克時M3受體活性的改變探討感染性休克肺動脈血管反應性改變的機制，以解釋感染性休克時肺動脈高壓的形成機制, 并為臨床感染性休克的治療提供依據。
材料及方法
一 材料
健康成年雄性新西蘭大耳白兔，體重2.0~2.5 kg，由中國醫科大學盛京醫院動物試驗室提供。大腸桿菌內毒素E. coli脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美國Sigma公司，型號L2880，用生理鹽水稀釋成濃度為10%的溶液，-20 ℃保存)；達非那新(美國Sigma公司)；去氧腎上腺素(PE，深圳沃蘭德有限公司)；ACH(Sigma公司)；KRB液；RPMI-1640培養液(美國，Gibco公司)；器材：血管環儀器、恒溫水浴鍋(成都儀器廠), 張力換能器及生理記錄儀(Power Lab 4/25T;澳大利亞，ADI公司)。
二 方法
1.?離體肺血管環的制備：試驗前動物禁食12 h，將動物放入密閉的1 L容器中用異氟醚以1 mL/kg麻醉后快速行心肺聯合取出術，置于4 ℃改良Krebs-Ringer bicarbonate (KRB)液中，分離左肺和右下肺。小心分離肺動脈[二級，內徑(ID)1~2 mm]，將血管周圍組織清理干凈，切成3 mm長的血管環，避免損傷血管內皮。
2.?試驗分組:將血管各分為兩組正常組(N組，n=45)和內毒素組(L組，n=48)，正常組血管環用RPMI-1640培養液孵育4 h，內毒素組在培養液中加入內毒素4 μg/mL孵育4 h，觀察血管張力的變化，張力結果用kg tension/g dw表示，然后分別用達非那新終濃度為100、10、1、0.1和0.01 μmol/L孵育30 min，觀察血管張力的變化。注意在培養液中通入95%O2和5%CO2，并保持溫度在37 ℃。
3.?血管張力的檢測:將預處理的血管環垂直懸掛于兩個不銹鋼環上，置于含有5 mL KRB (37 ℃)的恒溫浴槽中，通入95% O2和5% CO2。一端固定，另一端連上張力換能器。調節血管環張力，從0 g開始，每隔5 min使張力增加0.5 g，直至最適張力1.5 g, 平衡90 min，期間每10 min換一次液，記錄平衡后的張力值。檢測血管活性，加入終濃度為1 μmol/L的PE，收縮幅度小于300 mg者棄去。待收縮反應曲線至平臺后加入終濃度為10 μmol/L ACH, 以檢測內皮細胞的完整性，若出現60%以上的舒張反應為內皮細胞完整。用KRB液反復洗脫3~5次，至回到基礎張力，平衡30 min。對照組加入生理鹽水孵育30 min, 其他組分別加入達非那新終濃度為100、10、1、0.1和0.01 μmol/L孵育30 min，然后用PE 1 μmol/L預收縮血管環，記錄預收縮值PEAX, 收縮達平臺后加入ACH濃度1、10和100 μmol/L，記錄ACH累計濃度血管張力變化。內毒素組進行相同的試驗觀察血管張力的變化。舒張反應結果用占PE(1 μmol/L)收縮值的百分比表示。
三 統計學處理
運用SPSS軟件13.0對肺動脈血管環舒張百分比做出分析。數據以x±s表示，組間比較獨立樣本t檢驗，組內比較用方差分析。P＜0.05為有統計學差異。
結果
一 兩組血管對ACH舒張反應比較
正常組肺動脈對ACH累計曲線的舒張百分比分別為(0.095±0.034)%，(0.150±0.036)%，(0.445±0.090)%，用內毒素(LPS 4 μg/mL，4 h)處理后分別為(0.044±0.016)%, (0.093±0.029)%, (0.311±0.028)%。內毒素孵育降低了肺動脈對ACH的舒張反應，并且M3受體亞型介導了此舒張反應。結果見表 1。
表1
兩組血管對ACH舒張反應百分比的比較(%，n=8, x±s)
二 不同濃度ACH的EC50值
M3受體阻斷劑達非那新對不同濃度ACH(1、10和100 μmol/L)反應, 得出的EC50值，正常組為1.483、2.757和2.958，內毒素組為6.015、6.242和6.411。從結果得出相同濃度的ACH內毒素組的EC50值要明顯大于正常組。這說明內毒素組M3受體所介導的舒張反應與正常組相比明顯降低。結果見表 2。
表2
不同濃度ACH的EC50值
三 不同濃度ACH時M3受體的內在活性a值
M3受體阻斷劑達非那新對不同濃度的ACH反應，得出的內在活性a值分別為正常組0.014 6、0.032 3和0.082 5，內毒素組0.012 4、0.024 5和0.055 6。結果見表 3。達非那新濃度取對數繪制的量效曲線圖見圖 1，從量效曲線可以看出在相同濃度ACH時，內毒素組的最大效能Emax均減低。說明內毒素降低了M3受體內在活性從而使ACH(1、10和100 μmol/L)對肺動脈的舒張反應降低。根據Lineweaver-Burk作圖法(圖 2)用最小二乘法求得方程直線：NACH1：y=-12.206x+ 68.35;NACH10: y=-4.903 7x+30.595; NACH100: y=-2.181 5x+ 12.119;LACH1:y=-12.167x+80.695;LACH10:y=-6.341 9x+40.759;LACH100:y=-3.329 9x+17.998。從圖中可以看出內毒素組在ACH(1、10和100 μmol/L)對肺動脈的舒張反應均低于正常組。這也證實了圖 1和表 3中得到的結果。
表3
不同濃度ACH時M3受體的a值
圖1
不同濃度達非那新繪制的量效曲線圖
圖2
Lineweaver-Burk作圖法
四 不同濃度的達非那新的直線回歸圖
從達非那新的量效曲線上可以發現達非那新10、1和0.1 μmol/L位于量效曲線較陡的部分，對這三個劑量進行直線回歸作圖(圖 3)，分別求得相應的斜率為：Knach1=-0.024 4；Knach10=-0.034 8; Knach100=-0.107 7; Klach1=-0.008 8, Klach10=-0.027 5; Klach100=-0.085 5。斜率的絕對值可以體現出達非那新的效能，從結果中可以看出相同濃度的ACH的斜率內毒素組均小于正常組，表明在內毒素組達非那新(M3受體)拮抗劑的效能小于正常組。這也進一步說明內毒素組M3受體內在活性低于正常組。
圖3
不同濃度達非那新的直線回歸圖
討論
感染性休克在臨床上主要表現為體循環阻力下降，肺循環阻力增高。肺臟是最易受累的器官，休克時表現為高壓、高阻[6-7]。感染性休克誘發急性肺損傷的發病機制復雜且尚未完全明確，探討其可能的發病機制有利于尋求有效的治療措施[8]。感染性休克后肺動脈內皮細胞結構受到破壞，內皮依賴性舒張反應受到抑制[2]，內毒素損傷血管內皮細胞后，抑制iNOS的表達，引起內皮源性NO的減少，使血管收縮性增強[9]。從而導致了肺動脈高壓。已有研究證實，在ACH誘發的血管調節機制中，當ACH作用于血管平滑肌上的M受體時產生收縮反應，當ACH作用于血管內皮上的M受體時，則產生內皮源性血管舒張因子NO, 從而使血管舒張[10]。內毒素休克后，ACH大量釋放，但內皮細胞中的M受體數量減少，影響NO的生成，ACH對肺血管內皮依賴性舒張抑制；同時，內毒素致肺血管平滑肌上M受體密度上調，ACH轉而通過直接刺激血管平滑肌上的M受體產生血管收縮作用，使肺循環阻力的增高[11]。毒蕈堿型乙酰膽堿受體家族是由五個(M1-M5)亞型組成。存在于大多數血管床中，毒蕈堿受體激活通過血管內皮細胞釋放血管擴張劑導致血管舒張[12]。Attinà等[3]的研究發現M3受體亞型介導了肺動脈對ACH的舒張反應。佟冬怡等[10]在兔肺動脈離體試驗中發現，應用大劑量長托寧能逆轉內毒素休克兔肺動脈對ACH的舒張反應的降低。長托寧是一種新型抗膽堿能藥物，其選擇性阻斷M1、M3受體。所以感染性休克時肺動脈高壓有可能是由于內毒素造成肺動脈內皮的M3受體內在活性降低從而使M3受體介導的舒張反應降低造成的。本研究通過觀察感染性休克時M3受體活性的改變探討感染性休克肺動脈血管反應性改變的機制，以解釋感染性休克時肺動脈高壓的形成機制, 并為臨床感染性休克的治療提供依據。
本研究結果顯示，內毒素減弱了肺動脈對ACH的舒張反應，而對PE的收縮反應沒有影響，這表明我們的內毒素孵育模型是成功的。從表 1可以知道，內毒素使肺動脈對ACH的舒張反應顯著降低，在加入M3受體特異性阻斷劑達非那新(100、10、1和0.1 μmol/L)后正常組和內毒素組肺動脈對ACH的舒張反應均降低，表明M3受體亞型介導了內毒素使ACH舒張反應的降低。但從圖 1結果可知，相同濃度的ACH下對內毒素組產生的舒張反應低于正常組。并且從圖 2和圖 3還可以知道，在內毒素的作用下M3受體的親和力明顯降低。根據達非那新對不同濃度ACH(1、10和100 μmol/L)反應得出的EC50值，從EC50值得知相同濃度的ACH下內毒素組的EC50值要明顯大于正常組。這說明內毒素組M3受體親和力與正常組相比明顯降低。而造成親和力變化主要有兩方面原因：一方面是受體的數量發生了變化，一方面是受體的內在活性發生了變化。M3受體是一種蛋白質，其合成需要一定時間，本試驗中內毒素僅僅作用了4 h，所以數量上的變化可能性極小。從表 3可以發現，M3受體在內毒素作用下其內在活性a值顯著降低。因此推斷內毒素可以使M3受體的內在活性顯著降低，從而引起肺動脈在內毒素作用下ACH反應的降低并導致肺動脈高壓。
綜上所述，M3受體亞型介導了內毒素時肺動脈舒張反應減低，并且內毒素使M3受體亞型內在活性的減低可能是肺動脈舒張反應降低的作用機制之一。感染性休克時肺動脈高壓其機制與M3受體活性改變使肺動脈舒張反應降低有關。
