引用本文： 姚倫凱, 柳廣南, 黃斯明, 李文濤, 黎雨. 煙草煙霧暴露對肺腺癌患者外周血HDAC2、IL-8和TNF-α表達的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(4): 361-364. doi: 10.7507/1671-6205.2016085 復制
肺癌已經成為我國死亡率最高的惡性腫瘤。雖然目前對肺癌的診治有了很大的進步，但肺癌患者的5年生存率仍然很低，如何改善肺癌患者預后是臨床所面臨的難題。在肺癌中，肺腺癌近年發病率上升最為明顯，在每年新增的肺癌中肺腺癌約占40%以上[1]，而且預后效果遠低于其他類型肺癌[2]。有研究認為炎癥反應是影響肺癌患者預后的重要因素，全身炎癥反應越強的肺癌患者預后越差[3]。以往的研究表明煙草煙霧暴露可以使肺腺癌A549細胞中的組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)表達下調，白細胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)上調，增強炎癥反應[4]。故本研究以肺腺癌為研究對象，檢測肺腺癌患者外周血HDAC2、IL-8、 TNF-α的表達情況，探討煙草煙霧暴露及煙草煙霧暴露合并慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)對其表達的影響，旨在為改善肺腺癌患者的預后提供參考。
對象與方法
一 對象
收集廣西醫科大學第一附屬醫院和附屬腫瘤醫院2014年4月至2015年3月術后病理確診為肺腺癌的患者73例，男47例，女26例；TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期20例，Ⅲ期32例(IASLC國際肺癌分期第7版[5])；年齡37~79歲，中位年齡63歲；術前均行肺功能檢查。收集同期無煙草煙霧暴露無慢阻肺的健康志愿者14例，男8例，女6例；年齡25~74歲，中位年齡52歲。抽取各組晨起空腹外周靜脈血5 mL，3 mL于干燥管中，用于分離血清；2 mL于檸檬酸鈉抗凝管中，用于外周血單核細胞(PBMCs)的RNA提取。采血均經受試者知情同意。
二 材料
RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)，HDAC2、IL-8、TNF-α、β-actin引物(上海生工生物工程有限公司)，SYBR Green Master[寶生物工程(大連)有限公司]，IL-8、TNF-α ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。
三 方法
1．分組：根據有無煙草煙霧暴露及肺功能進行分組：正常對照組(A組，14例)；無煙草煙霧暴露無慢阻肺肺腺癌組(B組，19例)；煙草煙霧暴露無慢阻肺肺腺癌組(C組，33例)；煙草煙霧暴露合并慢阻肺肺腺癌組(D組，21例)。各肺腺癌組均未曾接受化療、放療及分子靶向等治療。將累積吸煙大于100支以及每周至少有1 d以上(超過15 min/d)吸入煙草燃燒產生的煙霧大于3年者定義為煙草煙霧暴露[6]。根據肺功能對合并慢阻肺患者進行分組，符合慢阻肺疾病診斷標準。
2．實時熒光定量PCR檢測各組PBMCs中HDAC2 mRNA、IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的表達：采用總RNA提取試劑盒說明的方法提取PBMCs中RNA，按照逆轉錄試劑盒的操作步驟進行cDNA合成，然后按照實時熒光定量PCR擴增試劑盒說明進行實時熒光定量PCR分析。引物序列：HDAC2上游引物為5′-CAATCTAACTGTCAAAGGTCATGC-3′，下游引物為5′-TGAAGTCTGGTCCAAAATACTCAA-3′；IL-8上游引物為5′-ACACTGCGCCAACACAGAA ATTA-3′，下游引物為5′-TTTGCTTGAAGTTTCACTG GCATC-3′；TNF-α上游引物為5′-GTGACAAGCCT GTAGCCCATGTT-3′，下游引物為5′-TTATCTCTCA GCTCCACGCCATTA-3′；β-actin上游引物為5′-TGG CACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物為5′-CTAAGT AGTCCGCCTAGAAGCA-3′。擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環。擴增結束后計算機分析CT值，用2-△△Ct值計算基因的相對表達量。
3．ELISA檢測各組血清IL-8、TNF-α的含量：采3 mL外周靜脈血于干燥管中，室溫血液自然凝固10~20 min，離心3 000 r/min×10 min，收集上清，于-80 ℃冰箱保存備用。用ELISA試劑盒檢測各組外周血清IL-8和TNF-α的濃度，檢測方法均嚴格參照說明書進行，各組結果重復3次，取平均值。
四 統計學處理
使用SPSS 16.0軟件對結果進行統計學分析。計量資料用x±s表示，兩組間比較采用成組設計t檢驗，多組間比較采用方差分析，方差不齊時用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 實時熒光PCR檢測結果
與A組比較，B組PBMCs中HDAC2 mRNA的表達差異無統計學意義(P＞0.05)，C組、D組PBMCs中HDAC2 mRNA的表達均顯著下調(P＜0.05)，其中D組下調最明顯；與B組比較，C組、D組PBMCs中HDAC2 mRNA的表達均顯著下調(P＜0.05)。與A組比較，各肺腺癌組PBMCs中IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的表達均顯著上調(P＜0.05)，其D組上調最明顯，B組上調程度最低；與B組比較，C組、D組均顯著上調(P＜0.05)。結果見表 1。肺腺癌患者PBMCs中HDAC2 mRNA、IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的表達在性別、年齡方面的差異均無統計學意義(P＞0.05)；HDAC2 mRNA在TNM分期方面差異無統計學意義(P＞0.05)，IL-8 mRNA、TNF-α mRNA在肺腺癌Ⅲ期患者PBMCs中的表達均較Ⅰ、Ⅱ期高(P＜0.05)，Ⅰ期與Ⅱ期比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見表 2。
表1
各組PBMCs中HDAC2 mRNA、IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的相對表達量(x±s)
表2
PBMCs中HDAC2 mRNA、IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的相對表達與性別、年齡及TNM分期的關系(x±s)
二 ELISA檢測結果
與A組比較，各肺腺癌組外周血清中IL-8、TNF-α的濃度均顯著增高(P＜0.05)，其中D組增高最明顯，B組增高最低；與B組比較，IL-8、TNF-α在C組、D組的濃度均顯著增高(P＜0.05)。結果見表 3。肺腺癌患者外周靜脈血清中IL-8、TNF-α的表達在性別、年齡方面的含量差異均無統計學意義(P＞0.05)；IL-8、TNF-α在Ⅲ期患者外周靜脈血清中的含量均較Ⅰ、Ⅱ期高(P＜0.05)，Ⅰ期與Ⅱ期比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見表 4。
表3
各組外周血清IL-8、TNF-α的含量(pg/mL，x±s)
表4
外周血清中IL-8、TNF-α的含量與性別、年齡及TNM分期的關系(pg/mL，x±s)
討論
HDAC2屬于組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的一個亞型，在煙草煙霧及有害顆粒的氧化應激作用下活性明顯降低，可促使核因子κB(NF-κB)的活化，使炎癥因子如IL-8、TNF-α等表達增強，在慢阻肺患者的炎癥反應調控過程中發揮重要的作用[7-8]。Ito等[9]發現HDAC2在煙草煙霧暴露者肺組織及肺泡灌洗液巨噬細胞中的表達下調，合并慢阻肺者表達下調最明顯。陳延偉等[10]對慢阻肺患者外周血HDAC活性的研究也發現類似的現象，認為HDAC活性降低主要與吸煙有關。吸煙是肺癌發生的重要危險因素[11]，盡管研究認為肺腺癌的發生與吸煙的相關性不高，但在臨床上有煙草煙霧暴露史的肺腺癌患者并不少見。肺腺癌患者外周血中HDAC2的表達情況以及與炎癥因子IL-8、TNF-α之間的關系如何，值得深入研究。
本研究發現無煙草煙霧暴露無慢阻肺肺腺癌組PBMCs中HDAC2的表達與正常對照組相比無明顯差異，而煙草煙霧暴露無慢阻肺組、煙草煙霧暴露合并慢阻肺組PBMCs中HDAC2的表達均下調，其中煙草煙霧暴露合并慢阻肺肺腺癌組下調最明顯。這一結果表明煙草煙霧暴露對肺腺癌患者PBMCs中HDAC2的表達有下調作用，合并慢阻肺者下調更明顯，與Ito等[9]對肺組織及肺泡灌洗液巨噬細胞的研究結果變化趨勢相一致。而IL-8、TNF-α在肺腺癌患者PBMCs中的表達以及外周血清中的濃度均較正常對照組高，且有煙草煙霧暴露組較無煙草煙霧暴露組高，合并慢阻肺組上調程度最高，提示煙草煙霧暴露對肺腺癌患者的炎癥反應有促進作用，合并慢阻肺者炎癥反應更強烈。因此，我們認為煙草煙霧暴露(無論有無合并慢阻肺)導致肺腺癌患者外周血中IL-8、TNF-α的上調，可能是通過下調HDAC2從而促使NF-κB的活化來實現的，因活化的NF-κB核定位信息暴露，對炎癥因子的表達和釋放有促進作用。IL-8對中性粒細胞有趨化作用，在炎癥反應中發揮重要作用，IL-8的過表達可加速腫瘤細胞的侵襲和轉移[12]；TNF-α是免疫調節的重要因子，適量表達是機體保護反應所必需的，但過量表達可加速惡液質的發生，對肺癌的發生發展及轉移有促進作用[13]。我們的研究也證實在Ⅲ期肺腺癌患者外周血中IL-8、TNF-α的表達均高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，提示肺癌晚期患者的炎癥反應強于早期患者。有研究指出肺癌患者繼續吸煙和/或合并慢阻肺將增加死亡率和復發率[14-15]。因此，我們認為煙草煙霧暴露導致肺腺癌患者外周血HDAC2的低表達以及IL-8、TNF-α的過表達對肺腺癌患者的惡性進展有促進作用。在煙草煙霧暴露合并慢阻肺肺腺癌患者外周血中，HDAC2、IL-8、TNF-α的變化程度尤為明顯，表明合并慢阻肺的患者全身炎癥反應更強烈。對肺癌合并慢阻肺的患者，秦茵茵等[16]建議在抗腫瘤治療的同時規律吸入表面糖皮質激素對改善患者生活質量預后有重要意義。
綜上所述，煙草煙霧暴露是增加肺腺癌患者炎癥反應的重要因素，合并慢阻肺的患者炎癥反應更明顯，可能與HDAC2表達下調有關。通過本研究，我們認為避免煙草煙霧暴露或上調外周血HDAC2的活性在一定程度上可以減輕煙草煙霧暴露肺腺癌患者(無論有無合并慢阻肺)的炎癥反應，對改善肺腺癌患者的預后有一定的意義。
肺癌已經成為我國死亡率最高的惡性腫瘤。雖然目前對肺癌的診治有了很大的進步，但肺癌患者的5年生存率仍然很低，如何改善肺癌患者預后是臨床所面臨的難題。在肺癌中，肺腺癌近年發病率上升最為明顯，在每年新增的肺癌中肺腺癌約占40%以上[1]，而且預后效果遠低于其他類型肺癌[2]。有研究認為炎癥反應是影響肺癌患者預后的重要因素，全身炎癥反應越強的肺癌患者預后越差[3]。以往的研究表明煙草煙霧暴露可以使肺腺癌A549細胞中的組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)表達下調，白細胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)上調，增強炎癥反應[4]。故本研究以肺腺癌為研究對象，檢測肺腺癌患者外周血HDAC2、IL-8、 TNF-α的表達情況，探討煙草煙霧暴露及煙草煙霧暴露合并慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)對其表達的影響，旨在為改善肺腺癌患者的預后提供參考。
對象與方法
一 對象
收集廣西醫科大學第一附屬醫院和附屬腫瘤醫院2014年4月至2015年3月術后病理確診為肺腺癌的患者73例，男47例，女26例；TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期20例，Ⅲ期32例(IASLC國際肺癌分期第7版[5])；年齡37~79歲，中位年齡63歲；術前均行肺功能檢查。收集同期無煙草煙霧暴露無慢阻肺的健康志愿者14例，男8例，女6例；年齡25~74歲，中位年齡52歲。抽取各組晨起空腹外周靜脈血5 mL，3 mL于干燥管中，用于分離血清；2 mL于檸檬酸鈉抗凝管中，用于外周血單核細胞(PBMCs)的RNA提取。采血均經受試者知情同意。
二 材料
RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)，HDAC2、IL-8、TNF-α、β-actin引物(上海生工生物工程有限公司)，SYBR Green Master[寶生物工程(大連)有限公司]，IL-8、TNF-α ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。
三 方法
1．分組：根據有無煙草煙霧暴露及肺功能進行分組：正常對照組(A組，14例)；無煙草煙霧暴露無慢阻肺肺腺癌組(B組，19例)；煙草煙霧暴露無慢阻肺肺腺癌組(C組，33例)；煙草煙霧暴露合并慢阻肺肺腺癌組(D組，21例)。各肺腺癌組均未曾接受化療、放療及分子靶向等治療。將累積吸煙大于100支以及每周至少有1 d以上(超過15 min/d)吸入煙草燃燒產生的煙霧大于3年者定義為煙草煙霧暴露[6]。根據肺功能對合并慢阻肺患者進行分組，符合慢阻肺疾病診斷標準。
2．實時熒光定量PCR檢測各組PBMCs中HDAC2 mRNA、IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的表達：采用總RNA提取試劑盒說明的方法提取PBMCs中RNA，按照逆轉錄試劑盒的操作步驟進行cDNA合成，然后按照實時熒光定量PCR擴增試劑盒說明進行實時熒光定量PCR分析。引物序列：HDAC2上游引物為5′-CAATCTAACTGTCAAAGGTCATGC-3′，下游引物為5′-TGAAGTCTGGTCCAAAATACTCAA-3′；IL-8上游引物為5′-ACACTGCGCCAACACAGAA ATTA-3′，下游引物為5′-TTTGCTTGAAGTTTCACTG GCATC-3′；TNF-α上游引物為5′-GTGACAAGCCT GTAGCCCATGTT-3′，下游引物為5′-TTATCTCTCA GCTCCACGCCATTA-3′；β-actin上游引物為5′-TGG CACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物為5′-CTAAGT AGTCCGCCTAGAAGCA-3′。擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環。擴增結束后計算機分析CT值，用2-△△Ct值計算基因的相對表達量。
3．ELISA檢測各組血清IL-8、TNF-α的含量：采3 mL外周靜脈血于干燥管中，室溫血液自然凝固10~20 min，離心3 000 r/min×10 min，收集上清，于-80 ℃冰箱保存備用。用ELISA試劑盒檢測各組外周血清IL-8和TNF-α的濃度，檢測方法均嚴格參照說明書進行，各組結果重復3次，取平均值。
四 統計學處理
使用SPSS 16.0軟件對結果進行統計學分析。計量資料用x±s表示，兩組間比較采用成組設計t檢驗，多組間比較采用方差分析，方差不齊時用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 實時熒光PCR檢測結果
與A組比較，B組PBMCs中HDAC2 mRNA的表達差異無統計學意義(P＞0.05)，C組、D組PBMCs中HDAC2 mRNA的表達均顯著下調(P＜0.05)，其中D組下調最明顯；與B組比較，C組、D組PBMCs中HDAC2 mRNA的表達均顯著下調(P＜0.05)。與A組比較，各肺腺癌組PBMCs中IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的表達均顯著上調(P＜0.05)，其D組上調最明顯，B組上調程度最低；與B組比較，C組、D組均顯著上調(P＜0.05)。結果見表 1。肺腺癌患者PBMCs中HDAC2 mRNA、IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的表達在性別、年齡方面的差異均無統計學意義(P＞0.05)；HDAC2 mRNA在TNM分期方面差異無統計學意義(P＞0.05)，IL-8 mRNA、TNF-α mRNA在肺腺癌Ⅲ期患者PBMCs中的表達均較Ⅰ、Ⅱ期高(P＜0.05)，Ⅰ期與Ⅱ期比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見表 2。
表1
各組PBMCs中HDAC2 mRNA、IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的相對表達量(x±s)
表2
PBMCs中HDAC2 mRNA、IL-8 mRNA、TNF-α mRNA的相對表達與性別、年齡及TNM分期的關系(x±s)
二 ELISA檢測結果
與A組比較，各肺腺癌組外周血清中IL-8、TNF-α的濃度均顯著增高(P＜0.05)，其中D組增高最明顯，B組增高最低；與B組比較，IL-8、TNF-α在C組、D組的濃度均顯著增高(P＜0.05)。結果見表 3。肺腺癌患者外周靜脈血清中IL-8、TNF-α的表達在性別、年齡方面的含量差異均無統計學意義(P＞0.05)；IL-8、TNF-α在Ⅲ期患者外周靜脈血清中的含量均較Ⅰ、Ⅱ期高(P＜0.05)，Ⅰ期與Ⅱ期比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見表 4。
表3
各組外周血清IL-8、TNF-α的含量(pg/mL，x±s)
表4
外周血清中IL-8、TNF-α的含量與性別、年齡及TNM分期的關系(pg/mL，x±s)
討論
HDAC2屬于組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的一個亞型，在煙草煙霧及有害顆粒的氧化應激作用下活性明顯降低，可促使核因子κB(NF-κB)的活化，使炎癥因子如IL-8、TNF-α等表達增強，在慢阻肺患者的炎癥反應調控過程中發揮重要的作用[7-8]。Ito等[9]發現HDAC2在煙草煙霧暴露者肺組織及肺泡灌洗液巨噬細胞中的表達下調，合并慢阻肺者表達下調最明顯。陳延偉等[10]對慢阻肺患者外周血HDAC活性的研究也發現類似的現象，認為HDAC活性降低主要與吸煙有關。吸煙是肺癌發生的重要危險因素[11]，盡管研究認為肺腺癌的發生與吸煙的相關性不高，但在臨床上有煙草煙霧暴露史的肺腺癌患者并不少見。肺腺癌患者外周血中HDAC2的表達情況以及與炎癥因子IL-8、TNF-α之間的關系如何，值得深入研究。
本研究發現無煙草煙霧暴露無慢阻肺肺腺癌組PBMCs中HDAC2的表達與正常對照組相比無明顯差異，而煙草煙霧暴露無慢阻肺組、煙草煙霧暴露合并慢阻肺組PBMCs中HDAC2的表達均下調，其中煙草煙霧暴露合并慢阻肺肺腺癌組下調最明顯。這一結果表明煙草煙霧暴露對肺腺癌患者PBMCs中HDAC2的表達有下調作用，合并慢阻肺者下調更明顯，與Ito等[9]對肺組織及肺泡灌洗液巨噬細胞的研究結果變化趨勢相一致。而IL-8、TNF-α在肺腺癌患者PBMCs中的表達以及外周血清中的濃度均較正常對照組高，且有煙草煙霧暴露組較無煙草煙霧暴露組高，合并慢阻肺組上調程度最高，提示煙草煙霧暴露對肺腺癌患者的炎癥反應有促進作用，合并慢阻肺者炎癥反應更強烈。因此，我們認為煙草煙霧暴露(無論有無合并慢阻肺)導致肺腺癌患者外周血中IL-8、TNF-α的上調，可能是通過下調HDAC2從而促使NF-κB的活化來實現的，因活化的NF-κB核定位信息暴露，對炎癥因子的表達和釋放有促進作用。IL-8對中性粒細胞有趨化作用，在炎癥反應中發揮重要作用，IL-8的過表達可加速腫瘤細胞的侵襲和轉移[12]；TNF-α是免疫調節的重要因子，適量表達是機體保護反應所必需的，但過量表達可加速惡液質的發生，對肺癌的發生發展及轉移有促進作用[13]。我們的研究也證實在Ⅲ期肺腺癌患者外周血中IL-8、TNF-α的表達均高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，提示肺癌晚期患者的炎癥反應強于早期患者。有研究指出肺癌患者繼續吸煙和/或合并慢阻肺將增加死亡率和復發率[14-15]。因此，我們認為煙草煙霧暴露導致肺腺癌患者外周血HDAC2的低表達以及IL-8、TNF-α的過表達對肺腺癌患者的惡性進展有促進作用。在煙草煙霧暴露合并慢阻肺肺腺癌患者外周血中，HDAC2、IL-8、TNF-α的變化程度尤為明顯，表明合并慢阻肺的患者全身炎癥反應更強烈。對肺癌合并慢阻肺的患者，秦茵茵等[16]建議在抗腫瘤治療的同時規律吸入表面糖皮質激素對改善患者生活質量預后有重要意義。
綜上所述，煙草煙霧暴露是增加肺腺癌患者炎癥反應的重要因素，合并慢阻肺的患者炎癥反應更明顯，可能與HDAC2表達下調有關。通過本研究，我們認為避免煙草煙霧暴露或上調外周血HDAC2的活性在一定程度上可以減輕煙草煙霧暴露肺腺癌患者(無論有無合并慢阻肺)的炎癥反應，對改善肺腺癌患者的預后有一定的意義。
