引用本文： 黨亞潔, 李瀟, 鄭明睿, 劉海霞, 周霞, 金先橋. 锝99m標記抗曲霉單克隆抗體的制備及在小鼠體內的分布. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(4): 351-355. doi: 10.7507/1671-6205.2016083 復制
煙曲霉(Aspergillus fumigatus，Af)是一種腐生絲狀真菌，其孢子很小，極易被吸入到呼吸道內，可以引起從無癥狀定植到過敏性疾病和侵襲性感染等肺部多種疾病[1-3]。早期精確診斷是及時應用抗真菌藥物治療、改善臨床預后、降低死亡率的前提。然而，曲霉的檢測仍是臨床工作中面臨的一大難題。目前臨床上檢測曲霉感染通常依靠痰培養和血培養，但是痰培養容易污染，血培養陽性的幾率很小[4]。因此，及時開發出快速、特異、無創且易于操作的檢測技術是目前檢測曲霉診斷研究需要解決的問題。
Mab-WF-AF-1是一種商業化的鼠抗曲霉單克隆抗體，它由煙曲霉菌胞壁提取物免疫小鼠制備而成[5]。該抗體特異性識別曲霉菌屬，如煙曲霉、黑曲霉、黃曲霉，與曲霉菌胞壁及隔膜強烈反應。此抗體特異性較強，與常見的真菌生物等沒有交叉反應[5]。國外研究發現該抗體在應用免疫組化技術檢測曲霉感染中有可靠的診斷效果[6]。國內學者周曉謙等[7]、李原等[8]用免疫組化方法，Mab-WF-AF-1作為一抗，檢測曲霉性鼻竇炎及以曲霉為主的鼻竇真菌球感染，也驗證了該抗體在鑒定曲霉中具有較好的特異性。
放射性核素顯像技術已廣泛用于醫學領域，該技術敏感性高，特異性強，無創傷，準確性好，在腫瘤、炎癥的檢測和治療以及臟器功能評價等許多方面顯示良好的應用價值[9]。本研究采用放射性核素锝99m(99mTc)標記抗曲霉的單克隆抗體，探索標記物的標記率和穩定性，以及標記后免疫活性，并觀察它在正常小鼠體內的生物分布特性，以期為應用锝標記的抗曲霉單抗檢測曲霉感染奠定實驗基礎。
材料與方法
一 材料
1．實驗動物：昆明小鼠，雌性，體重(25±1) g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。實驗前1周適應性飼養。
2．主要試劑：Na99TcmO4淋洗液(上海欣科醫藥公司)，抗曲霉單克隆抗體WF-AF-1(英國AbD Serotec公司)，NHS-MAG3粉末(上海中科院)，Sephadex G-30柱(美國Amersham公司)，Whatman 1號薄層層析紙(英國Whatman公司)，其余試劑為國產分析純試劑。
3．菌株：煙曲霉菌株來源于臨床上煙曲霉感染患者臨床痰液標本，經菌種鑒定后的保存菌株。白假絲酵母菌和金黃色葡萄菌為上海市第一人民醫院檢驗科贈送。
二 方法
1．煙曲霉孢子懸液的制備：參考文獻[10-11]的方法，將煙曲霉菌株接種于PDA培養基上，37 ℃培養5 d，用含0.1%的吐溫20的生理鹽水10 mL沖洗培養基，收集菌液，用8層無菌紗布過濾以除去菌絲，血球計數板上計數，生理鹽水調整孢子懸液濃度為1×107 cfu/mL，保存于4 ℃冰箱備用。
2．標記物的制備：參照文獻[12-13]的標記方法，抗體先與NHS-MAG3偶聯，再標記99mTc。偶聯前將鼠抗曲霉的單克隆抗體Mab-WF-AF-1置于超濾離心管中，離心去除疊氮化鈉。取10 μg蛋白溶于50 μL 0.3 mol/L HEPES緩沖液(pH值8~8.5)，加入雙功能聯接劑NHS-MAG3粉末，混勻后室溫反應1 h，或4 ℃反應過夜。將所得的偶聯物溶液轉移到微量超濾離心柱中，加入0.25 mol/L醋酸銨，4 ℃離心機離心10 000 r/min，5 min，離心后棄下管液體，去除游離NHS-MAG3，重復1次，最后用0.25 mol/L醋酸銨將終體積調到60 μL。上述溶液中加入20 μL的50 mg/mL酒石酸緩沖液(保證醋酸銨和酒石酸溶液的體積比為3∶1)，加入74 MBq的新鮮淋洗的99mTcO4，震蕩后加入8 μL SnCl2溶液，搖勻后靜置反應1 h，完成標記。用薄層層析法檢測標記率和放化純度，并檢測標記物在PBS和血清中的穩定性。
3．標記抗體免疫活性測定：(1)體外結合實驗：取1×107 cfu/mL的煙曲霉孢子1 mL，加入10 μL標記物(含0.1 μg蛋白)。4 ℃下振蕩反應10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h，6 000 r/min離心10 min，棄上層溶液，然后用0.9%的Nacl溶液洗3次，γ計數器檢測各管沉淀物的放射性計數，計算結合率。每個時間點3個復管。(2)對比實驗：1×107 cfu/mL的金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌懸液各取1 mL，與10 μL標記物4 ℃反應1 h，如上方法計算結合率。兩種菌各3個復管。(3)競爭抑制實驗：3個復管，每管取1 mL，1×107 cfu/mL的煙曲霉孢子，加入50倍過量的未標記抗體。4 ℃下振蕩反應1 h；繼續加入10 μL標記物，孵育1 h。如上方法檢測各管放射性計數，計算結合率。
4．正常小鼠體內生物分布：雌性昆明小鼠尾靜脈注射3.7 MBq標記物，注射后40 min、2 h、4 h、7 h眼球采血處死小鼠，取心臟、肺、肝、脾、腎、胃、小腸，各器官稱重后測放射性計數，經衰變校正后計算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。
三 統計學處理
數據處理使用SPSS 19.0統計軟件包。計量數據用x±s表示。組間均數比較采用Student t檢驗，相關性采用Pearson’s相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 標記率
薄層層析法測定標記率，原點為標記產物，前沿為游離锝，99mTc膠體含量很少，在原點，可以忽略。結果如圖 1所示，60 min時標記率達到(98.2±0.7)%。由于標記效率達到95%以上，不需要進一步純化。
圖1
99mTc標記的抗曲霉單克隆抗體Mab-WF-AF-1(99mTc-WF-AF-1)的標記效率
二 穩定性
標記產物的穩定性結果見圖 2。穩定性實驗表明99mTc-WF-AF-1在PBS和血清中保持較好的穩定性。
圖2
99mTc-WF-AF-1在PBS和血清中的穩定性
三 體外實驗
1．體外結合實驗：標記物在各個時間與煙曲霉孢子的結合率如圖 3所示。標記物與煙曲霉孢子混合后迅速結合，在1 h左右達到峰值(10.32±0.21)%，之后隨時間的延長略有下降，但基本穩定在9%以上。
圖3
99mTc-WF-AF-1在各個孵育時間的結合率
2．對比試驗：標記物與金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌的結合率顯著低于其與煙曲霉孢子的結合率[(1.88±0.45)%和(1.67±0.29)%比(10.32±0.21)%，P＜0.05]，結果見圖 4。對比實驗表明抗體標記后仍然特異地與煙曲霉孢子抗原結合。
圖4
99mTc-WF-AF-1在體外與煙曲霉孢子、白假絲酵母菌、金黃色葡萄球菌孵育1 h的結合率
*
3．競爭抑制實驗：加入過量的未標記抗體與煙曲霉孢子孵育后，再加入的標記產物與煙曲霉孢子的結合明顯受到抑制[(2.57±0.36)%比(10.32±0.21)%，P＜0.05]，進一步證實了標記抗體仍然保持良好的免疫活性。結果見圖 5。
圖5
與過量未標記抗體孵育1 h后99mTc-WF-AF-1與煙曲霉孢子的結合率
四 生物分布
99mTc-WF-A-F-1在健康小鼠體內生物分布結果見圖 6。隨時間的延長血池放射性逐漸降低，注射后40 min放射性攝取在小鼠體內為2.51 %ID/g，7 h時降為0.53 %ID/g左右。肝脾腎對標記物的攝取始終較高，提示標記物可能主要通過網狀內皮系統和腎臟代謝。
圖6
99mTc-WF-AF-1在正常小鼠體內的生物分布
討論
煙曲霉的孢子直徑很小，約為2～3 μm，極易被吸入到下呼吸道。正常人吸入的孢子很快被機體清除，并不會引起感染或者過敏性炎癥。在免疫缺陷或者宿主防御功能受損的患者，煙曲霉孢子易定植于其氣道內引起氣道黏膜多種免疫功能狀態的改變，甚至發芽引起感染性疾病。流行病學研究表明，由黃曲霉、黑曲霉、構巢曲霉和土曲霉引起的肺部疾病在不斷增加[14-15]。我們前期研究發現，煙曲霉暴露能夠上調表皮生長因子(EGF)和黏蛋白MUC5AC的表達[16]，加重氣道炎癥反應和氣道重塑[17]，前列腺素D2及相關受體CRTH2在煙曲霉引起的哮喘加重中發揮重要作用[18]，并且氣道高反應性及嗜酸粒細胞炎癥的加重與血清總IgE水平密切相關[19]。
本實驗制備的99mTc-WF-AF-1標記效率達到95%以上，因此不需要進一步純化。室溫下在PBS液和血清中的穩定性較好。標記物在體外與金黃色葡萄球菌和白假絲酵母菌的結合實驗表明，標記抗體能特異地與煙曲霉孢子結合，抗體經過標記后仍然保持較高的免疫活性。競爭抑制實驗進一步證實了標記抗體與曲霉孢子結合的特異性，為進一步研究標記物在體內特異檢測煙曲霉的可行性奠定了基礎。生物分布實驗表明，標記物主要分布在肝、脾、腎和血液，胃腸攝取較少。隨時間的延長血池放射性逐漸降低，注射后40 min放射性攝取在小鼠體內為2.51 %ID/g，7 h時降為0.53 %ID/g。注射后1 h到7 h腎臟的攝取從9.24 %ID/g降到2.64 %ID/g。肝脾放射性濃聚的原因可能為網狀內皮系統對抗原抗體復合物的吞噬[20-22]所致。
Mab-WF-AF-1是IgM型抗體，分子量較大，約為950 kD，有10個抗原結合位點，與IgG相比有較高的抗原結合力。另外，鼠IgM和IgG的血清半衰期分別為2 d和8 d[23]。因此，推測IgM型抗體優于IgG型。國外有學者認為IgM抗體片段血液清除比完整抗體快[24]，也有學者認為分子量大小或許并不是血液清除的主要因素[21]，因為他們發現IgM單體的清除更類似于五聚體的清除，而不像IgG抗體的清除。因此，后續實驗需要進一步探究完整抗體、單體、片段的生物分布特征，以及標記物的顯像研究，并檢測其在動物模型中的應用，如肺曲霉感染、氣道曲霉定植等模型。
綜上所述，本實驗初步探索了99mTc標記Mab-WF-AF-1的制備方法和體外特性，以及在正常小鼠體內的生物分布特點，為今后進一步研究應用放射性核素標記Mab-WF-AF-1檢測肺內曲霉感染及放射治療提供了實驗基礎，同時也為利用放射核素示蹤技術檢測其他微生物提供了新思路。
煙曲霉(Aspergillus fumigatus，Af)是一種腐生絲狀真菌，其孢子很小，極易被吸入到呼吸道內，可以引起從無癥狀定植到過敏性疾病和侵襲性感染等肺部多種疾病[1-3]。早期精確診斷是及時應用抗真菌藥物治療、改善臨床預后、降低死亡率的前提。然而，曲霉的檢測仍是臨床工作中面臨的一大難題。目前臨床上檢測曲霉感染通常依靠痰培養和血培養，但是痰培養容易污染，血培養陽性的幾率很小[4]。因此，及時開發出快速、特異、無創且易于操作的檢測技術是目前檢測曲霉診斷研究需要解決的問題。
Mab-WF-AF-1是一種商業化的鼠抗曲霉單克隆抗體，它由煙曲霉菌胞壁提取物免疫小鼠制備而成[5]。該抗體特異性識別曲霉菌屬，如煙曲霉、黑曲霉、黃曲霉，與曲霉菌胞壁及隔膜強烈反應。此抗體特異性較強，與常見的真菌生物等沒有交叉反應[5]。國外研究發現該抗體在應用免疫組化技術檢測曲霉感染中有可靠的診斷效果[6]。國內學者周曉謙等[7]、李原等[8]用免疫組化方法，Mab-WF-AF-1作為一抗，檢測曲霉性鼻竇炎及以曲霉為主的鼻竇真菌球感染，也驗證了該抗體在鑒定曲霉中具有較好的特異性。
放射性核素顯像技術已廣泛用于醫學領域，該技術敏感性高，特異性強，無創傷，準確性好，在腫瘤、炎癥的檢測和治療以及臟器功能評價等許多方面顯示良好的應用價值[9]。本研究采用放射性核素锝99m(99mTc)標記抗曲霉的單克隆抗體，探索標記物的標記率和穩定性，以及標記后免疫活性，并觀察它在正常小鼠體內的生物分布特性，以期為應用锝標記的抗曲霉單抗檢測曲霉感染奠定實驗基礎。
材料與方法
一 材料
1．實驗動物：昆明小鼠，雌性，體重(25±1) g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。實驗前1周適應性飼養。
2．主要試劑：Na99TcmO4淋洗液(上海欣科醫藥公司)，抗曲霉單克隆抗體WF-AF-1(英國AbD Serotec公司)，NHS-MAG3粉末(上海中科院)，Sephadex G-30柱(美國Amersham公司)，Whatman 1號薄層層析紙(英國Whatman公司)，其余試劑為國產分析純試劑。
3．菌株：煙曲霉菌株來源于臨床上煙曲霉感染患者臨床痰液標本，經菌種鑒定后的保存菌株。白假絲酵母菌和金黃色葡萄菌為上海市第一人民醫院檢驗科贈送。
二 方法
1．煙曲霉孢子懸液的制備：參考文獻[10-11]的方法，將煙曲霉菌株接種于PDA培養基上，37 ℃培養5 d，用含0.1%的吐溫20的生理鹽水10 mL沖洗培養基，收集菌液，用8層無菌紗布過濾以除去菌絲，血球計數板上計數，生理鹽水調整孢子懸液濃度為1×107 cfu/mL，保存于4 ℃冰箱備用。
2．標記物的制備：參照文獻[12-13]的標記方法，抗體先與NHS-MAG3偶聯，再標記99mTc。偶聯前將鼠抗曲霉的單克隆抗體Mab-WF-AF-1置于超濾離心管中，離心去除疊氮化鈉。取10 μg蛋白溶于50 μL 0.3 mol/L HEPES緩沖液(pH值8~8.5)，加入雙功能聯接劑NHS-MAG3粉末，混勻后室溫反應1 h，或4 ℃反應過夜。將所得的偶聯物溶液轉移到微量超濾離心柱中，加入0.25 mol/L醋酸銨，4 ℃離心機離心10 000 r/min，5 min，離心后棄下管液體，去除游離NHS-MAG3，重復1次，最后用0.25 mol/L醋酸銨將終體積調到60 μL。上述溶液中加入20 μL的50 mg/mL酒石酸緩沖液(保證醋酸銨和酒石酸溶液的體積比為3∶1)，加入74 MBq的新鮮淋洗的99mTcO4，震蕩后加入8 μL SnCl2溶液，搖勻后靜置反應1 h，完成標記。用薄層層析法檢測標記率和放化純度，并檢測標記物在PBS和血清中的穩定性。
3．標記抗體免疫活性測定：(1)體外結合實驗：取1×107 cfu/mL的煙曲霉孢子1 mL，加入10 μL標記物(含0.1 μg蛋白)。4 ℃下振蕩反應10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h，6 000 r/min離心10 min，棄上層溶液，然后用0.9%的Nacl溶液洗3次，γ計數器檢測各管沉淀物的放射性計數，計算結合率。每個時間點3個復管。(2)對比實驗：1×107 cfu/mL的金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌懸液各取1 mL，與10 μL標記物4 ℃反應1 h，如上方法計算結合率。兩種菌各3個復管。(3)競爭抑制實驗：3個復管，每管取1 mL，1×107 cfu/mL的煙曲霉孢子，加入50倍過量的未標記抗體。4 ℃下振蕩反應1 h；繼續加入10 μL標記物，孵育1 h。如上方法檢測各管放射性計數，計算結合率。
4．正常小鼠體內生物分布：雌性昆明小鼠尾靜脈注射3.7 MBq標記物，注射后40 min、2 h、4 h、7 h眼球采血處死小鼠，取心臟、肺、肝、脾、腎、胃、小腸，各器官稱重后測放射性計數，經衰變校正后計算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。
三 統計學處理
數據處理使用SPSS 19.0統計軟件包。計量數據用x±s表示。組間均數比較采用Student t檢驗，相關性采用Pearson’s相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 標記率
薄層層析法測定標記率，原點為標記產物，前沿為游離锝，99mTc膠體含量很少，在原點，可以忽略。結果如圖 1所示，60 min時標記率達到(98.2±0.7)%。由于標記效率達到95%以上，不需要進一步純化。
圖1
99mTc標記的抗曲霉單克隆抗體Mab-WF-AF-1(99mTc-WF-AF-1)的標記效率
二 穩定性
標記產物的穩定性結果見圖 2。穩定性實驗表明99mTc-WF-AF-1在PBS和血清中保持較好的穩定性。
圖2
99mTc-WF-AF-1在PBS和血清中的穩定性
三 體外實驗
1．體外結合實驗：標記物在各個時間與煙曲霉孢子的結合率如圖 3所示。標記物與煙曲霉孢子混合后迅速結合，在1 h左右達到峰值(10.32±0.21)%，之后隨時間的延長略有下降，但基本穩定在9%以上。
圖3
99mTc-WF-AF-1在各個孵育時間的結合率
2．對比試驗：標記物與金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌的結合率顯著低于其與煙曲霉孢子的結合率[(1.88±0.45)%和(1.67±0.29)%比(10.32±0.21)%，P＜0.05]，結果見圖 4。對比實驗表明抗體標記后仍然特異地與煙曲霉孢子抗原結合。
圖4
99mTc-WF-AF-1在體外與煙曲霉孢子、白假絲酵母菌、金黃色葡萄球菌孵育1 h的結合率
*
3．競爭抑制實驗：加入過量的未標記抗體與煙曲霉孢子孵育后，再加入的標記產物與煙曲霉孢子的結合明顯受到抑制[(2.57±0.36)%比(10.32±0.21)%，P＜0.05]，進一步證實了標記抗體仍然保持良好的免疫活性。結果見圖 5。
圖5
與過量未標記抗體孵育1 h后99mTc-WF-AF-1與煙曲霉孢子的結合率
四 生物分布
99mTc-WF-A-F-1在健康小鼠體內生物分布結果見圖 6。隨時間的延長血池放射性逐漸降低，注射后40 min放射性攝取在小鼠體內為2.51 %ID/g，7 h時降為0.53 %ID/g左右。肝脾腎對標記物的攝取始終較高，提示標記物可能主要通過網狀內皮系統和腎臟代謝。
圖6
99mTc-WF-AF-1在正常小鼠體內的生物分布
討論
煙曲霉的孢子直徑很小，約為2～3 μm，極易被吸入到下呼吸道。正常人吸入的孢子很快被機體清除，并不會引起感染或者過敏性炎癥。在免疫缺陷或者宿主防御功能受損的患者，煙曲霉孢子易定植于其氣道內引起氣道黏膜多種免疫功能狀態的改變，甚至發芽引起感染性疾病。流行病學研究表明，由黃曲霉、黑曲霉、構巢曲霉和土曲霉引起的肺部疾病在不斷增加[14-15]。我們前期研究發現，煙曲霉暴露能夠上調表皮生長因子(EGF)和黏蛋白MUC5AC的表達[16]，加重氣道炎癥反應和氣道重塑[17]，前列腺素D2及相關受體CRTH2在煙曲霉引起的哮喘加重中發揮重要作用[18]，并且氣道高反應性及嗜酸粒細胞炎癥的加重與血清總IgE水平密切相關[19]。
本實驗制備的99mTc-WF-AF-1標記效率達到95%以上，因此不需要進一步純化。室溫下在PBS液和血清中的穩定性較好。標記物在體外與金黃色葡萄球菌和白假絲酵母菌的結合實驗表明，標記抗體能特異地與煙曲霉孢子結合，抗體經過標記后仍然保持較高的免疫活性。競爭抑制實驗進一步證實了標記抗體與曲霉孢子結合的特異性，為進一步研究標記物在體內特異檢測煙曲霉的可行性奠定了基礎。生物分布實驗表明，標記物主要分布在肝、脾、腎和血液，胃腸攝取較少。隨時間的延長血池放射性逐漸降低，注射后40 min放射性攝取在小鼠體內為2.51 %ID/g，7 h時降為0.53 %ID/g。注射后1 h到7 h腎臟的攝取從9.24 %ID/g降到2.64 %ID/g。肝脾放射性濃聚的原因可能為網狀內皮系統對抗原抗體復合物的吞噬[20-22]所致。
Mab-WF-AF-1是IgM型抗體，分子量較大，約為950 kD，有10個抗原結合位點，與IgG相比有較高的抗原結合力。另外，鼠IgM和IgG的血清半衰期分別為2 d和8 d[23]。因此，推測IgM型抗體優于IgG型。國外有學者認為IgM抗體片段血液清除比完整抗體快[24]，也有學者認為分子量大小或許并不是血液清除的主要因素[21]，因為他們發現IgM單體的清除更類似于五聚體的清除，而不像IgG抗體的清除。因此，后續實驗需要進一步探究完整抗體、單體、片段的生物分布特征，以及標記物的顯像研究，并檢測其在動物模型中的應用，如肺曲霉感染、氣道曲霉定植等模型。
綜上所述，本實驗初步探索了99mTc標記Mab-WF-AF-1的制備方法和體外特性，以及在正常小鼠體內的生物分布特點，為今后進一步研究應用放射性核素標記Mab-WF-AF-1檢測肺內曲霉感染及放射治療提供了實驗基礎，同時也為利用放射核素示蹤技術檢測其他微生物提供了新思路。
