引用本文： 李潔, 戴愛國, 胡瑞成, 劉曉燕, 孔春初. 慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中 ATF3 與 ATF4 對 γ-GCS 表達的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(1): 9-14. doi: 10.7507/1671-6205.201606052 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的以持續性氣流受限為特征的疾病，氣流受限進行性發展，與氣道和肺臟對有毒顆粒或氣體的慢性炎性反應增強有關[1]。慢阻肺的發病機制尚未完全明了，目前認為吸入有害顆粒或氣體引起肺內氧化應激是其主要發病機制之一[1]。谷胱甘肽（GSH）是肺內抵御內外源性氧化應激的關鍵抗氧化劑。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是 GSH 合成反應中的限速酶，決定 GSH 生物合成的速率和量，其全酶是由 γ-GCS 重鏈亞基（γ-GCS-HS）和 γ-GCS 輕鏈亞基（γ-GCS-LS）組成的異二聚體，在人類染色體上分別定位于 6p12和 1p21，分子量分別約為 73 kD 和 30 kD[2]。γ-GCS-HS含有所有底物和催化亞基的結合位點，具有全酶的催化功能[3]。我們的多個前期研究已表明γ-GCS可通過促進GSH合成增加，參與局部抗氧化作用[4]。近年來多個研究發現活化轉錄因子 3（ATF3）與活化轉錄因子4（ATF4）的高表達有助于減輕氧化應激反應[5-7]。我室前期已在動物實驗中發現 ATF3 和 ATF4 對抗氧化基因 γ-GCS 的表達起重要作用，在慢阻肺大鼠氧化應激狀態下兩者具有明顯相關關系[8]。本研究擬進一步從臨床角度觀察轉錄因子 ATF3、ATF4 的表達變化以及對抗氧化通路 γ-GCS-HS 表達的影響，進一步探索及明確它們在慢阻肺發病機制中的作用及意義。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
1.1.1 標本來源及選擇標準 收集湖南省腫瘤醫院胸外科 2008 年 12 月至 2009 年 12 月因肺癌行肺葉或肺段切除術者 40 例。所有受試者均知情同意。將符合我國 2007 年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007 年版）》診斷標準并除外腫瘤所致氣道阻塞肺功能異常者歸為慢阻肺組（20 例），其余患者歸為對照組（20 例）。所有患者術前未經抗腫瘤治療（包括分子靶向藥物治療及放化療）并收集以下數據：患者年齡、性別、吸煙指數、肺功能、胸部 X 線片、心電圖、胸部 CT、病檢結果等。排除標準[9-10]：（1）合并其他慢性呼吸系統疾病，如活動性肺結核、支氣管擴張、支氣管哮喘、肺炎、間質性肺疾病、肺栓塞等；（2）合并睡眠呼吸障礙；（3）合并嚴重心腦血管系統、內分泌、肝腎和造血系統疾病；（4）有嚴重的免疫缺陷及免疫系統疾病，如結締組織疾病、痛風等；（5）有精神和心理疾病者或任何影響依從性的因素；（6）合并其他過敏性疾病史及惡性腫瘤疾病。本研究獲得湖南省腫瘤醫院倫理委員會批準。
1.1.2 標本采集 參照文獻[3]取材，取材標本均為遠離肺癌原發病灶 5 cm 以上、肉眼觀察無肺癌浸潤的外周肺組織。取其中一塊以 10% 福爾馬林溶液固定 6 h，常規取材、脫水、石蠟包埋，切片厚約 3 ～ 4 μm，行 HE 染色觀察組織形態學變化，行免疫組化及原位雜交檢測目的蛋白的表達變化。
1.2 方法
1.2.1 原位雜交 （1）寡核苷酸探針：地高辛標記的多相寡核苷酸探針購自武漢博士德生物工程有限公司。ATF3 mRNA 探針針對靶基因序列：① 5 ′ -CAGAACAAGCACCTCTGCCACCGGATGTCCTCTGC-3′；② 5′-TACATGCTCAACCTTCATCGGCCCACGTGTATTGT-3′；③ 5′-TTTATCCAACAGATAAAAGAAGGAACATTGCAGAG-3′。ATF4 mRNA 探針針對靶基因序列：① 5′-GATTGGATGTTGGAGAAAATGGATTTGAAGGAGTT-3′；② 5′-GATGACACTTGTGATCTCTTTGCCCCCCTAGTCCA-3′；③ 5′-AGGTACCGCCAGAAGAAGAGGGCGGAGCAGGAGGC-3′。γ-GCS-HS mRNA 探針針對靶基因序列：① 5′-TGCACATCTACCACGCAGTCAAGGACCGGC-3'；② 5′-ATATTCAGTCCACAAACTGGCAGACAATGA-3'；③ 5′-AGTACACGGAGCATAGACACCATCA-3'。（2）實驗步驟：取臨床肺組織石蠟塊連續切片（5 μm 厚）用原位雜交專用載玻片撈片，65 ℃ 烤片 3 h，常規脫蠟、入水，3% 雙氧水室溫處理 10 min 滅活內源性過氧化物酶，3% 檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化，滴加預雜交液預雜交，地高辛標記核苷酸探針濕盒雜交過夜，封閉，滴加生物素化鼠抗地高辛，鏈酶親和素、生物素復合體（SABC）孵育，滴加生物素化過氧化物酶，經二氨基聯苯胺（DAB）顯色、蘇木素復染后，脫水、透明、封片、拍片。以不含探針的雜交液作陰性對照。顯微顯影系統（日本 Olympus 公司）采集圖像，以胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，隨機選擇內徑為 100～200 μm 的細小支氣管和肺泡區各 3 個不同視野以 JD 病理圖像分析系統（江蘇省捷達科技發展有限公司）作圖像分析，根據著色強度分為：陰性（－，無黃色），弱陽性（+，淺黃色），陽性（++，棕黃色），強陽性（+++，深黃色或棕褐色）。測量并計算陽性信號光密度（A 值）均值，取中位數，作為衡量指標。
1.2.2 免疫組化 參照文獻 [11]，臨床肺組織標本固定、脫水，石蠟包埋同原位雜交。按 SP 檢測試劑盒進行操作，以 PBS 代替一抗作陰性對照。在顯微鏡下根據著色程度判定陽性強度同原位雜交。JD 病理圖像分析系統采集和分析圖像：每個肺組織標本隨機觀察 1 張切片，選擇內徑為 100～200 μm 的細支氣管和肺泡區各 3 個視野，自動選取陽性區域，測定A值，取平均值作為衡量陽性信號強弱的指標。
1.2.3 免疫共沉淀法（CO-IP）檢測 于液氮中取出臨床肺組織標本，按照 RIPA 總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，采用 BCA 法測定蛋白濃度。冰上裂解 30 min，4 ℃ 12 000 ×g 離心 5 min，收集
1.3 統計學方法
應用 SPSS 16.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料數據采用均數 ± 標準差（ ±s）表示，兩組均數間的比較采用兩獨立樣本t 檢驗；計數資料用構成比表示，兩樣本構成比比較采用 χ2 檢驗；相關性分析采用直線相關法。P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 基本資料比較
兩組患者年齡、性別、取材部位及腫瘤類別上差異無統計學意義（P＞0.05），但慢阻肺組吸煙指數明顯高于對照組，有統計學意義（P＜0.01）。慢阻肺組第 1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%pred）、第 1 秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比（FEV1/FVC）均較對照組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。結果見表 1。
表1
兩組患者臨床數據比較（n=20，
）
2.2 肺組織形態學改變
光鏡下可見慢阻肺組支氣管肺內出現炎細胞浸潤；支氣管上皮部分脫落，其內分泌物增加，支氣管平滑肌增生，管腔狹窄；肺泡壁變薄，出現不同程度的斷裂，部分肺泡融合成肺大皰。對照組患者支氣管和肺泡結構正常。結果見圖 1。
圖1
肺組織形態學特征（HE ×200） a．對照組； b．慢阻肺組
2.3 肺組織中 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 的 mRNA 表達
原位雜交結果：ATF3、ATF4、γ-GCS-HS mRNA 在兩組患者肺組織中的表達部位基本一致，主要見于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、平滑肌細胞及血管內皮細胞。ATF3、ATF4、γ-GCS-HS mRNA 表達在慢阻肺組均顯著高于對照組（P＜0.01）。結果見表 2 和圖 2。
表2
兩組患者肺組織 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS mRNA 的表達（n=20，A 值，
）
圖2
肺組織支氣管上皮細胞ATF3、ATF4和γ-GCS-HS mRNA的表達（DAB ×200） a．對照組； b．慢阻肺組
2.4 肺組織中 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白 的表達
免疫組化結果顯示 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白主要表達于支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞，小血管平滑肌中亦有少許表達，且在表達部位的胞漿胞核均有免疫著色，以胞核表達為主。圖像定量分析示慢阻肺組 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白表達高于對照組（P＜0.01）。結果見表 3 和圖 3。
表3
肺組織 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS 蛋白的表達（n=20，
）
圖3
肺組織支氣管上皮細胞中 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS 蛋白的表達（DAB ×200） a．對照組； b．慢阻肺組
2.5 肺組織中 γ-GCS-HS 蛋白與 ATF3、ATF4 蛋白的相互作用
免疫共沉淀結果顯示在 γ-GCS-HS 抗體捕獲的免疫沉淀中，ATF3、ATF4 抗體均可與其雜交出明顯的蛋白條帶，且慢阻肺組較對照組明顯增強（P＜0.01）。結果見圖 4。
圖4
免疫共沉淀檢測 ATF3、ATF4 與 γ-GCS-HS 蛋白的相互關系
2.6 相關性分析
直線相關分析顯示，ATF3、ATF4 蛋白表達與 γ-GCS-HS mRNA 及蛋白表達均呈明顯正相關（P＜0.01），ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白與FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈明顯正相關（P＜0.01）。結果見表 4 和表 5。
表4
肺組織 ATF3、ATF4 蛋白與 γ-GCS-HS 表達的相關分析
表5
肺組織 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白與 FEV1%pred、FEV1/FVC 的相關分析
3 討論
本研究通過收集臨床患者肺組織標本，比較各組患者的病理形態學特點及肺功能等指標，結果顯示慢阻肺組患者肺功能（FEV1/FVC、FEV1%pred）顯著低于對照組，吸煙指數顯著高于對照組；光鏡下慢阻肺組肺組織病理學改變示支氣管黏膜上皮細胞變性、壞死、脫落，炎細胞浸潤，氣道損傷、氣道重塑，肺泡壁變薄，肺泡腔擴大、破裂或融合成大皰，肺血管床破壞，肺小動脈血管壁明顯增厚，管腔狹窄，符合慢阻肺形態學診斷標準。而對照組未見以上情況。以上結果提示吸煙是慢阻肺發病的主要危險因素之一，且本研究的臨床肺組織標本符合試驗要求，具有研究意義。
氧化應激是慢阻肺的主要發病機制之一，γ-GCS 是慢阻肺中最重要的抗氧化酶之一，是抗氧化劑 GSH 生物合成限速酶，受 GSH 反饋調節，γ-GCS 的轉錄活性和表達水平反映了機體細胞的抗氧化能力[12]。本研究中，γ-GCS mRNA 及蛋白在慢阻肺組患者細支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中均呈強陽性表達，且 γ-GCS mRNA 及蛋白表達水平在慢阻肺組較對照組顯著升高，表明慢阻肺組患者的肺組織內存在氧化應激，氧化應激誘導抗氧化酶 γ-GCS 代償性上調，通過促進抗氧化劑 GSH 合成增加，參與局部抗氧化作用，與我們的前期研究結果一致[13]。
ATF/CREB 家族成員 ATF3 和 ATF4 作為轉錄因子，其轉錄調控作用機制復雜，越來越多的研究表明 ATF3、ATF4 在靜息細胞中弱表達于胞漿和/或胞核[14]。氧化應激狀態下，它們在胞核的表達增強并依靠其 bZIP 與家族中同源蛋白或其他同樣含 bZIP 區的蛋白，如 FOS、Jun、CCAAT/ 增強結合蛋白（C/EBPs）、Maf 家族、NF-κB、Nrf2 等，形成異二聚體，改變它們的 DNA 結合特異性及轉錄活性，對下游靶基因發揮轉錄調控作用[15-16]。近來研究發現，在氧化應激狀況下，ATF3 與 ATF4 基因缺失可導致體內重要的抗氧化物質 GSH 合成減少，活性氧的產生增多，增加機體細胞 DNA 的損傷[17-18]。以上結果提示 ATF3 和 ATF4 作為轉錄活化因子可能調控抗氧化基因的表達，在氧化/抗氧化過程中具有重要作用。本研究在前期動物實驗基礎上，進一步從臨床試驗角度進行觀察。結果顯示在臨床患者肺組織中 ATF3 與 ATF4 蛋白及 mRNA 在慢阻肺組均較對照組均顯著增高，以胞核表達為主，其表達部位與 γ-GCS 蛋白及 mRNA 表達部位基本一致，其強度與 γ-GCS 蛋白表達呈正相關。此外，免疫共沉淀結果顯示 ATF3、ATF4 與 γ-GCS-HS 可雜交出明顯的蛋白條帶，且慢阻肺組顯著高于對照組，提示 ATF3、ATF4 與 γ-GCS-HS 蛋白之間存在直接相互作用關系。以上結果提示慢阻肺組患者肺內存在明顯氧化損傷，在氧化應激狀況下，ATF3 與 ATF4 作為應激反應早期應答因子表達明顯上調，影響抗氧化酶 γ-GCS 的表達，從而調節細胞氧化還原能力，抵抗氧化應激。
綜上所述，我們的研究表明，在慢阻肺患者發病過程中，轉錄因子 ATF3、ATF4 的表達明顯上調，可能通過調控抗氧化基因 γ-GCS 的表達而發揮抗氧化保護作用，對其相關機制的深入研究可能為慢阻肺的防治提供新的對策。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的以持續性氣流受限為特征的疾病，氣流受限進行性發展，與氣道和肺臟對有毒顆粒或氣體的慢性炎性反應增強有關[1]。慢阻肺的發病機制尚未完全明了，目前認為吸入有害顆粒或氣體引起肺內氧化應激是其主要發病機制之一[1]。谷胱甘肽（GSH）是肺內抵御內外源性氧化應激的關鍵抗氧化劑。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是 GSH 合成反應中的限速酶，決定 GSH 生物合成的速率和量，其全酶是由 γ-GCS 重鏈亞基（γ-GCS-HS）和 γ-GCS 輕鏈亞基（γ-GCS-LS）組成的異二聚體，在人類染色體上分別定位于 6p12和 1p21，分子量分別約為 73 kD 和 30 kD[2]。γ-GCS-HS含有所有底物和催化亞基的結合位點，具有全酶的催化功能[3]。我們的多個前期研究已表明γ-GCS可通過促進GSH合成增加，參與局部抗氧化作用[4]。近年來多個研究發現活化轉錄因子 3（ATF3）與活化轉錄因子4（ATF4）的高表達有助于減輕氧化應激反應[5-7]。我室前期已在動物實驗中發現 ATF3 和 ATF4 對抗氧化基因 γ-GCS 的表達起重要作用，在慢阻肺大鼠氧化應激狀態下兩者具有明顯相關關系[8]。本研究擬進一步從臨床角度觀察轉錄因子 ATF3、ATF4 的表達變化以及對抗氧化通路 γ-GCS-HS 表達的影響，進一步探索及明確它們在慢阻肺發病機制中的作用及意義。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
1.1.1 標本來源及選擇標準 收集湖南省腫瘤醫院胸外科 2008 年 12 月至 2009 年 12 月因肺癌行肺葉或肺段切除術者 40 例。所有受試者均知情同意。將符合我國 2007 年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007 年版）》診斷標準并除外腫瘤所致氣道阻塞肺功能異常者歸為慢阻肺組（20 例），其余患者歸為對照組（20 例）。所有患者術前未經抗腫瘤治療（包括分子靶向藥物治療及放化療）并收集以下數據：患者年齡、性別、吸煙指數、肺功能、胸部 X 線片、心電圖、胸部 CT、病檢結果等。排除標準[9-10]：（1）合并其他慢性呼吸系統疾病，如活動性肺結核、支氣管擴張、支氣管哮喘、肺炎、間質性肺疾病、肺栓塞等；（2）合并睡眠呼吸障礙；（3）合并嚴重心腦血管系統、內分泌、肝腎和造血系統疾病；（4）有嚴重的免疫缺陷及免疫系統疾病，如結締組織疾病、痛風等；（5）有精神和心理疾病者或任何影響依從性的因素；（6）合并其他過敏性疾病史及惡性腫瘤疾病。本研究獲得湖南省腫瘤醫院倫理委員會批準。
1.1.2 標本采集 參照文獻[3]取材，取材標本均為遠離肺癌原發病灶 5 cm 以上、肉眼觀察無肺癌浸潤的外周肺組織。取其中一塊以 10% 福爾馬林溶液固定 6 h，常規取材、脫水、石蠟包埋，切片厚約 3 ～ 4 μm，行 HE 染色觀察組織形態學變化，行免疫組化及原位雜交檢測目的蛋白的表達變化。
1.2 方法
1.2.1 原位雜交 （1）寡核苷酸探針：地高辛標記的多相寡核苷酸探針購自武漢博士德生物工程有限公司。ATF3 mRNA 探針針對靶基因序列：① 5 ′ -CAGAACAAGCACCTCTGCCACCGGATGTCCTCTGC-3′；② 5′-TACATGCTCAACCTTCATCGGCCCACGTGTATTGT-3′；③ 5′-TTTATCCAACAGATAAAAGAAGGAACATTGCAGAG-3′。ATF4 mRNA 探針針對靶基因序列：① 5′-GATTGGATGTTGGAGAAAATGGATTTGAAGGAGTT-3′；② 5′-GATGACACTTGTGATCTCTTTGCCCCCCTAGTCCA-3′；③ 5′-AGGTACCGCCAGAAGAAGAGGGCGGAGCAGGAGGC-3′。γ-GCS-HS mRNA 探針針對靶基因序列：① 5′-TGCACATCTACCACGCAGTCAAGGACCGGC-3'；② 5′-ATATTCAGTCCACAAACTGGCAGACAATGA-3'；③ 5′-AGTACACGGAGCATAGACACCATCA-3'。（2）實驗步驟：取臨床肺組織石蠟塊連續切片（5 μm 厚）用原位雜交專用載玻片撈片，65 ℃ 烤片 3 h，常規脫蠟、入水，3% 雙氧水室溫處理 10 min 滅活內源性過氧化物酶，3% 檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化，滴加預雜交液預雜交，地高辛標記核苷酸探針濕盒雜交過夜，封閉，滴加生物素化鼠抗地高辛，鏈酶親和素、生物素復合體（SABC）孵育，滴加生物素化過氧化物酶，經二氨基聯苯胺（DAB）顯色、蘇木素復染后，脫水、透明、封片、拍片。以不含探針的雜交液作陰性對照。顯微顯影系統（日本 Olympus 公司）采集圖像，以胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，隨機選擇內徑為 100～200 μm 的細小支氣管和肺泡區各 3 個不同視野以 JD 病理圖像分析系統（江蘇省捷達科技發展有限公司）作圖像分析，根據著色強度分為：陰性（－，無黃色），弱陽性（+，淺黃色），陽性（++，棕黃色），強陽性（+++，深黃色或棕褐色）。測量并計算陽性信號光密度（A 值）均值，取中位數，作為衡量指標。
1.2.2 免疫組化 參照文獻 [11]，臨床肺組織標本固定、脫水，石蠟包埋同原位雜交。按 SP 檢測試劑盒進行操作，以 PBS 代替一抗作陰性對照。在顯微鏡下根據著色程度判定陽性強度同原位雜交。JD 病理圖像分析系統采集和分析圖像：每個肺組織標本隨機觀察 1 張切片，選擇內徑為 100～200 μm 的細支氣管和肺泡區各 3 個視野，自動選取陽性區域，測定A值，取平均值作為衡量陽性信號強弱的指標。
1.2.3 免疫共沉淀法（CO-IP）檢測 于液氮中取出臨床肺組織標本，按照 RIPA 總蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，采用 BCA 法測定蛋白濃度。冰上裂解 30 min，4 ℃ 12 000 ×g 離心 5 min，收集
1.3 統計學方法
應用 SPSS 16.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料數據采用均數 ± 標準差（ ±s）表示，兩組均數間的比較采用兩獨立樣本t 檢驗；計數資料用構成比表示，兩樣本構成比比較采用 χ2 檢驗；相關性分析采用直線相關法。P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 基本資料比較
兩組患者年齡、性別、取材部位及腫瘤類別上差異無統計學意義（P＞0.05），但慢阻肺組吸煙指數明顯高于對照組，有統計學意義（P＜0.01）。慢阻肺組第 1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%pred）、第 1 秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比（FEV1/FVC）均較對照組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。結果見表 1。
表1
兩組患者臨床數據比較（n=20，
）
2.2 肺組織形態學改變
光鏡下可見慢阻肺組支氣管肺內出現炎細胞浸潤；支氣管上皮部分脫落，其內分泌物增加，支氣管平滑肌增生，管腔狹窄；肺泡壁變薄，出現不同程度的斷裂，部分肺泡融合成肺大皰。對照組患者支氣管和肺泡結構正常。結果見圖 1。
圖1
肺組織形態學特征（HE ×200） a．對照組； b．慢阻肺組
2.3 肺組織中 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 的 mRNA 表達
原位雜交結果：ATF3、ATF4、γ-GCS-HS mRNA 在兩組患者肺組織中的表達部位基本一致，主要見于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、平滑肌細胞及血管內皮細胞。ATF3、ATF4、γ-GCS-HS mRNA 表達在慢阻肺組均顯著高于對照組（P＜0.01）。結果見表 2 和圖 2。
表2
兩組患者肺組織 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS mRNA 的表達（n=20，A 值，
）
圖2
肺組織支氣管上皮細胞ATF3、ATF4和γ-GCS-HS mRNA的表達（DAB ×200） a．對照組； b．慢阻肺組
2.4 肺組織中 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白 的表達
免疫組化結果顯示 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白主要表達于支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞，小血管平滑肌中亦有少許表達，且在表達部位的胞漿胞核均有免疫著色，以胞核表達為主。圖像定量分析示慢阻肺組 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白表達高于對照組（P＜0.01）。結果見表 3 和圖 3。
表3
肺組織 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS 蛋白的表達（n=20，
）
圖3
肺組織支氣管上皮細胞中 ATF3、ATF4 和 γ-GCS-HS 蛋白的表達（DAB ×200） a．對照組； b．慢阻肺組
2.5 肺組織中 γ-GCS-HS 蛋白與 ATF3、ATF4 蛋白的相互作用
免疫共沉淀結果顯示在 γ-GCS-HS 抗體捕獲的免疫沉淀中，ATF3、ATF4 抗體均可與其雜交出明顯的蛋白條帶，且慢阻肺組較對照組明顯增強（P＜0.01）。結果見圖 4。
圖4
免疫共沉淀檢測 ATF3、ATF4 與 γ-GCS-HS 蛋白的相互關系
2.6 相關性分析
直線相關分析顯示，ATF3、ATF4 蛋白表達與 γ-GCS-HS mRNA 及蛋白表達均呈明顯正相關（P＜0.01），ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白與FEV1%pred、FEV1/FVC 均呈明顯正相關（P＜0.01）。結果見表 4 和表 5。
表4
肺組織 ATF3、ATF4 蛋白與 γ-GCS-HS 表達的相關分析
表5
肺組織 ATF3、ATF4、γ-GCS-HS 蛋白與 FEV1%pred、FEV1/FVC 的相關分析
3 討論
本研究通過收集臨床患者肺組織標本，比較各組患者的病理形態學特點及肺功能等指標，結果顯示慢阻肺組患者肺功能（FEV1/FVC、FEV1%pred）顯著低于對照組，吸煙指數顯著高于對照組；光鏡下慢阻肺組肺組織病理學改變示支氣管黏膜上皮細胞變性、壞死、脫落，炎細胞浸潤，氣道損傷、氣道重塑，肺泡壁變薄，肺泡腔擴大、破裂或融合成大皰，肺血管床破壞，肺小動脈血管壁明顯增厚，管腔狹窄，符合慢阻肺形態學診斷標準。而對照組未見以上情況。以上結果提示吸煙是慢阻肺發病的主要危險因素之一，且本研究的臨床肺組織標本符合試驗要求，具有研究意義。
氧化應激是慢阻肺的主要發病機制之一，γ-GCS 是慢阻肺中最重要的抗氧化酶之一，是抗氧化劑 GSH 生物合成限速酶，受 GSH 反饋調節，γ-GCS 的轉錄活性和表達水平反映了機體細胞的抗氧化能力[12]。本研究中，γ-GCS mRNA 及蛋白在慢阻肺組患者細支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中均呈強陽性表達，且 γ-GCS mRNA 及蛋白表達水平在慢阻肺組較對照組顯著升高，表明慢阻肺組患者的肺組織內存在氧化應激，氧化應激誘導抗氧化酶 γ-GCS 代償性上調，通過促進抗氧化劑 GSH 合成增加，參與局部抗氧化作用，與我們的前期研究結果一致[13]。
ATF/CREB 家族成員 ATF3 和 ATF4 作為轉錄因子，其轉錄調控作用機制復雜，越來越多的研究表明 ATF3、ATF4 在靜息細胞中弱表達于胞漿和/或胞核[14]。氧化應激狀態下，它們在胞核的表達增強并依靠其 bZIP 與家族中同源蛋白或其他同樣含 bZIP 區的蛋白，如 FOS、Jun、CCAAT/ 增強結合蛋白（C/EBPs）、Maf 家族、NF-κB、Nrf2 等，形成異二聚體，改變它們的 DNA 結合特異性及轉錄活性，對下游靶基因發揮轉錄調控作用[15-16]。近來研究發現，在氧化應激狀況下，ATF3 與 ATF4 基因缺失可導致體內重要的抗氧化物質 GSH 合成減少，活性氧的產生增多，增加機體細胞 DNA 的損傷[17-18]。以上結果提示 ATF3 和 ATF4 作為轉錄活化因子可能調控抗氧化基因的表達，在氧化/抗氧化過程中具有重要作用。本研究在前期動物實驗基礎上，進一步從臨床試驗角度進行觀察。結果顯示在臨床患者肺組織中 ATF3 與 ATF4 蛋白及 mRNA 在慢阻肺組均較對照組均顯著增高，以胞核表達為主，其表達部位與 γ-GCS 蛋白及 mRNA 表達部位基本一致，其強度與 γ-GCS 蛋白表達呈正相關。此外，免疫共沉淀結果顯示 ATF3、ATF4 與 γ-GCS-HS 可雜交出明顯的蛋白條帶，且慢阻肺組顯著高于對照組，提示 ATF3、ATF4 與 γ-GCS-HS 蛋白之間存在直接相互作用關系。以上結果提示慢阻肺組患者肺內存在明顯氧化損傷，在氧化應激狀況下，ATF3 與 ATF4 作為應激反應早期應答因子表達明顯上調，影響抗氧化酶 γ-GCS 的表達，從而調節細胞氧化還原能力，抵抗氧化應激。
綜上所述，我們的研究表明，在慢阻肺患者發病過程中，轉錄因子 ATF3、ATF4 的表達明顯上調，可能通過調控抗氧化基因 γ-GCS 的表達而發揮抗氧化保護作用，對其相關機制的深入研究可能為慢阻肺的防治提供新的對策。
