引用本文： 張文波, 陳小菊, 冷長燕, 向小均. 巨噬細胞刺激蛋白在慢性阻塞性肺疾病患者中的表達及意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(2): 115-118. doi: 10.7507/1671-6205.2016029 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種以持續不可逆氣流受限且氣流受限呈進行性發展為特征的疾病，與氣道、肺實質和肺血管對有害顆粒或氣體的異常慢性炎癥反應有關。巨噬細胞是慢阻肺氣道管壁和管腔的主要炎性細胞之一。在慢阻肺中，肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)是炎癥的始動細胞，通過釋放中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)趨化因子、彈性蛋白酶、膠原酶和分泌多種細胞因子，介導炎癥反應，對肺組織產生損傷，參與慢阻肺慢性氣道炎癥及氣流受限發展過程[1-2]。巨噬細胞刺激蛋白(macrophage stimulating protein，MSP)，又稱肝細胞生長因子樣蛋白[3]，主要由肝臟合成[4]。MSP與其受體酪氨酸激酶受體RON(recepteur d′origine nantais)結合后，可以誘導巨噬細胞的擴散、遷移和吞噬功能[5]。MSP還可與一些單核細胞作用而活化為成熟巨噬細胞，使組織發生重塑[6]。我們之前的動物實驗證實MSP及其受體RON參與了慢阻肺大鼠氣道炎癥的調節[7]，然而它在慢阻肺患者中的表達情況尚未見報道。本研究采用酶聯免疫法檢測正常人和慢阻肺患者血漿中MSP、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的濃度，以及慢阻肺急性加重期和穩定期組患者誘導痰中MSP的濃度，探討巨噬細胞刺激蛋白在慢阻肺患者中的表達及意義。
對象與方法
一 對象
研究對象為2013年7月至2013年12月在川北醫學院附屬醫院門診、住院的患者，對照組為健康體檢者。所有研究對象均簽署知情同意書。將研究對象分為慢阻肺急性加重期組、慢阻肺穩定期組和健康對照組，每組各30例。
慢阻肺急性加重期組納入標準：(1) 符合衛生部醫政司《慢性阻塞性肺疾病診療規范(2011年版)》的診斷標準[8]；(2) 肝腎功能正常；(3) 處于慢阻肺急性加重期，即患者出現短期內咳嗽、咳痰、氣促和(或)喘息加重、痰量增多，呈膿性或黏液膿性，或伴發熱。
慢阻肺穩定期組納入標準：(1)和(2)同慢阻肺急性加重期組；(3)處于慢阻肺穩定期，指患者咳嗽、咳痰、氣促等癥狀穩定或癥狀輕微，時間大于8周。
健康對照組納入標準：(1) 年齡55歲以上；(2) 胸部影像學檢查和肺功能檢查正常；(3) 肝腎功能正常。
排除標準：(1) 其他慢性呼吸系統疾病；(2) 其他系統疾病，包括高血壓病、冠心病、惡性腫瘤、結締組織病、代謝性疾病、骨關節疾病、神經肌肉疾病等；(3) 6個月內接受過手術治療；(4) 健康對照組排除近4周有呼吸道感染史。
二 方法
1. 收集研究對象的一般情況：包括年齡、性別、肺功能等。
2. 肺功能檢測：檢測研究對象的用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1占預計值百分比(FEV1%pred)、FEV1/FVC和每分鐘最大通氣量(MVV)。吸入沙丁胺醇200 μg 15 min后進行肺功能檢測，肺功能檢測前24 h不使用支氣管舒張劑。
3. 樣本的采集與處理
(1) 血漿的采集：采集受試者空腹肘靜脈血5 mL于含有EDTA的抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，收集血漿，-20 ℃冰箱凍存，待檢測血漿中MSP、IL-6、 IL-8、TNF-α的濃度。
(2) 誘導痰的采集：受試者予雙氧水漱口，擤干鼻涕后霧化吸入3％高滲鹽水5 mL，2 min后再次用雙氧水漱口，擤干鼻涕，將痰咳入無菌容器中，繼續霧化吸入3％高滲鹽水，間隔3 min再次收集痰液；依此類推，于第5、8、11、14、17、20 min后停止操作。在痰誘導過程中密切注意患者的情況，若患者出現氣促癥狀加重，則給予200 μg沙丁胺醇吸入，并行肺功能檢查，若FEV1或呼氣峰流速較基礎值下降大于20％，則停止操作。收集痰液后2 h內進行處理。將痰液稱重，按痰液重量與0.1％二硫蘇糖醇(DTT)體積1 ∶2加入0.1％DTT，37 ℃水浴恒溫振蕩器振蕩10 min使痰液充分均質化；經40目篩網過濾去除黏液，濾液經1 500 r/min的速度離心10 min，收集上清液-70 ℃保存待行MSP的檢測。細胞存活率＞50％并且鱗狀上皮細胞百分比＜20％提示誘導痰標本合格。
(3) 血漿中MSP、IL-6、IL-8、TNF-α以及和誘導痰中MSP濃度的檢測：按人MSP、IL-6、IL-8、TNF-α相應的酶聯免疫吸附試劑盒說明書進行操作檢測其濃度，在450 nm處通過酶標儀測量吸光度值，繪制標準曲線，在標準曲線上計算其濃度。
三 統計學處理
所有數據均采用統計軟件SPSS 16.0進行處理。服從正態分布的計量資料以
結果
一 一般情況比較
各組間年齡、性別比較無顯著性差異(P＞0.05)。慢阻肺組的FEV1/FVC和FEV1%pred均明顯低于健康對照組，差異有統計學意義(P均＜0.01)；而慢阻肺急性加重期組的FEV1/FVC和FEV1%pred較慢阻肺穩定期組明顯降低，其差異有統計學意義(P均＜0.05)。結果見表 1。
表1
受試者一般情況比較(n=30，二 血漿中MSP、IL-6、IL-8、TNF-α和誘導痰中MSP的濃度比較
慢阻肺急性加重期組血漿和誘導痰中MSP濃度明顯高于慢阻肺穩定期組，慢阻肺組血漿中MSP濃度均明顯高于對照組，組間差異均有統計學意義(P均＜0.01)。慢阻肺急性加重期和慢阻肺穩定期組的血漿中MSP與誘導痰中MSP濃度比較也均有統計學差異(P均＜0.01)，兩組患者血漿中MSP濃度均大于誘導痰中MSP濃度。結果見表 2、3。
表2
三組受試者血漿、誘導痰中MSP濃度的均數表(n=30,
表3
三組受試者血漿、誘導痰中MSP濃度的幾何均數比較(n=30,G±SG)
與對照組比較，慢阻肺急性加重期組和慢阻肺穩定期組血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度均明顯升高，其差異均有統計學意義(P＜0.05)；而慢阻肺急性加重期組血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度又明顯高于慢阻肺穩定期組，其差異也有統計學意義(P＜0.01)。結果見表 4。
表4
三組受試者血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度比較(n=30, 三 COPD患者血漿和誘導痰中MSP、血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平與肺功能的相關分析
慢阻肺患者血漿和誘導痰中MSP、血漿IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平與其FEV1%pred均呈負相關。其中，IL-8與FEV1%pred的相關性最強，MSP次之。結果見表 5。
表5
血漿和誘導痰中MSP、血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度與FEV1%pred的相關性
四 慢阻肺患者血漿和誘導痰中MSP濃度水平與血漿IL-6、IL-8、TNF-α濃度水平的相關分析
慢阻肺患者血漿和誘導痰中MSP濃度水平與血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平均呈正相關，其中，MSP與IL-6的相關性最強。結果見表 6。
表6
血漿和誘導痰中MSP濃度與血漿IL-6、IL-8、TNF-α濃度的相關性
討 論
MSP主要以無活性的單鏈糖蛋白前體形式(pro-MSP)從肝臟分泌入血漿參與免疫調節。在病理情況下，pro-MSP經血漿、組織和細胞膜上的多種蛋白酶的水解作用激活為成熟的具有生物學活性的α、β雙鏈異二聚體糖蛋白MSP[9]。MSP的調控發生在以巨噬細胞為靶細胞水平上，巨噬細胞能夠根據細胞外液微環境的變化調節MSP的活性。研究顯示，MSP激活巨噬細胞后伴隨兩個效應，一是釋放蛋白水解酶，二是誘導細胞膜及胞質蛋白的重新排列，包括單核細胞向刺激遷移[10]。
本研究結果顯示，慢阻肺急性加重期和穩定期組患者血漿中MSP濃度都顯著高于對照組(P＜0.01)，說明MSP在慢阻肺患者體內的合成和釋放明顯增加。我們之前的動物實驗表明：慢阻肺大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中MSP濃度均明顯高于正常大鼠[7]，與本研究結果相一致。提示MSP參與了慢阻肺的發生發展。我們進一步比較了慢阻肺急性加重期和穩定期患者血漿及誘導痰中MSP的濃度變化，發現慢阻肺急性加重期組患者血漿及誘導痰中MSP的濃度較穩定期組患者高(P＜0.01)，因慢阻肺急性加重期炎癥較穩定期更明顯，提示MSP可能與慢阻肺的炎癥機制更密切相關。MSP能夠促進成纖維細胞的遷移，促進膠原的合成與重構[11]。而慢阻肺本質是氣道和肺組織的慢性炎癥，據此可推測MSP在長期慢性炎癥過程中可使氣道、肺實質、肺血管結構重構，發生不可逆的損傷，從而導致不可逆氣流受限。
動物實驗結果表明，慢阻肺大鼠血清和BALF中MSP濃度均明顯高于正常大鼠，MSP能夠活化慢阻肺大鼠肺泡巨噬細胞并促進其釋放炎癥介質TNF-α、IL-8、IL-10和IL-1β，參與形成氣道局部及全身的炎癥網絡[7]。本研究結果顯示，慢阻肺急性加 重期和穩定期組患者血漿中MSP、IL-6、IL-8和TNF-α 的濃度均明顯高于對照組，慢阻肺急性加重期組患者血漿和誘導痰中MSP的濃度又高于慢阻肺穩定期組；相關分析顯示，慢阻肺患者血漿和誘導痰中的MSP濃度與能反映慢阻肺病情嚴重程度的氣流受限程度呈正相關，慢阻肺患者血漿中MSP的濃度水平與血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平呈正相關，誘導痰中MSP的濃度水平與血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平也呈正相關，進一步提示MSP參與了慢阻肺的發生發展。其機制之一可能是MSP參與了調節慢阻肺的炎癥機制，在慢阻肺的長期慢性炎癥過程中的氣道、肺實質、肺血管結構重構方面起著重要作用。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種以持續不可逆氣流受限且氣流受限呈進行性發展為特征的疾病，與氣道、肺實質和肺血管對有害顆粒或氣體的異常慢性炎癥反應有關。巨噬細胞是慢阻肺氣道管壁和管腔的主要炎性細胞之一。在慢阻肺中，肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)是炎癥的始動細胞，通過釋放中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)趨化因子、彈性蛋白酶、膠原酶和分泌多種細胞因子，介導炎癥反應，對肺組織產生損傷，參與慢阻肺慢性氣道炎癥及氣流受限發展過程[1-2]。巨噬細胞刺激蛋白(macrophage stimulating protein，MSP)，又稱肝細胞生長因子樣蛋白[3]，主要由肝臟合成[4]。MSP與其受體酪氨酸激酶受體RON(recepteur d′origine nantais)結合后，可以誘導巨噬細胞的擴散、遷移和吞噬功能[5]。MSP還可與一些單核細胞作用而活化為成熟巨噬細胞，使組織發生重塑[6]。我們之前的動物實驗證實MSP及其受體RON參與了慢阻肺大鼠氣道炎癥的調節[7]，然而它在慢阻肺患者中的表達情況尚未見報道。本研究采用酶聯免疫法檢測正常人和慢阻肺患者血漿中MSP、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的濃度，以及慢阻肺急性加重期和穩定期組患者誘導痰中MSP的濃度，探討巨噬細胞刺激蛋白在慢阻肺患者中的表達及意義。
對象與方法
一 對象
研究對象為2013年7月至2013年12月在川北醫學院附屬醫院門診、住院的患者，對照組為健康體檢者。所有研究對象均簽署知情同意書。將研究對象分為慢阻肺急性加重期組、慢阻肺穩定期組和健康對照組，每組各30例。
慢阻肺急性加重期組納入標準：(1) 符合衛生部醫政司《慢性阻塞性肺疾病診療規范(2011年版)》的診斷標準[8]；(2) 肝腎功能正常；(3) 處于慢阻肺急性加重期，即患者出現短期內咳嗽、咳痰、氣促和(或)喘息加重、痰量增多，呈膿性或黏液膿性，或伴發熱。
慢阻肺穩定期組納入標準：(1)和(2)同慢阻肺急性加重期組；(3)處于慢阻肺穩定期，指患者咳嗽、咳痰、氣促等癥狀穩定或癥狀輕微，時間大于8周。
健康對照組納入標準：(1) 年齡55歲以上；(2) 胸部影像學檢查和肺功能檢查正常；(3) 肝腎功能正常。
排除標準：(1) 其他慢性呼吸系統疾病；(2) 其他系統疾病，包括高血壓病、冠心病、惡性腫瘤、結締組織病、代謝性疾病、骨關節疾病、神經肌肉疾病等；(3) 6個月內接受過手術治療；(4) 健康對照組排除近4周有呼吸道感染史。
二 方法
1. 收集研究對象的一般情況：包括年齡、性別、肺功能等。
2. 肺功能檢測：檢測研究對象的用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1占預計值百分比(FEV1%pred)、FEV1/FVC和每分鐘最大通氣量(MVV)。吸入沙丁胺醇200 μg 15 min后進行肺功能檢測，肺功能檢測前24 h不使用支氣管舒張劑。
3. 樣本的采集與處理
(1) 血漿的采集：采集受試者空腹肘靜脈血5 mL于含有EDTA的抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，收集血漿，-20 ℃冰箱凍存，待檢測血漿中MSP、IL-6、 IL-8、TNF-α的濃度。
(2) 誘導痰的采集：受試者予雙氧水漱口，擤干鼻涕后霧化吸入3％高滲鹽水5 mL，2 min后再次用雙氧水漱口，擤干鼻涕，將痰咳入無菌容器中，繼續霧化吸入3％高滲鹽水，間隔3 min再次收集痰液；依此類推，于第5、8、11、14、17、20 min后停止操作。在痰誘導過程中密切注意患者的情況，若患者出現氣促癥狀加重，則給予200 μg沙丁胺醇吸入，并行肺功能檢查，若FEV1或呼氣峰流速較基礎值下降大于20％，則停止操作。收集痰液后2 h內進行處理。將痰液稱重，按痰液重量與0.1％二硫蘇糖醇(DTT)體積1 ∶2加入0.1％DTT，37 ℃水浴恒溫振蕩器振蕩10 min使痰液充分均質化；經40目篩網過濾去除黏液，濾液經1 500 r/min的速度離心10 min，收集上清液-70 ℃保存待行MSP的檢測。細胞存活率＞50％并且鱗狀上皮細胞百分比＜20％提示誘導痰標本合格。
(3) 血漿中MSP、IL-6、IL-8、TNF-α以及和誘導痰中MSP濃度的檢測：按人MSP、IL-6、IL-8、TNF-α相應的酶聯免疫吸附試劑盒說明書進行操作檢測其濃度，在450 nm處通過酶標儀測量吸光度值，繪制標準曲線，在標準曲線上計算其濃度。
三 統計學處理
所有數據均采用統計軟件SPSS 16.0進行處理。服從正態分布的計量資料以
結果
一 一般情況比較
各組間年齡、性別比較無顯著性差異(P＞0.05)。慢阻肺組的FEV1/FVC和FEV1%pred均明顯低于健康對照組，差異有統計學意義(P均＜0.01)；而慢阻肺急性加重期組的FEV1/FVC和FEV1%pred較慢阻肺穩定期組明顯降低，其差異有統計學意義(P均＜0.05)。結果見表 1。
表1
受試者一般情況比較(n=30，二 血漿中MSP、IL-6、IL-8、TNF-α和誘導痰中MSP的濃度比較
慢阻肺急性加重期組血漿和誘導痰中MSP濃度明顯高于慢阻肺穩定期組，慢阻肺組血漿中MSP濃度均明顯高于對照組，組間差異均有統計學意義(P均＜0.01)。慢阻肺急性加重期和慢阻肺穩定期組的血漿中MSP與誘導痰中MSP濃度比較也均有統計學差異(P均＜0.01)，兩組患者血漿中MSP濃度均大于誘導痰中MSP濃度。結果見表 2、3。
表2
三組受試者血漿、誘導痰中MSP濃度的均數表(n=30,
表3
三組受試者血漿、誘導痰中MSP濃度的幾何均數比較(n=30,G±SG)
與對照組比較，慢阻肺急性加重期組和慢阻肺穩定期組血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度均明顯升高，其差異均有統計學意義(P＜0.05)；而慢阻肺急性加重期組血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度又明顯高于慢阻肺穩定期組，其差異也有統計學意義(P＜0.01)。結果見表 4。
表4
三組受試者血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度比較(n=30, 三 COPD患者血漿和誘導痰中MSP、血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平與肺功能的相關分析
慢阻肺患者血漿和誘導痰中MSP、血漿IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平與其FEV1%pred均呈負相關。其中，IL-8與FEV1%pred的相關性最強，MSP次之。結果見表 5。
表5
血漿和誘導痰中MSP、血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度與FEV1%pred的相關性
四 慢阻肺患者血漿和誘導痰中MSP濃度水平與血漿IL-6、IL-8、TNF-α濃度水平的相關分析
慢阻肺患者血漿和誘導痰中MSP濃度水平與血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平均呈正相關，其中，MSP與IL-6的相關性最強。結果見表 6。
表6
血漿和誘導痰中MSP濃度與血漿IL-6、IL-8、TNF-α濃度的相關性
討 論
MSP主要以無活性的單鏈糖蛋白前體形式(pro-MSP)從肝臟分泌入血漿參與免疫調節。在病理情況下，pro-MSP經血漿、組織和細胞膜上的多種蛋白酶的水解作用激活為成熟的具有生物學活性的α、β雙鏈異二聚體糖蛋白MSP[9]。MSP的調控發生在以巨噬細胞為靶細胞水平上，巨噬細胞能夠根據細胞外液微環境的變化調節MSP的活性。研究顯示，MSP激活巨噬細胞后伴隨兩個效應，一是釋放蛋白水解酶，二是誘導細胞膜及胞質蛋白的重新排列，包括單核細胞向刺激遷移[10]。
本研究結果顯示，慢阻肺急性加重期和穩定期組患者血漿中MSP濃度都顯著高于對照組(P＜0.01)，說明MSP在慢阻肺患者體內的合成和釋放明顯增加。我們之前的動物實驗表明：慢阻肺大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中MSP濃度均明顯高于正常大鼠[7]，與本研究結果相一致。提示MSP參與了慢阻肺的發生發展。我們進一步比較了慢阻肺急性加重期和穩定期患者血漿及誘導痰中MSP的濃度變化，發現慢阻肺急性加重期組患者血漿及誘導痰中MSP的濃度較穩定期組患者高(P＜0.01)，因慢阻肺急性加重期炎癥較穩定期更明顯，提示MSP可能與慢阻肺的炎癥機制更密切相關。MSP能夠促進成纖維細胞的遷移，促進膠原的合成與重構[11]。而慢阻肺本質是氣道和肺組織的慢性炎癥，據此可推測MSP在長期慢性炎癥過程中可使氣道、肺實質、肺血管結構重構，發生不可逆的損傷，從而導致不可逆氣流受限。
動物實驗結果表明，慢阻肺大鼠血清和BALF中MSP濃度均明顯高于正常大鼠，MSP能夠活化慢阻肺大鼠肺泡巨噬細胞并促進其釋放炎癥介質TNF-α、IL-8、IL-10和IL-1β，參與形成氣道局部及全身的炎癥網絡[7]。本研究結果顯示，慢阻肺急性加 重期和穩定期組患者血漿中MSP、IL-6、IL-8和TNF-α 的濃度均明顯高于對照組，慢阻肺急性加重期組患者血漿和誘導痰中MSP的濃度又高于慢阻肺穩定期組；相關分析顯示，慢阻肺患者血漿和誘導痰中的MSP濃度與能反映慢阻肺病情嚴重程度的氣流受限程度呈正相關，慢阻肺患者血漿中MSP的濃度水平與血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平呈正相關，誘導痰中MSP的濃度水平與血漿中IL-6、IL-8、TNF-α的濃度水平也呈正相關，進一步提示MSP參與了慢阻肺的發生發展。其機制之一可能是MSP參與了調節慢阻肺的炎癥機制，在慢阻肺的長期慢性炎癥過程中的氣道、肺實質、肺血管結構重構方面起著重要作用。
