引用本文： 陳文瓊, 胡瑞成, 戴愛國. 泛素連接酶Hrd1與呼吸系統疾病. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(1): 99-101. doi: 10.7507/1671-6205.2016025 復制
肺部的細胞在受到缺氧、煙霧等外界刺激時會發生內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，而ERS參與多種肺部疾病的發生發展[1]。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1(Hmg-CoA reductase degradation 1，Hrd1)為一個六次跨膜的內質網膜蛋白，其生物學功能是作為E3泛素連接酶參與內質網相關性降解(ER-associated degradation，ERAD)[2]。ERAD作為細胞保護機制能緩解過強的ERS所致的細胞凋亡，從而參與疾病的發生發展并影響肺部疾病的預后[3]。現就ERAD的核心蛋白Hrd1與肺部相關疾病做一綜述。
一 HRD的發現及其結構
1996年Hampton等[2]在酵母中鑒定出了羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白基因(HMG-CoA reductase degradation，HRD)，包括HRD1、HRD2、HRD3。1998年Bordallo等[4]在研究酵母突變羧肽酶(carboxypeptidase yscY，CPY)的降解中發現了基因DER3，并證實其與HRD1為相同基因，命名相關蛋白為Hrd1p/Der3p。2001年Deak等[5]發現Hrd1p/Der3p為一個6次跨膜的內質網膜蛋白，N末端為橫跨內質網膜的疏水端，C末端為含RING結構域的親水端。隨后發現在人體組織中Hrd1p的同源物為Hrd1，其相關基因定位在人11號染色體的11q13區域，多肽鏈由617個氨基酸組成，約為85 kDa，在人體肝臟、腦、肺、腎臟、脾臟、心臟等都有表達，同時證實酵母的Hrd1p進化到人的Hrd1，其功能上有高度保守性[6]。Omura等[7]探討了Hrd1各結構域的作用，其中RING尾端結構域是Hrd1發揮E3泛素連接酶作用最重要的結構域，其作用為將泛素從泛素結合酶E2轉移到底物蛋白上，從而使底物泛素化；跨膜結構域起逆向轉移作用，將底物蛋白從內質網腔內逆向轉移到胞質內，另外該結構域對Hrd1的穩定性也起著重要作用；富含脯氨酸的結構域證實與底物蛋白被蛋白酶體降解密切相關。2003年Amano等[8]在大鼠的類風濕性關節炎的滑膜細胞中鑒定和克隆出了滑膜蛋白(synoviolin，SYVN1)，同時證實其與Hrd1p同源，并在類風濕性關節炎滑膜組織中高表達，參與了該病的發生發展。
二 Hrd1的生物學功能
當細胞受到缺氧、炎癥等刺激時，內質網的功能將受阻，導致錯誤折疊或未折疊蛋白增加，即內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[9]。未折疊蛋白在內質網腔內的累積超過了內質網的承受能力，機體將啟動細胞保護機制未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)及ERAD[10]。ERAD主要包括底物蛋白(未折疊或錯誤折疊蛋白)識別、底物泛素化與轉運、降解三個過程[11]。通過泛素-蛋白酶體途徑實現，即底物蛋白通過泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)和泛素連接酶(E3)的泛素化及轉運，最后轉運至胞質中與26蛋白酶體結合完成降解[12]。在ERAD中，底物泛素化與轉運為最關鍵的一步，Hrd1作為內質網膜上的跨膜蛋白起著“門控通道”的作用，將底物蛋白泛素化后從內質網腔內轉運至胞質中完成降解[13]。因此，Hrd1為ERAD的核心蛋白，起著關鍵性作用[14]。
ERAD作為細胞的保護機制，可以減輕甚至阻斷過強的ERS所致的內質網應激誘導性凋亡(endoplasmic reticulum stress induced apoptosis，ERSIA)，所以Hrd1作為其核心蛋白具有抗細胞凋亡的作用[15]。Yagishita等[16]發現敲除了HRD1基因的小鼠子宮內胚胎不能正常發育，最終死亡，其機制主要為胎肝容易發生ERS，敲除了HRD1基因的胚胎肝臟細胞凋亡增加，導致最終不能發育成形。之后的研究發現在類風濕性關節炎患者的滑膜組織中Hrd1高表達，并參與了該病的發生發展，分析其機制發現Hrd1主要通過兩條抗凋亡途徑使滑膜細胞過度增殖從而最終導致增生性的關節病變，其中一條途徑是Hrd1通過ERAD阻止滑膜細胞過度的ERS引起細胞發生ERSIA；另一條途徑為滑膜細胞中高表達的Hrd1能與胞質中的腫瘤抑制因子p53結合，抑制p53的促細胞凋亡作用[17]。
三 Hrd1與肺部疾病
1.慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)：慢阻肺是一種長期的慢性炎癥導致的呼吸系統疾病，主要表現為慢性支氣管炎和肺氣腫。α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)是絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，serpin)超家族的成員之一，AAT缺陷(α1-antitrypsin deficiency，AATD)是一種常染色體隱性遺傳性疾病，以Z突變表現最為典型，已被證實參與了慢阻肺的發生發展[18]。Wang等[19]發現內質網腔內的AAT突變體(Z variant of AAT，ATZ)的降解是通過內質網相關性降解來完成的，并且依賴于E3泛素連接酶Hrd1，所以可以通過該機制促進ATZ的降解，增加血清內AAT的水平，減緩疾病的發展。
2.肺癌：Wan等[20]和Swinson等[21]證實在低氧環境下，缺氧誘導因子1α(HIF-1α)在肺組織中高表達并參與了肺癌的發生發展。凝集素蛋白(lectin proteinosteosarcoma amplified-9，OS-9)在ERAD中對未折疊蛋白的識別和招募中起重要作用[13]。Kim等[22]發現在低氧條件下，OS-9與其他E3泛素連接酶共同作用使HIF-1α泛素化隨后降解。而作為ERAD的自我調節機制，Hrd1能降解0S-9來防止ERAD的過度激活，所以可以推測Hrd1能通過0S-9間接影響腫瘤細胞的發生發展[23]。此外，p53為腫瘤抑制基因，有促進細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、阻滯細胞周期等功能。Yamasaki等[24]于2007年發現當細胞發生ERS后Hrd1能與胞質中的p53結合并將其泛素化隨后降解。利用該機制可抑制p53的降解，從而促進腫瘤細胞的凋亡[25]。研究發現抑制Hrd1的表達可增強ERS，增加人肺腺癌耐順鉑低敏細胞株A549/DDP細胞的凋亡，提高耐藥細胞對順鉑的敏感性[26]。其機制可能是Hrd1被抑制后，ERAD途徑被阻斷，底物在內質網上不能及時清除，從而加重ERS，超過內質網負荷而最終導致細胞凋亡[26]。
3.囊性纖維化：囊性纖維化是由跨膜調節因子基因(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)的突變引起的常染色體隱形遺傳性疾病。CFTR的重要結構域為ATP依賴的氯(Cl-)通道，定位于氣道上皮細胞維持上皮細胞的水鹽平衡。CFTR最常見的缺陷是在該蛋白的第508位苯丙氨酸殘基缺失，即△F508-CFTR，△F508-CFTR仍保留了ATP依賴的Cl-通道結構域，但△F508-CFTR不能正常折疊從而激活內質網的ERAD系統，使△F508-CFTR降解[27]。E3泛素連接酶gp78在△F508-CFTR的降解中起著決定性的作用，Ballar等[28]發現Hrd1在gp78的自我降解中起著關鍵作用，從而負相調節了gp78對△F508-CFTR的降解。氣道上皮細胞CFTR的缺失會導致氣道上皮細胞的離子轉運受阻，繼而引起氣道內的黏液堆積以及慢性炎癥的產生，最終導致肺囊性纖維化和慢阻肺[29]。因此，可以利用Hrd1介導的ERAD來抑制△F508-CFTR的降解，從而改善肺囊性纖維化的相關癥狀。
4.間質性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)：ILD是以彌漫性肺實質、肺泡炎和間質纖維化為基本病理改變的肺部疾病。表面活性蛋白C(surfactant protein C，SP-C)是一個疏水性肺表面活性劑蛋白質組件，特異性表達在肺泡Ⅱ型上皮細胞，以往的研究證實，SP-C的突變促進了ILD的發生發展[30]。2014年Nakajima等[31]發現Hrd1在SP-C的突變體所致的ILD中起著重要作用，其主要機制是4號外顯子缺失的SP-C突變蛋白SP-CΔexon4會誘發肺上皮細胞發生ERS，隨后引起Hrd1的表達上調。Hrd1會使組織內的膠原蛋白增加，該結論已在腎纖維化中證實[32]。同時Nakajima等[31]提到用Hrd1的特異性抑制劑LS-102，可使膠原蛋白的生成明顯減少，因此可以利用Hrd1特異性抑制劑的抗纖維化作用為ILD的治療提供新的治療靶點。
四 結語
Hrd1為E3泛素連接酶，通過對底物蛋白的識別和逆向轉運來參與ERAD。因Hrd1為ERAD的核心蛋白，延緩甚至阻止了組織細胞ERSIA的發生，從而起到了抗凋亡的作用。研究證實Hrd1與臨床上多種疾病相關。因Hrd1在肺部組織中有表達，其與呼吸系統疾病的關系成為近年來的研究熱點。雖然有大量理論依據和基礎實驗證實Hrd1與肺部疾病關系密切，但是其在臨床的研究有待進一步深入。同時，Hrd1是否也參與肺部其他疾病如哮喘的發生發展有待進一步探討。隨著Hrd1研究的深入，其有望成為呼吸系統相關疾病新的治療靶點。
肺部的細胞在受到缺氧、煙霧等外界刺激時會發生內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，而ERS參與多種肺部疾病的發生發展[1]。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1(Hmg-CoA reductase degradation 1，Hrd1)為一個六次跨膜的內質網膜蛋白，其生物學功能是作為E3泛素連接酶參與內質網相關性降解(ER-associated degradation，ERAD)[2]。ERAD作為細胞保護機制能緩解過強的ERS所致的細胞凋亡，從而參與疾病的發生發展并影響肺部疾病的預后[3]。現就ERAD的核心蛋白Hrd1與肺部相關疾病做一綜述。
一 HRD的發現及其結構
1996年Hampton等[2]在酵母中鑒定出了羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白基因(HMG-CoA reductase degradation，HRD)，包括HRD1、HRD2、HRD3。1998年Bordallo等[4]在研究酵母突變羧肽酶(carboxypeptidase yscY，CPY)的降解中發現了基因DER3，并證實其與HRD1為相同基因，命名相關蛋白為Hrd1p/Der3p。2001年Deak等[5]發現Hrd1p/Der3p為一個6次跨膜的內質網膜蛋白，N末端為橫跨內質網膜的疏水端，C末端為含RING結構域的親水端。隨后發現在人體組織中Hrd1p的同源物為Hrd1，其相關基因定位在人11號染色體的11q13區域，多肽鏈由617個氨基酸組成，約為85 kDa，在人體肝臟、腦、肺、腎臟、脾臟、心臟等都有表達，同時證實酵母的Hrd1p進化到人的Hrd1，其功能上有高度保守性[6]。Omura等[7]探討了Hrd1各結構域的作用，其中RING尾端結構域是Hrd1發揮E3泛素連接酶作用最重要的結構域，其作用為將泛素從泛素結合酶E2轉移到底物蛋白上，從而使底物泛素化；跨膜結構域起逆向轉移作用，將底物蛋白從內質網腔內逆向轉移到胞質內，另外該結構域對Hrd1的穩定性也起著重要作用；富含脯氨酸的結構域證實與底物蛋白被蛋白酶體降解密切相關。2003年Amano等[8]在大鼠的類風濕性關節炎的滑膜細胞中鑒定和克隆出了滑膜蛋白(synoviolin，SYVN1)，同時證實其與Hrd1p同源，并在類風濕性關節炎滑膜組織中高表達，參與了該病的發生發展。
二 Hrd1的生物學功能
當細胞受到缺氧、炎癥等刺激時，內質網的功能將受阻，導致錯誤折疊或未折疊蛋白增加，即內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[9]。未折疊蛋白在內質網腔內的累積超過了內質網的承受能力，機體將啟動細胞保護機制未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)及ERAD[10]。ERAD主要包括底物蛋白(未折疊或錯誤折疊蛋白)識別、底物泛素化與轉運、降解三個過程[11]。通過泛素-蛋白酶體途徑實現，即底物蛋白通過泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)和泛素連接酶(E3)的泛素化及轉運，最后轉運至胞質中與26蛋白酶體結合完成降解[12]。在ERAD中，底物泛素化與轉運為最關鍵的一步，Hrd1作為內質網膜上的跨膜蛋白起著“門控通道”的作用，將底物蛋白泛素化后從內質網腔內轉運至胞質中完成降解[13]。因此，Hrd1為ERAD的核心蛋白，起著關鍵性作用[14]。
ERAD作為細胞的保護機制，可以減輕甚至阻斷過強的ERS所致的內質網應激誘導性凋亡(endoplasmic reticulum stress induced apoptosis，ERSIA)，所以Hrd1作為其核心蛋白具有抗細胞凋亡的作用[15]。Yagishita等[16]發現敲除了HRD1基因的小鼠子宮內胚胎不能正常發育，最終死亡，其機制主要為胎肝容易發生ERS，敲除了HRD1基因的胚胎肝臟細胞凋亡增加，導致最終不能發育成形。之后的研究發現在類風濕性關節炎患者的滑膜組織中Hrd1高表達，并參與了該病的發生發展，分析其機制發現Hrd1主要通過兩條抗凋亡途徑使滑膜細胞過度增殖從而最終導致增生性的關節病變，其中一條途徑是Hrd1通過ERAD阻止滑膜細胞過度的ERS引起細胞發生ERSIA；另一條途徑為滑膜細胞中高表達的Hrd1能與胞質中的腫瘤抑制因子p53結合，抑制p53的促細胞凋亡作用[17]。
三 Hrd1與肺部疾病
1.慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)：慢阻肺是一種長期的慢性炎癥導致的呼吸系統疾病，主要表現為慢性支氣管炎和肺氣腫。α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)是絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，serpin)超家族的成員之一，AAT缺陷(α1-antitrypsin deficiency，AATD)是一種常染色體隱性遺傳性疾病，以Z突變表現最為典型，已被證實參與了慢阻肺的發生發展[18]。Wang等[19]發現內質網腔內的AAT突變體(Z variant of AAT，ATZ)的降解是通過內質網相關性降解來完成的，并且依賴于E3泛素連接酶Hrd1，所以可以通過該機制促進ATZ的降解，增加血清內AAT的水平，減緩疾病的發展。
2.肺癌：Wan等[20]和Swinson等[21]證實在低氧環境下，缺氧誘導因子1α(HIF-1α)在肺組織中高表達并參與了肺癌的發生發展。凝集素蛋白(lectin proteinosteosarcoma amplified-9，OS-9)在ERAD中對未折疊蛋白的識別和招募中起重要作用[13]。Kim等[22]發現在低氧條件下，OS-9與其他E3泛素連接酶共同作用使HIF-1α泛素化隨后降解。而作為ERAD的自我調節機制，Hrd1能降解0S-9來防止ERAD的過度激活，所以可以推測Hrd1能通過0S-9間接影響腫瘤細胞的發生發展[23]。此外，p53為腫瘤抑制基因，有促進細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、阻滯細胞周期等功能。Yamasaki等[24]于2007年發現當細胞發生ERS后Hrd1能與胞質中的p53結合并將其泛素化隨后降解。利用該機制可抑制p53的降解，從而促進腫瘤細胞的凋亡[25]。研究發現抑制Hrd1的表達可增強ERS，增加人肺腺癌耐順鉑低敏細胞株A549/DDP細胞的凋亡，提高耐藥細胞對順鉑的敏感性[26]。其機制可能是Hrd1被抑制后，ERAD途徑被阻斷，底物在內質網上不能及時清除，從而加重ERS，超過內質網負荷而最終導致細胞凋亡[26]。
3.囊性纖維化：囊性纖維化是由跨膜調節因子基因(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)的突變引起的常染色體隱形遺傳性疾病。CFTR的重要結構域為ATP依賴的氯(Cl-)通道，定位于氣道上皮細胞維持上皮細胞的水鹽平衡。CFTR最常見的缺陷是在該蛋白的第508位苯丙氨酸殘基缺失，即△F508-CFTR，△F508-CFTR仍保留了ATP依賴的Cl-通道結構域，但△F508-CFTR不能正常折疊從而激活內質網的ERAD系統，使△F508-CFTR降解[27]。E3泛素連接酶gp78在△F508-CFTR的降解中起著決定性的作用，Ballar等[28]發現Hrd1在gp78的自我降解中起著關鍵作用，從而負相調節了gp78對△F508-CFTR的降解。氣道上皮細胞CFTR的缺失會導致氣道上皮細胞的離子轉運受阻，繼而引起氣道內的黏液堆積以及慢性炎癥的產生，最終導致肺囊性纖維化和慢阻肺[29]。因此，可以利用Hrd1介導的ERAD來抑制△F508-CFTR的降解，從而改善肺囊性纖維化的相關癥狀。
4.間質性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)：ILD是以彌漫性肺實質、肺泡炎和間質纖維化為基本病理改變的肺部疾病。表面活性蛋白C(surfactant protein C，SP-C)是一個疏水性肺表面活性劑蛋白質組件，特異性表達在肺泡Ⅱ型上皮細胞，以往的研究證實，SP-C的突變促進了ILD的發生發展[30]。2014年Nakajima等[31]發現Hrd1在SP-C的突變體所致的ILD中起著重要作用，其主要機制是4號外顯子缺失的SP-C突變蛋白SP-CΔexon4會誘發肺上皮細胞發生ERS，隨后引起Hrd1的表達上調。Hrd1會使組織內的膠原蛋白增加，該結論已在腎纖維化中證實[32]。同時Nakajima等[31]提到用Hrd1的特異性抑制劑LS-102，可使膠原蛋白的生成明顯減少，因此可以利用Hrd1特異性抑制劑的抗纖維化作用為ILD的治療提供新的治療靶點。
四 結語
Hrd1為E3泛素連接酶，通過對底物蛋白的識別和逆向轉運來參與ERAD。因Hrd1為ERAD的核心蛋白，延緩甚至阻止了組織細胞ERSIA的發生，從而起到了抗凋亡的作用。研究證實Hrd1與臨床上多種疾病相關。因Hrd1在肺部組織中有表達，其與呼吸系統疾病的關系成為近年來的研究熱點。雖然有大量理論依據和基礎實驗證實Hrd1與肺部疾病關系密切，但是其在臨床的研究有待進一步深入。同時，Hrd1是否也參與肺部其他疾病如哮喘的發生發展有待進一步探討。隨著Hrd1研究的深入，其有望成為呼吸系統相關疾病新的治療靶點。